Summary

In vitro Caracterización funcional de ratón colorrectal aferente Endings

Published: January 21, 2015
doi:

Summary

This video demonstrates a protocol for conducting single-fiber electrophysiological recordings on an in vitro mouse colorectum-nerve preparation.

Abstract

Este video muestra en detalle una fibra única protocolo de registro electrofisiológico in vitro usando una preparación ratón colon y recto-nervio. El enfoque imparcial permite la identificación y caracterización funcional de los aferentes colorrectales individuales. Grabaciones extracelulares de los potenciales de acción se propagan (AP) que se originan en uno o unos pocos aferente (es decir, de una sola fibra) campos receptivos (FR) en el colon y recto están hechos de fascículos de fibras nerviosas burlado. El colon y recto se retira, ya sea con la pelvis (PN) o esplácnico lumbar (LSN) nervio conectado y abierto longitudinalmente. El tejido se coloca en una cámara de registro, clavado plana y perfundidos con solución de Krebs oxigenada. Estimulación eléctrica focal se utiliza para localizar las terminaciones aferentes colorrectales, que son probados además por tres estímulos mecánicos distintos (embotar sondeo, acariciando la mucosa y estiramiento circunferencial) para clasificar funcionalmente los aferentes en cinco mechanosensiclases tivas. Endings responden a ninguno de estos estímulos mecánicos se clasifican como aferentes mecánicamente insensibles (MIAs). Tanto mechanosensitive y MIAs pueden ser evaluados para la sensibilización (es decir, la respuesta mejorada, umbral reducido, y / o adquisición de mechanosensitivity) por la exposición localizada de RFs a los productos químicos (por ejemplo, sopa inflamatoria (IS), la capsaicina, el trifosfato de adenosina (ATP)). Describimos el equipo y preparación de grabación de colon y recto-nervio, la cosecha de colon y recto con PN adjunto o LSN, la identificación de los FR en el colon y recto, la grabación de una sola fibra de los fascículos nerviosos, y la aplicación localizada de productos químicos para la RF. Además, también se discuten los retos de la preparación y la aplicación de la estimulación mecánica estandarizada.

Introduction

El dolor y la hipersensibilidad son las quejas predominantes de pacientes que sufren de trastornos gastrointestinales funcionales, incluyendo el síndrome del intestino irritable (IBS), que existen en la ausencia de causa patobiológico aparente o daño tisular. Por ejemplo, los pacientes con SII presentan hipersensibilidad, incluyendo las respuestas aumentadas a la distensión rectal globo y aumento de la sensibilidad durante la función normal del intestino, así como hipersensibilidad de referencia somáticas (es decir, sensibilidad a la palpación de la zona abdominal) 1. Debido a la orientación aferentes colorrectal ha demostrado ser eficaz en el alivio de dolor e hipersensibilidad en los pacientes con SII (por ejemplo, la instilación intra-rectal de los anestésicos locales 2,3; ingestión oral de la guanilato ciclasa C agonista linaclotide 4-6), la mejora de la comprensión de la inervación aferente del colon y recto es importante.

Aferentes viscerales aferentes, incluyendo colorrectal, Son capaces de responder a las modalidades químicas / en nutrientes y térmicos (por ejemplo, 7-9). Sin embargo, los aferentes viscerales que responden a estímulos mecánicos (es decir, aferentes mechanosensitive) han sido el más estudiado, porque los estímulos mecánicos (por ejemplo, distensión luminal, estrías) son los que generalmente dan lugar a sensaciones conscientes, incluyendo malestar y dolor 10-16. Además, las vísceras también están inervadas por fibras aferentes mecánicamente insensibles (MIAs), comúnmente denominadas nociceptores silenciosos o para dormir 17. En condiciones fisiológicas normales, MIAs no responden a la estimulación mecánica o tienen muy alta respuesta umbrales de 18, pero pueden llegar a ser activa y adquirir mechanosensitivity en condiciones fisiopatológicas y contribuir a la hipersensibilidad.

