Introduction
En ependymale cellemonolag linjer den ventrikulære system i hjernen leverer tovejs barriere og transport funktioner mellem den cerebrale spinalvæske (CSF) og interstitiel væske (ISF) 1-3. Disse funktioner bidrager til at holde hjernen giftstof-fri og i fysiologiske balance 2,3. Hos mennesker tab af dele af denne foring gennem skade eller sygdom synes ikke at resultere i regenerativ erstatning som fundet i andre epiteliale foringer; snarere tab af ependymale celle dækning ser ud til at resultere i periventricular astrogliose med en meshwork af astrocytter, der dækker regioner blottede af ependymceller på ventrikel overflade. Alvorlige konsekvenser til vigtige mekanismer CSF / ISF udveksling og clearance ville forudsiges at medføre tab af denne epitel lag 1,2,4-7.
Et fælles træk ved menneskets aldring forstørres laterale ventrikler (ventriculomegaly) og tilhørende periventricular ødem som observed med MRI og fluid-svækkede inversion recovery MRI (MRI / FLAIR) 8-14. At undersøge forholdet mellem ventriculomegaly og den cellulære organisering af ventriklen foring blev postmortem human MRI-sekvenser matchet med histologiske præparater af laterale ventrikel periventrikulær væv. I tilfælde af ventriculomegaly, havde betydelige områder af gliose erstattet ependymale celle dækning langs den laterale ventrikel væg. Når ventrikel ekspansion ikke blev registreret af MRI-baserede volumen analyse ependymale celle foring var intakt og gliose blev ikke påvist langs ventrikel foring 6. Denne kombinatorisk tilgang repræsenterer de første omfattende dokumentation beskriver ændringer i cellulær integritet af den laterale ventrikel foring hjælp wholemount præparater af dele eller hele laterale ventrikel væg og 3D modellering af ventrikel bind 6. Adskillige sygdomme (Alzheimers sygdom, skizofreni) og skader (traumatisk hjerneskade)vise ventriculomegaly som en tidlig neuropatologiske funktion. Blotlægning af områder af ependymale celle foring derved kunne forudsiges forstyrrer den normale ependymale cellefunktion og kompromittere den homeostatiske balance mellem CSF / ISF væske og opløst stof udveksling. Således vil en mere grundig undersøgelse af ændringer i det ventrikulære system, dens cellulære sammensætning, og konsekvensen for underliggende eller ligger hjernens strukturer i sidste ende begynder at afsløre mere om neuropatologi forbundet med ventrikel udvidelsen.
Manglen på multimodale billeddata, særlig langsgående datasekvenser sammen med begrænset adgang til tilsvarende histologiske vævsprøver gør analyse af menneskelige hjerne patologier vanskelig. Modellering fænotyper findes i menneskets aldring eller sygdom kan ofte opnås med musemodeller og dyremodeller blevet en af vores bedste midler til at undersøge spørgsmål om human sygdom initiering og progression. Flere undersøgelser iraske unge mus har beskrevet cytoarchitecture af den laterale ventrikel vægge og den underliggende stamcelle niche 4,7-15. Disse undersøgelser er blevet udvidet til at omfatte 3D-modellering og cellulær analyse af ventrikel vægge gennem aldring 6,15. Hverken periventricular gliose eller ventriculomegaly observeres i ældre mus, snarere mus vise en forholdsvis robust subventicular zone (SVZ) stamcelle niche underliggende til en intakt ependymale celle foring 6,15. Således eksisterer slående artsspecifikke forskelle i både generel vedligeholdelse og integritet af den laterale ventrikel foring under processen med aldring 6,15. Derfor, for at bedst mulig brug mus at afhøre betingelser findes i mennesker, der skal karakteriseres og hensigtsmæssigt overvejes i enhver modellering paradigme forskelle mellem de to arter. Her præsenteres til vurdering langsgående ændringer i de laterale ventrikler og tilknyttet periventricular væv hos både mennesker og mOuse. Vores procedurer omfatter 3D rendering og volumetrisk af både mus og menneskelige ventrikler, og brug af immunhistokemisk analyse af hele mount præparater af periventricular væv til at karakterisere både cellulær organisation og struktur. Tilsammen disse procedurer giver et middel til at karakterisere ændringer i ventrikulære system og tilhørende periventricular væv.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Animal procedurer blev godkendt af University of Connecticut IACUC og i overensstemmelse med NIH retningslinjer. Humant væv og dataanalyse og procedurer var i overensstemmelse med og godkendt af University of Connecticut IRB og i overensstemmelse med NIH retningslinjer.
1. Mouse: Analyse af Periventricular Cellular Integritet og 3D-modellering af den laterale ventrikel
1.1) Fremstilling af Mouse laterale ventrikel Wall hele underlag
- Forbered mus laterale ventrikel hele underlag for immunhistokemi (IHC) som tidligere beskrevet 16,17.
1.2) Immunhistokemi for laterale ventrikel Analyse
- Fix og § mus hjernevæv som tidligere beskrevet 18,19.
