This video demonstrates a protocol for conducting single-fiber electrophysiological recordings on an in vitro mouse colorectum-nerve preparation.
Cette vidéo montre en détail une seule fibre protocole d'enregistrement électrophysiologique in vitro en utilisant une préparation souris rectum nerf. L'approche permet l'identification et la caractérisation fonctionnelle impartiale des afférences colorectal individuels. Enregistrements extracellulaires des potentiels d'action (PA) à multiplication qui proviennent d'une ou de quelques afférents (par exemple, une seule fibre) champs récepteurs (RFS) dans le rectum sont fabriqués à partir taquiné faisceaux de fibres nerveuses. Le cancer colorectal est retiré avec soit le pelvienne (PN) ou lombaire splanchnique (LSN) nerf attachée et ouvert longitudinalement. Le tissu est placé dans une chambre d'enregistrement, goupillé plat et perfusé avec une solution oxygénée de Krebs. Stimulation électrique focale est utilisé pour localiser les terminaisons afférentes colorectaux, qui sont ensuite testés par trois stimuli mécaniques distinctes (émousser sondage, muqueuse caresser et de se étirer circonférentielle) de classer fonctionnellement les afférences en cinq mechanosensiles classes tifs. Fins répondu à aucune de ces stimuli mécaniques sont classées comme afférences mécaniquement insensibles (SIAM). Les deux mécanosensible et MIAs peuvent être évalués pour la sensibilisation (par exemple en réponse améliorée, seuil réduit, et / ou l'acquisition d'mécanosensibilité) par l'exposition localisée de la RFS aux produits chimiques (par exemple, la soupe inflammatoire (IS), la capsaïcine, l'adénosine triphosphate (ATP)). Nous décrivons l'équipement et la préparation d'enregistrement rectum nerf, la récolte du côlon et du rectum avec PN ci-joint ou LSN, l'identification de la RFS dans le rectum, l'enregistrement mono-fibre à partir de faisceaux nerveux, et l'application localisée de produits chimiques à la RF. En outre, les défis de la préparation et l'application de la stimulation mécanique normalisée sont également discutés.
La douleur et hypersensibilité sont les plaintes prédominantes de patients souffrant de troubles gastro-intestinaux fonctionnels, y compris le syndrome du côlon irritable (IBS), qui existent en l'absence de la cause pathobiologique apparente ou dommages aux tissus. Par exemple, les patients IBS présentent une hypersensibilité, y compris les réponses accrues à rectale distension du ballon et une sensibilité accrue au cours de la fonction intestinale normale, ainsi que l'hypersensibilité de la saisine somatiques (ce est à dire, sensibilité à la palpation de la région abdominale) 1. Parce que le ciblage afférences colorectal se est révélé être efficace pour soulager la douleur et l'hypersensibilité chez les patients IBS (par exemple, l'instillation intra-rectale de 2,3 anesthésiques locaux; ingestion orale de la guanylate cyclase C-agoniste linaclotide 4-6), une meilleure compréhension de la innervation afférente du côlon et du rectum est important.
Afférences viscérales, y compris les afférences colorectal, Sont capables de répondre aux modalités chimiques / en nutriments et thermiques (par exemple, 7-9). Cependant, les afférences viscérales répondant à des stimuli mécaniques (c.-à-afférences mécanosensibles) ont été le plus étudié à fond parce stimuli mécaniques (par exemple, distension luminale, extensibles) sont celles qui donnent généralement lieu à des sensations conscientes, y compris inconfort et la douleur 10-16. En outre, les viscères sont également innervés par les afférences mécaniquement insensibles (SIAM) de, communément appelés nocicepteurs silencieux ou de dormir 17. Dans des conditions physiologiques normales, MIAs ne répondent pas à la stimulation mécanique ou avoir de très haute réponse seuils 18, mais peuvent devenir actifs et se dotent mécanosensibilité dans des conditions physiopathologiques et contribuer à une hypersensibilité.