Uso de la preparación in vitro y el protocolo descrito aquí, hemos desarrollado y empleamos una estrategia de estímulo eléctrico al mar RCH para terminaciones receptivo, que permitan identificar imparcial de ambas terminaciones mechanosensitive y MIA en el colon y recto 19. La inervación colorrectal se deriva de esplácnico lumbar (LSN) y el nervio pélvico (PN) itinerarios, e incluye los aferentes colorrectal que se pueden clasificar en cinco clases mechanosensitive (serosa, mucosa, muscular, músculo-mucoso, mesentéricos) y una clase MIA 20. Usando esta preparación in vitro, se encontró que MIAs colorrectales mechanosensitivity adquirida (sensibilizar) siguiente breve exposición de sus campos receptivos a una sopa inflamatoria (IS), que sensibiliza 71% de MIAs en la vía de PN y 23% de MIAs en la vía LSN 19. También documentamos sensibilización a largo plazo (hasta 28 días) de los desaparecidos en acción en el contexto de larga duración hipersensibilidad visceral comportamiento (es decir, en los ratones que recibieron tratamientos intracolónicas con zymosan 21 o ácido 2,4,6-trinitrobencenosulfónico (TNBS) 22) .

jove_content "> Entre los aferentes mechanosensitive, aferentes musculares y músculo-mucosas son las únicas clases que tónicamente codifican tramo circunferencial del colon y recto (es decir, son sensibles al estiramiento) y estar al servicio de la codificación de la distensión colorrectal nociva 23,24. El uso de un controlado por ordenador la fuerza del actuador, se aplicó un estándar, homogéneo, y el estiramiento en rampa reproducible en la dirección circunferencial del tejido colorrectal aplanada y clasifican además aferentes sensibles al estiramiento como de bajo umbral y de alto umbral 23. Además, el curso temporal de la sensibilización de estiramiento aferentes -sensibles después zimosan intracolónica 21 o 22 TNBS tratamiento corresponde a la aparición, persistencia y / o recuperación de la hipersensibilidad visceral de comportamiento, lo que sugiere un papel de los aferentes colorrectales sensibles al estiramiento en el dolor visceral e hipersensibilidad.

Protocol

NOTA: Este protocolo fue revisado y aprobado por la Universidad de Pittsburgh Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comisión. 1. Preparación de la solución de Krebs modificada y Prueba de la Droga alícuotas Hacer 6 L de solución de Krebs modificada que contiene (en mM): NaCl 117,9, KCl 4,7, 25 NaHCO 3, 1,3 NaH 2 PO 4, 1.2 MgSO 4, 2.5 CaCl 2, 11,1 D-glucosa, butirato de 2 de sodio, acetato de sodio 20 , 0.004 nifed…

Representative Results

La configuración se ilustra en la Figura 1. Incluye una cámara de tejido a medida que alberga el colon y recto en un baño de silicona compartimento forrado y el nervio adjunto en un compartimento lleno de aceite mineral contigua. La cámara de dos compartimentos fue a máquina de un bloque sólido de plástico acrílico por una máquina de CNC; la parte inferior de ambos compartimentos fue posteriormente revestido con silicona firme para permitir una fácil pin abajo del tejido colorrectal. AP extrac…

Discussion

El vitro preparación colon y recto-nervio en descrito aquí ha demostrado ser un poderoso enfoque para estudiar las funciones de codificación neural de aferentes colorrectales individuales, que complementa muy bien con otros métodos no funcionales (por ejemplo, estudios celulares, moleculares e histológicos) sobre las neuronas sensoriales viscerales ( ver el comentario 27 para más detalles). Mecanismos neuronales que contribuyen a la nocicepción y la hipersensibilidad colorrec…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Supported by NIH award R01 DK093525 (GFG). We greatly appreciate the scientific review and grammatical editing of the manuscript by Dr. Amber Shaffer (University of Pittsburgh) and thank Michael Burcham for assistance in preparation of figures.

Materials

Name of Material/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
Leica MZ16 stereo microscope  Leica Microsystems Inc.
Leica IC D camera Leica Microsystems Inc.
Amplifier World Precision instruments, Inc. SYS-DAM80  Low-noise differential amplifier
Two-compartment tissue chamber Custom made
Power1401 Cambridge Electronic Design Limited Power1401 Data acquisition, analog signal input/out
Spike2 v5.02 Cambridge Electronic Design Limited Software package that works with the Power1401
Audio monitor Natus Am 8
Square pulse stimulator Natus S48 To deliver electrical stimuli
Photoelectric isolation unit Natus PSIU6 Stimulus isolation to reduce noise
Concentric bipolar microelectrode FHC Inc. CBFFG75 To deliver electrical stimuli
Dual-mode lever system Aurora Scientific Inc. Series 300C  To deliver mechanical stimuli
forceps Fine Science Tools 11252-00 forceps with fine tips

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Feng, B., Gebhart, G. In vitro Functional Characterization of Mouse Colorectal Afferent Endings. J. Vis. Exp. (95), e52310, doi:10.3791/52310 (2015).

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