- Kort beskrevet flush mus transcardialt med normal, stuetemperatur saltvand, indtil organer har ryddet (angivet med en bleg farvning), efterfulgt af stuetemperatur 4% paraformaldehyd(PFA) i 0,1 M phosphatbufret saltvand (PBS), indtil vævet er afstivet.
- Fjern hjerne fra kraniet. Brug iris dissektion saks til at klippe fra bunden af kraniet langs sagittale sutur.
- Expose kraniet og fjern hjerne med pincet. Fordybe hjernen i 4% PFA fiksativ natten over ved 4 ° C. Derefter vaskes 3 gange i 20 minutter med PBS.
- Forbered serielle sektioner for immunhistokemi og volumen analyse.
- Ved hjælp af en mikrokirurgisk skalpel, lave et lille snit på langs af cortex af den venstre hemisfære at muliggøre identifikation af den venstre hemisfære fra højre hemisfære når flydende sektioner immunfarvet.
- Omslutter faste hjerner i 3% agarose for ekstra strukturel støtte under vibratome sektionering. Varm 3% agarose i destilleret vand (vægt / volumen) indtil fuldstændig opløsning under anvendelse af enten en mikrobølgeovn eller varmeplade.
- Med et barberblad, fjern caudale del af hjernen ved lillehjernen med enkoronale snit, efterlader en flad og jævn overflade. Påfør superlim til vævet scenen og placere hjernen på den nyligt skåret overflade med de olfaktoriske pærer opad.
- Når flydende agarose opløsningen er afkølet til en temperatur lige varm at røre ved, anvende jævnt over hjernen til helt omslutte hele hjernen. Tillad agarose at størkne.
- Sektion agarose indkapslet hjerner coronalt på en vibratom i 50 um snit, med sektioner anbragt serielt i en plade med 24 brønde indeholdende PBS for at bevare rækkefølge.
BEMÆRK: Generelt 12 brønde anvendes til én hjerne, med opsamling af væv begynder 5 sektioner forud for at se fremkomsten af de laterale ventrikler begynder med godt A1, flytte numerisk igennem til B6 og cykle tilbage til A1. Dette tillader flere skelnelige sektioner fra den samme hjerne at blive behandlet inden for den samme brønd. For laterale ventrikel volumen analyse, ophørte væv samling, når den laterale ventrikels og tredje ventrikel fusionere, hvilket resulterer i cirka 3 sektioner per brønd eller 36 sektioner i alt. - Aspirere PBS ved hjælp af en overførsel pipette fastgjort med en 20-200 pi mikropipette tip til at sikre, at flydende sektioner ikke uheld aspireres. Blok og permeabiliserer flydende sektioner i 10% serum, 0,1% Triton X-100 (TX) i PBS (PBS-TX) i 1 time ved stuetemperatur. Anvende 300 pi opløsning per brønd til dækning fritflydende vævssnit i en 24-brønds plade og udføre alle inkubationer af sektioner på en vippende plade.
- Aspirere den blokerende opløsning og inkuber sektioner med primære antistoffer i PBS-TX natten over (mindst 12 timer) ved 4 ° C. For ventrikel volumen spor ved hjælp koronale sektioner, bruge anti-S100β antistof til at mærke ependymceller.
- Aspirer primært antistof løsning, og vask §§ 3 gange i 10 min hver med PBS-TX.
- Inkuber sektioner i mørke i 1 time ved room temperaTURE med fluorescerende sekundære antistoffer, i koncentrationer på 1: 1.000 i 10% serum, PBS-TX. Hold sektioner i mørke i alle resterende inkubationstrin.
- Aspirer sekundært antistof opløsning og inkuber sektioner med 4 ', 6-diamidino-2-phenylindol i PBS (DAPI, 10 ug / ml) i 5 min til kontrastfarve cellekerner. Sug DAPI løsning og skyl §§ 3 gange i 10 min hver med PBS.
- Mount sektioner serielt onto dias ved hjælp af den kortikale mærke at bevare venstre versus højre hjernehalvdel orientering. Luft tørre sektioner i mørke og derefter dækglas ved at anvende et tyndt lag af monteringsmedium til objektglasset og anbring forsigtigt et dækglas på toppen. Tillad dækglas objektglassene tørre natten over ved stuetemperatur.
1.3) Lateral ventrikel Segmentering til 3D Rekonstruktioner
BEMÆRK: Udfør sporing af laterale ventrikler hjælp mapping software på en opretstående epifluorescens microscope med et automatiseret stadium og en digital CCD-kamera til fluorescens detektion.
- Tænd for fluorescens mikroskop udstyr og lancere mapping software i fluorescens mode. Åbn 'Display Options "for at indlæse de rigtige værktøjslinjer og docking værktøj paneler er nødvendige for at spore. Valg> Skærmindstillinger> Tilbehør, og vælg "Main" og "markeringer" værktøjslinjer. I den samme menu, vælg 'Camera Histogram «,» Multichannel Kontrol', 'kameraindstillinger «og» Image Acquisition' under 'Docking Tool Panels. «
- Overhold begyndelse af hjertekamrene baseret på stærke S-100β fluorescens som mærker ependymceller denne linje den laterale ventrikel. Identificere det første stykke af væv, der indeholder de laterale ventrikler.