Utilisation de la préparation et le protocole in vitro décrit ici, nous avons développé et emploie une stratégie de stimulation électrique à la mer RCH pour terminaisons réceptives, permettant l'identification objective des deux terminaisons mécanosensibles et Mia dans le rectum 19. L'innervation colorectal est dérivé de lombaire splanchnique (LSN) et nerf pelvien (PN) les parcours, et comprend afférences colorectal qui peuvent être classés en cinq catégories (mécanosensibles séreuse, muqueuse, musculaire, musculaire-muqueuse, mésentériques) et une classe MIA 20. L'utilisation de cette préparation in vitro, nous avons constaté que MIAs colorectal mécanosensibilité acquise (sensibiliser) après une brève exposition de leurs champs réceptifs à une soupe inflammatoire (IS), qui a sensibilisé 71% des soldats portés disparus dans la voie PN et 23% des soldats portés disparus dans la voie LSN 19. Nous avons également documenté une sensibilisation à long terme (jusqu'à 28 jours) des soldats portés disparus dans le cadre de l'hypersensibilité viscérale comportementale longue durée (ce est à dire, chez les souris recevant des traitements intracoliques avec zymosan 21 ou de l'acide 2,4,6-trinitrobenzène (TNBS) 22) .
jove_content "> Parmi afférences mécanosensibles, afférences musculaires et musculo-muqueuses sont les seules classes qui codent tonique tronçon périphérique du côlon et du rectum (ce est à dire, sont tronçon sensible) et subserve l'encodage des nocive distension colorectale 23,24. L'utilisation d'un contrôlé par ordinateur vigueur actionneur, nous avons appliqué une norme, homogène et reproductible tronçon rampe dans la direction circonférentielle du tissu colorectal aplatie et subdivisés afférences extensibles sensible à seuil bas et seuil haut 23. En outre, le cours du temps de la sensibilisation d'étirement afférences -sensibles après zymosan intracolique 21 ou 22 TNBS traitement correspond à l'apparition, la persistance et / ou le rétablissement de l'hypersensibilité viscérale comportement, suggérant un rôle des afférences colorectal extensibles sensible dans la douleur et l'hypersensibilité viscérale.Le vitro préparation colorectum-nerf décrit ici se est avérée être une approche puissante pour étudier les fonctions de codage neural de afférences colorectal individuels, qui complète bien d'autres approches non-fonctionnels (par exemple, des études cellulaires, moléculaires et histologiques) sur les neurones sensoriels viscérales ( lire l'article 27 pour plus de détails). Mécanismes neuronaux qui contribuent à la nociception et colorectal hypersensibilité à…
The authors have nothing to disclose.
Supported by NIH award R01 DK093525 (GFG). We greatly appreciate the scientific review and grammatical editing of the manuscript by Dr. Amber Shaffer (University of Pittsburgh) and thank Michael Burcham for assistance in preparation of figures.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Leica MZ16 stereo microscope | Leica Microsystems Inc. | ||
Leica IC D camera | Leica Microsystems Inc. | ||
Amplifier | World Precision instruments, Inc. | SYS-DAM80 | Low-noise differential amplifier |
Two-compartment tissue chamber | Custom made | ||
Power1401 | Cambridge Electronic Design Limited | Power1401 | Data acquisition, analog signal input/out |
Spike2 v5.02 | Cambridge Electronic Design Limited | Software package that works with the Power1401 | |
Audio monitor | Natus | Am 8 | |
Square pulse stimulator | Natus | S48 | To deliver electrical stimuli |
Photoelectric isolation unit | Natus | PSIU6 | Stimulus isolation to reduce noise |
Concentric bipolar microelectrode | FHC Inc. | CBFFG75 | To deliver electrical stimuli |
Dual-mode lever system | Aurora Scientific Inc. | Series 300C | To deliver mechanical stimuli |
forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | forceps with fine tips |