- Opret en ny datafil og udpege et referencepunkt for trin bevægelse ved at klikke i billedet vindue over den venstre laterale ventrikel. Se efter de småsnit til at orientere venstre fra højre hjernehalvdel. Hold referencepunktet på en konsekvent placering i forhold til de laterale ventrikler tværs spore filer til at hjælpe, når du importerer konturer for seriel genopbygning.
- Vælg passende forudindstillede kontur type fra konturen rullemenuen, fx 'Venstre Lateral ventrikel. « Brug en unik farve for hver af de venstre og højre laterale ventrikel tracings. Hvis ændringer i kontur navn og farve er påkrævet, skal du gå til Valg> Display Indstillinger> Konturer, derefter ændre navnene på de kontur farver eller vælg 'Tilføj Contour Type'.
- Med "Venstre Lateral ventrikel 'kontur valgt, skal du klikke langs apikale overflade ependymale foring for at begynde spor kontur. Trace ventriklen ved fortsat at klikke successivt langs apikale overflade.
- For uregelmæssige områder, der kræver mere finesse, klik og hold venstre museknap for at spore frie hånd. Tryk på Ctrl + Z, eller gå to Valg> Fortryd for at fortryde det forrige kontur punkt. Flyt opsporing vinduet ved hjælp af piletasterne eller ved at lave en kontur pege off screen og lade vinduet til automatisk centrere sig selv. For at afslutte ventriklen opsporing højreklik og vælg 'Close Contour ".
- Vælg en ny kontur farve (kontur type) for retten laterale ventrikel ved hjælp af rullemenuen. Trace højre hjertekammer som i trin 1.3.4 til venstre.
- Hvis ændringer i kontur navn og farve er påkrævet, skal du højreklikke på konturen og vælg Skift Contour Type for at vælge den rigtige farve.
- Tilføj markører langs midterlinjen for at hjælpe med at tilpasse serielle konturer for 3D-rekonstruktion. For at tilføje markører, vælge den relevante markør (brug 'X') fra Markers værktøjslinjen til venstre og klik for at slippe dem på sporing skærmen. Import markører sammen med konturerne for hvert vævssnit spor.
- Hvis du vil gemme væv spor, skal du vælge Filer> GemDatafil Som og oprette en ny mappe og filnavn. Nummer de tracings [slide #] - [væv #] for nem identifikation af spor fra serielle sektioner. For eksempel er den tredje vævssnit på anden slide har filnavnet '2-3' i indekset for hver hjerne.
- Gentag trin 1.3.4 til 1.3.9 for hver seriel sektion af hjernevæv at spore hjertekamrene gennem hele hjernen, undtagen regioner af ventrikel væg vedhæftning.
- Hvis ventriklen har et område af friktion, sub-segment den forreste region fra dem dorsale og ventrale til vedhæftning site. Opret to nye kontur former for hver ventrikel (f.eks 'Dorsal Venstre ventrikel "og" ventrale Venstre ventrikel). På den første væv skive med vedhæftning, spore den laterale ventrikel med både den originale laterale ventrikel kontur og den nye dorsale og ventrale konturer til at sikre kan oprettes et komplet ventrikel genopbygning.
- I afsnit posteriort for en ventricle væg vedhæftning, skal du oprette et sæt nye kontur farver til den bageste del af hver ventrikel (f.eks 'Posterior Venstre ventrikel). Dobbeltklik spore denne første re-tiltrådte sektion med både den nuværende vedhæftning og nye bageste kontur typer.
1.4) Lateral ventrikel 3D Genopbygning
- Juster og kompilere serielle kontur tracings med musen laterale ventrikler at generere 3D-rekonstruktioner og volumetriske data.
- Åben 3D genopbygningsprogram. Klik på Filer> Åbn, og vælg den kontur-filen for den første spores serielle sektion. Importere kontur tracings i venstre og højre ventrikel samt eventuelle tilføjede markører.
- For at vælge konturer ved at klikke på 'Vælg objekter' knappen (cursor ikon) og vælg de to hjertekamre og markører ved at holde "Ctrl". At etablere Z position konturerne, højreklik og vælg 'Ændr Z position «. Indstille den første vævssnit til 0 um. <li> Hvis du vil gemme genopbygning, vælge Filer> Gem datafil som. Gem efter hver fil import, så hvis en fejl er foretaget opsving er så let som re-indlæse den forrige fil.
- For at tilføje den næste væv skive til genopbygningen, klikke på Filer> Føj til Display. Vælg den .DAT fil, der skal vedhæftes, og tjek den "Flet" kassen.
- Følg trin 1.4.3 til igen justere Z-position af den nyligt indførte trace-fil. Vælg kun de nyligt tilføjede venstre og højre konturer i hovedvinduet for at undgå at flytte de andre spor. Indstil hver successiv sporingsfil til 50 um fra Z-positionen af den tidligere kontur i 50 um snit. (Første kontur: z = 0, anden kontur: z = 50, tredje kontur: z = 100 mm)
- For at justere X, Y-position af udvalgte konturer og markører, skal du klikke på 'Aktiver oversættelse med mus' knappen og træk konturerne at tilpasse med de tidligere væv konturer. Holde både venstre og højre konturerne af det nuværende spor valgtat tillade synkron bevægelse.
- Hvis du vil rotere spor med eller mod uret for at line op midterlinjen markører, skal du vælge 'Z-aksen Rotation' knappen. At vende konturer hele Y-aksen (hvis venstre kontur er til højre) skal du vælge både importerede konturer og markører, højreklik, vælg 'Sæt Rotation Angle ", og indtast' 180 'i den" Y rotation ".
- Sørg for, at hjertekamrene og midterlinjen markører er bedst justeret før du gemmer genopbygningen fil, som i Trin 1.4.4.
- Gentag trin 1.4.5 til 1.4.9 for hver efterfølgende væv skive, indtil alle er blevet importeret og korrekt justeret.
- For at se volumen data for den serielle genopbygning, klik Analyse> 'Markers og Region Analysis' og vælg '3D Contour Summary'. Vælg alle konturer i venstre panel, og klik derefter på knappen "3D Visualisering 'for at vise den endelige 3D-rekonstruktion.
2. Menneskelig: Analyse af Periventricular Cellular Integritet og 3D-modellering af den laterale ventrikel
2.1) Humant MRI Dataanalyse
BEMÆRK: Protokoller er opført for at skabe 3D-billede rekonstruktioner og volumetrisk kvantificering af de laterale ventrikler og vurdere volumetriske ændringer over tid ved hjælp af langsgående overlay analyse. Det er vigtigt at bemærke, at konsistens i MR dataindsamling (fx maskine og magnet styrke, afsnit tykkelse, orientering og opløsning) og post-erhvervelse behandling er ekstremt vigtige kriterier for optagelse af datasæt 20.
- Ventrikulær Segmentering
BEMÆRK: ITK / Snap bruges til at segmentere hjertekamrene fra høj opløsning T1-vægtede MR-billeder. Alternativt kan andre freeware software som Freesurfer anvendes.- Åbent ITK / Snap, Filer> Åbn gråtonebillede. Vælg den ønskede fil og åben som en .nii fil (NITFI fil).
- Rul gennem hvert anatomical fly, bemærke ventrikulære abnormiteter (forsnævrede regioner, store eller små tidsmæssige horn, etc.). I Main Toolbox klik på 'Snake ROI Tool ". Klik på 'Segment 3D «. Vælg "Intensity Region 'muligheden.
- Klik på 'Forbehandl Billede'. Vælg 'Over', til også at omfatte områder under en vis intensitet tærskel for at fremhæve ROI i hvidt. Optage maksimal intensitet ved hjælp af glidende bar. Indstil tærsklen til 15% af maksimal intensitet (record denne værdi). Sæt glathed parameter til 10. Klik på 'OK', derefter på 'Næste'.
- Tilføje 10-12 små (størrelse 2) "bobler" til hver ventrikel: to i den forreste frontale horn, syv jævnt fordelte langs den øvre overflade af den laterale ventrikel krop, en i occipital horn og en i den tidsmæssige horn laterale ventrikel. 'Vælg Parametre «og sæt krumning kraft til 0,4. Klik på Afspil Symbol at begynde aktivt kontur evolution.
- Klik på 'Opdater Mesh "for at visualisere overfladen; tjek 'Auto-opdatering ". Stop segmentering når alle områder af den laterale ventrikel indgår i området af interesse (ROI). Undgå optagelse af det tredje ventrikel. Klik på 'Afslut'.
- Redigere billedet manuelt om nødvendigt for at fjerne uønskede områder ved følgende metoder (typisk brug for at slette tredje ventrikel lækage). Brug manuelt "3D Skalpel" værktøj til at fjerne overskydende regioner eller manuelt bruge 'Paintbrush "værktøj" Clear Label «som den aktive tegning label at slette optagelse uden investeringsafkast.
- Spar segmentering resultater som en .nii billede ('NIFTI' filformat).
- For at opnå total ventrikel volumen, vælge 'Segmentering> Volume "og statistik; opnå den samlede volumen af ventriklen hjælp indstillede farve etiket.
- Langsgående repræsentation af laterale ventrikler Fra MRIScans
BEMÆRK: Brug afMango software, langsgående ROIs overlejret til kvalitativt og kvantitativt vise ændringer i ventrikel volumen inden for emner over tid.- Open Mango. Klik på Filer> Indlæs ROI af den første ROI tidspunkt (baseline) som GRØN. Filer> Indlæs ROI af den anden ROI tidspunkt som RØD. Spar langsgående overlay ved at vælge Filer> Gem som; tildele hvert billede som "file name_ [første tidspunkt alder] - [andet tidspunkt alder] .nii '.
- Åbn ITK-SNAP. Genåbne den kombinerede ROI som "gråtoner billede 'ved at vælge Segmentering> Load From Image> kombineret ROI-fil. For at opnå langsgående volumen data køre følgende: Segmentering> Volume og statistik> Label 1 (rød) = ekspansionsvolumen; Label 2 (grøn) = stenose volumen; Label 3 (blå) = bund volumen.
2.2) Humant Periventricular Tissue Forberedelse og analyse
- Sikkerhedsanvisninger for arbejde med humant væv
- Opnå appropriate sikkerhedsuddannelse (f.eks., Blood patogener kursus).
- Overhold standard (universelle) sikkerhedsforanstaltninger. Brug handsker. Skift handsker, før du rører nogen fælles udstyr eller overflader, der ikke er til engangsbrug. Label nogen produkter rutinemæssigt håndteres, når man arbejder med humant væv med "human brug væv 'betegnelser.
- Følg dekontaminering praksis for alle elementer i kontakt humant væv. Blege alt forurenet væsker i mindst 24 timer forud for bortskaffelse, behandle kontaminerede overflader med en blegemiddel gennemblødt håndklæde (f.eks bænk top), eller ved at placere objektet direkte i blegemiddel (f.eks tang).
- Forbered beredskabsplan til kontakt med humant væv direkte på huden, som kan omfatte iblødsætning et papir håndklæde i blegemiddel og holde på det berørte område (5-10 min).
- Brug passende affaldsbeholer for alle elementer, der kommer i kontakt med humant væv.
- Lateral ventrikel Whole Mount Forberedelse
- Beginning med intakt halvkugle (fikseret i 10% formalin og skyllet grundigt med 0,1 M PBS), slice 1,5 cm tykke koronale snit gennem hele halvkugle benytter store kniv.
BEMÆRK: Alle fiksering protokoller kræver verifikation forudgående antistof. - Label sektioner til bag startende med første sektion indeholder den laterale ventrikel. Brug en alfanumerisk mærkningsordning, mærkning skiverne med bogstaver (anterior til posterior), og underafsnit med tal (top down). Undgå at forstyrre ependymale overflade.
- Ved hjælp microsurgical skalpel, dissekere ventrikel væg 1 cm dybe, vedligeholdelse en kontinuerlig sektion for hele sidevæg. Underinddele væg efter behov for at skabe passende størrelse sektioner til farvning godt. Notch afsnit på modsatte side af ventrikel væg til at identificere overlegen / ringere orientering.
- Udføre antigengenfinding ved inkubering vævssnit i 10 mM natriumcitrat (pH 6,0) ved 100 ° C i 10-20 min ved anvendelse af en dobbelt boiler (optimal inkubationstid bestemmes empirisk). Skyl 3 gange i PBS / 0,1% Triton X-100 (PBS-TX).
- Block i 10% hesteserum under anvendelse af PBS / PBS-TX i 1 time ved stuetemperatur.
- Inkuber med primære antistoffer i 48 timer ved 4 ° C. At visualisere ventrikel vægbeklædning, immunofarvningsprocedure hele underlag med følgende antistof-kombinationer: muse-anti-β-catenin (1: 250); gede-anti-GFAP (1: 250); kanin-anti-AQP4 (1: 400).
- Udfør alle efterfølgende trin i mørke. Skyl vævet 3 gange i PBS, inkuberes med sekundære antistoffer (1: 500) i 24 timer ved 4 ° C eller 2 timer ved stuetemperatur, og skyl yderligere 3 gange i PBS. Inkuber væv i DAPI i 7 min ved stuetemperatur efterfulgt med en anden 3 skylninger i PBS.
- Forbered væv til endelig dissektion ved at dække en voks bund skål med parafilm. Fyld fad med PBS, placere væv i fad hjælp fine pincet, undgå at komme i kontakt med ependymale væg.
- Under dissektionsmikroskop, fast Secure væv på sin side ved hjælp af ben. Med en 22,5 ° microsurgical stikke kniv, skabe ensartede tynde sektioner (ca. 300 um tyk) af lateral ventrikel væg. For store dele eller sektioner med vanskelige krumning, skæres i mindre terninger, før skære i afsluttende afsnit for montering og note placering.
- Anbring forsigtigt dissekeret sektion ependym side op på dias ved hjælp fine pincet, der noterer sig den regionale placering og orientering på diaset. Dæk væv med tyndt lag af aquapolymount, idet man undgår bobler. Placer dækglasset af vævet, tilføje yderligere aquapolymount som nødvendigt for at udfylde eventuelle huller under dækglasset.
- Placer monterede sektioner i mørkt og tørt i 2-3 dage ved stuetemperatur. Opbevares i slidebox ved 4 ° C.
- Beginning med intakt halvkugle (fikseret i 10% formalin og skyllet grundigt med 0,1 M PBS), slice 1,5 cm tykke koronale snit gennem hele halvkugle benytter store kniv.
- Immunhistokemi og Histologisk analyse
- Anvendelse af konfokal mikroskopi for at se fluorescerende immunhistokemi, indstille billeddannelse brændplanet ved ventriklen overflade, som bestemt ved anvendelse of β-catenin (markør for apikale adherens junction proteiner af ependymceller). Afgrænse områder af ependymale celle dækning og overfladen astrogliose (GFAP farvning ved ventrikel overflade).
- At dokumentere og Montage hele ventrikel overfladen, brug overlappende billeder, til at dække hele overfladen. At skabe montage af serielle billeder, åbne Adobe Photoshop. Brug Filer> Automatiser> Photomerge> Interaktiv layout til at vælge billeder til overlay, hvilket gør manuelle justeringer om nødvendigt.
- Opret nyt lag at spore montage at generere tegneserie repræsentation af intakt ependym celle dækning eller ventrikel overflade gliose. Gentag for hvert dias eller investeringsafkast. Kompilere alle sektioner at rekonstruere kort over ventrikel væg og link til tilsvarende region på MRI genopbygning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Contour sporing af musen laterale ventrikler baseret på immunofarvede 50 um koronale sektioner og 3D rekonstruktioner (figur 3) gør det muligt volumen data, der skal indsamles i forskellige eksperimentelle paradigmer bruger musen som model for sygdom eller skade. Afgørende for denne procedure er udelukkelsen af regioner, hvor den laterale ventrikel vægge overholder hinanden. Ved subsegmenting regioner af hjertekamrene og udpegning en anden farve for hver region (figur 3C), kan tilstødende sektioner overholdes og regional og samlede volumen kan beregnes ud fra kompilerede delsegmenter.
Lignende undersøgelser kan udføres under anvendelse af MRI-scanninger af hjernen sammen med halvautomatisk segmentering (ITK-SNAP), i de laterale ventrikler for 3D-gengivelser. Til direkte parring af ventrikel volumen og periventricular væv analyse før eller efter slagtning MRI scanninger er segmenteret og tilpasset til at skabe 3D rekonstruktioner (
Figur 1: Udførelse lateral ventrikel segmentering ved hjælp af ITK / Snap Snake ROI Tool (A) "Bubbles 'er tilføjet til laterale ventrikler. (B) "Bubbles" ekspandere under aktiv kontur evolution. (C) Segmentering er afsluttet, når hele laterale ventrikel er fyldt. (Der sørges for at undgå den 3. ventrikel.)
Figur 2: Humant laterale ventrikel væg dissektion (
Figur 3: Sporing og 3D rekonstruktion af mus laterale ventrikler (A koronal musehjerne sektion inklusive laterale ventrikler, skitseret af S100β-immunoreaktive ependymceller (*, ventriklerne Lateral, beslag, region adhe. nen; Målestokken, 500 um). (B) Mouse laterale ventrikler spores som "konturer" og indrettet, sub-segmenteret sektioner, eksklusive områder af intraventrikulær vedhæftning forstyrre volumetrisk analyse. (C) 3D rekonstruktion af laterale ventrikel konturer. Gul, kontur af hele hjernen volumen spænder over området af interesse indeholdende de laterale ventrikler.
Figur 4: MRI-baserede laterale ventrikel segmentering (A) MR-billeder er samlet. (B) ventrikel Lateral defineres som ROI (rød). (C) 3D-billede rekonstruktion muliggør volumetrisk kvantificering og kvalitativ visualisering af laterale ventrikel.
annonce / 52328 / 52328fig5highres.jpg "/>
Figur 5: Vurdering af langsgående ventrikel ekspansion Longitudinal MRIs fra flere punkter kan justeres og overlejret at visualisere og kvantificere ventrikel volumen ekspansion inden for emner over tid.
Figur 6: Immunohistokemisk evaluering og regional kortlægning af humant laterale ventrikel overflade (A) Områder i intakte ependym celler, skitseret af β-catenin-farvning, viser en brosten udseende (asterisk) og er afgrænset af en stiplet linje fra regioner af astrogliose på ventrikel overflade (GFAP + farvning). (B) Serial konfokale billeder overlejret at generere en regional montage og spores ved hjælp af Adobe Photoshop til en tegneserie repræsentation af cellulær organisation på ventriklen overflade. (C) Cartoon afbillede montage er kortlagt til ventrikel overflade på tilsvarende MRI baseret 3D ventrikel genopbygning. (Målestok (A), 40 um, Scale bar (B), 1 mm)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi præsenterer værktøjer og protokoller, der kan anvendes til at evaluere integriteten af hjernens ventrikulære system i mus og i mennesker. Disse værktøjer kan imidlertid også anvendes på andre hjernestrukturer eller organsystemer, som undergår ændringer som følge af skade, sygdom eller under processen med aldring 14,21,22. Strategierne præsenteret drage fordel af software, der gør det muligt at tilpasningen af tværsnits- og langsgående MRI-sekvenser til at generere 3D volumen repræsentationer af specifikke regioner eller strukturer af interesse. Longitudinal MRI-sekvenser tillader indsamling af 3D volumen forandringer, der sker over tid og kan udvides til også at omfatte total hjerne volumen, for lateral ventrikel til den samlede hjerne volumen nøgletal, og / eller andre hjernens strukturer (f.eks subthalamisk nucleus 23 eller hjernebjælken hvid substans skrifter anvendelse af diffusion-vægtet tensor imaging). Sammen kan en omfattende analyse af hjernens strukturelle ændringer skal udføres. I sidste ende,at evaluere aldersrelaterede og sygdomsrelaterede ændringer hjernens strukturer en samling af multimodale billeddiagnostiske teknikker er nødvendige for at give den mest præcise billede af hjernens sundhedstilstand 24. Dokumentation og udarbejdelse af kritiske strukturelle data, sammen med emne-variation og vifte af variation på tværs af fag, kunne ideelt set bruges til at generere ultra-høje felt MRI atlas til bedste guide klinisk diagnose af væv i sundhed eller sygdom.
Flere kritiske trin er vigtigt at bemærke, for at reducere erhvervelse og behandling variabilitet mellem og inden underlagt datasæt. Ideelt til at opnå matchede datasekvenser bør den samme MRI scanneren og sekvens typen anvendes i hele undersøgelsen. Postmortem hjernevæv ofte er af varierende kvalitet; kritiske faktorer såsom dødsårsagen, den postmortem interval, kvaliteten af perfusion, og længden af tid i fiksativ alle kan påvirke farvning effektivitet og behovet for enantigengenfinding protokol. Hertil kommer, at størrelsen af den menneskelige hjerne kræver multiple skive sektioner med hver skive kræver yderligere manipulation for at opnå væv, der indeholder de regioner af interesse. Derfor er det kritisk, at placeringen og orienteringen af hver sektion er tydeligt mærket og registreret. I sidste ende, det primære problem med postmortem vævsanalyse er netop det - det er obduktion - og giver derfor kun et øjebliksbillede af vævet ved slutningen af livet. Forbedrede multimodale billeddiagnostiske teknikker er nødvendig for real-time analyse af ændringer i hjernens struktur og morfo-funktionelle oplysninger med cellulære opløsning.
Undersøgelser Mouse tillader afhøring af den menneskelige tilstand variabel ved variabel og ikke udgør mange af de problemer, der findes, når man arbejder med humant væv. Mus undersøgelser bruges til at modellere menneskelig sygdom eller skade gennem analyse af kausale strukturelle dynamik kan tilbyde forbedringer for sygdomsfri model validation. Imidlertid bør artsspecifikke forskelle bemærkes. I vores analyse af de laterale ventrikler, er det vigtigt at bemærke, at mus bevarer en aktiv stamcelle niche langs den laterale væg af de laterale ventrikler og stamcelle-medieret regenerativ reparation af ventriklen foring forekommer i tilfælde af beskeden ependymale celletab, som findes i ældre mus eller når begrænset ependymale celle blotlægning sker ved eksponering af ependym at neuraminidase 19. I modsætning hertil mennesker ikke opretholde en robust stamcelle niche langs den laterale ventrikel vægge 25-27 og lidt, om nogen, regenerering er sandsynlig. I modsætning til ældre mus, alderen mennesker viser omfattende astrogliose ved ventriklen overflade forbundet med ventrikel ekspansion 6. Dette niveau af blotlægning og "ardannelse" af ventrikel foring kan modelleres i mus ved hjælp af neuraminidase at denude hjertekammer foring af ependymceller 6,28. Desuden er det vigtigt at erkende thved vivarium vedligeholdte mus ikke oplever infektioner, sygdom eller traumer, præsentere en meget anderledes sygehistorie fra de fleste forsøgspersoner. Endvidere mus typisk viser ikke aldersbetinget neurodegenerativ sygdom, ventriculomegaly eller periventrikulær gliose. Derfor, for at overholde disse fænotyper de skal modelleres. I sidste ende, kan ingen dyremodel fuldt rekapitulere den ontogeni, patofysiologi, og symptomatisk kompleksitet sygdom hos mennesker og disse begrænsninger har brug for at blive anerkendt og ordentligt kommunikeres.
Sammenfattende præsenterer vi teknikker og protokoller til at vurdere laterale ventrikel mængder i mus og menneske. Ventrikler kan gengives i 3D og langsgående analyse muliggør samling af spatiotemporale volumenændringer. Derudover, ved anvendelse af parrede hjernevæv vi vise, hvordan cellulære funktioner kan være forbundet med ændringer i ventrikel mængder. Nylige resultater, der demonstrerer forøgede niveauer af Aquaporin-4 ekspression i områder af periventricular gliose tyder ødem langs ventriklen overflade. Derfor fremtidige undersøgelser parring FLAIR-MRI med væv histologi vil forbedre vores forståelse af CSF og interstitiel væske udveksling, og give vigtige oplysninger om ventrikel-system sundhed og hvordan dens forringelse påvirker forskellige hjernefunktioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Life Technologies | 21600-069 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 19210 | Use at 4% in PBS, 4 °C |
| Normal Horse Serum | Life Technologies | 16050 | 10% in PBS-TX (v/v) |
| Normal Goat Serum | Life Technologies | 16210 | 10% in PBS-TX (v/v) |
| Triton X-100 (TX) | Sigma-Aldrich | T8787 | 0.1% in PBS (v/v) |
| Vibratome | Leica | VT1000S | |
| Fluorescence Microscope | Zeiss | Imager.M2 | |
| Camera | Hamamatsu | ORCA R2 | |
| Microscope Stage Controller | Ludl Electronic Products | MAC 6000 | |
| Stereology software | MBF Bioscience | Stereo Investigator 11 | |
| Stereology software | ImageJ/NIH | NIH freeware | |
| 3D Reconstruction software | MBF Bioscience | Neurolucida Explorer | |
| Confocal Microscope | Leica | TCS SP2 | |
| MRI Software | |||
| Freesurfer | https://surfer.nmr.mgh.harvard.edu/fswiki/DownloadAndInstall | Segmentation and Volume | |
| ITK-Snap | http://www.itksnap.org/pmwiki/pmwiki.php | Segmentation and Volume | |
| Multi-image Analysis GUI (Mango) | http://ric.uthscsa.edu/mango/ | Longitudinal overlay | |
| Whole Mount Equipment | |||
| 22.5° microsurgical straight stab knife | Fisher Scientific | NC9854830 | |
| parafilm | |||
| wax bottom dissecting dish | |||
| pins | |||
| fine forceps | |||
| aquapolymount | |||
| Dissecting Microscope | Leica | MZ95 | |
| Whole Mount Antibodies | |||
| mouse anti-b-catenin | BD Bioschiences, San Jose, CA, USA | 1:250 | |
| goat anti-GFAP | Santa Cruz Biotechnology | 1:250 | |
| rabbit anti-AQP4 (aquaporin-4) | Sigma-Aldrich | 1:400 | |
| Coronal Antibodies | |||
| Anti-S100β antibody | Sigma-Aldrich | 1:500 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Life Technologies | D-1306 | 10 µg/ml in PBS |
References
- Del Bigio, M. R. Ependymal cells: biology and pathology. Acta Neuropathol. 119, 55-73 (2010).
- Johanson, C., et al. The distributional nexus of choroid plexus to cerebrospinal fluid, ependyma and brain: toxicologic/pathologic phenomena, periventricular destabilization, and lesion spread. Toxicol Pathol. 39, 186-212 (2011).
- Roales-Bujan, R., et al. Astrocytes acquire morphological and functional characteristics of ependymal cells following disruption of ependyma in hydrocephalus. Acta Neuropathologica. 124, 531-546 (2012).
- Cserr, H. F. Physiology of the choroid plexus. Physiol Rev. 51, 273-311 (1971).
- Iliff, J. J., et al. A paravascular pathway facilitates CSF flow through the brain parenchyma and the clearance of interstitial solutes, including amyloid beta. Science Translational Medicine. 4, 147ra111 (2012).
- Shook, B. A., et al. Ventriculomegaly associated with ependymal gliosis and declines in barrier integrity in the aging human and mouse brain. Aging Cell. , (2013).
- Xie, L., et al. Sleep drives metabolite clearance from the adult brain. Science. 342, 373-377 (2013).
- Fazekas, F., et al. Pathologic correlates of incidental MRI white matter signal hyperintensities. Neurology. 43, 1683-1689 (1993).
- Meier-Ruge, W., Ulrich, J., Bruhlmann, M., Meier, E. Age-related white matter atrophy in the human brain. Ann N Y Acad Sci. 673, 260-269 (1992).
- Resnick, S. M., Pham, D. L., Kraut, M. A., Zonderman, A. B., Davatzikos, C. Longitudinal magnetic resonance imaging studies of older adults: a shrinking brain. The Journal Of Neuroscience : The Official Journal Of The Society For Neuroscience. 23, 3295-3301 (2003).
- Sener, R. N. Callosal changes in obstructive hydrocephalus: observations with FLAIR imaging, and diffusion MRI. Comput Med Imaging Graph. 26, 333-337 (2002).
- Sze, G., et al. Foci of MRI signal (pseudo lesions) anterior to the frontal horns: histologic correlations of a normal finding. AJR Am J Roentgenol. 147, 331-337 (1986).
- Tisell, M., et al. Shunt surgery in patients with hydrocephalus and white matter changes. Journal of Neurosurgery. 114, 1432-1438 (2011).
- Valdes Hernandez Mdel, C., et al. Automatic segmentation of brain white matter and white matter lesions in normal aging: comparison of five multispectral techniques. Magn Reson Imaging. 30, 222-229 (2012).
- Shook, B. A., Manz, D. H., Peters, J. J., Kang, S., Conover, J. C. Spatiotemporal changes to the subventricular zone stem cell pool through aging. The Journal of Neuroscience : The Official Journal Of The Society For Neuroscience. 32, 6947-6956 (2012).
- Mirzadeh, Z., Merkle, F. T., Soriano-Navarro, M., Garcia-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. Neural stem cells confer unique pinwheel architecture to the ventricular surface in neurogenic regions of the adult brain. Cell Stem Cell. 3, 265-278 (2008).
- Mirzadeh, Z., Doetsch, F., Sawamoto, K., Wichterle, H., Alvarez-Buylla, A. The subventricular zone en-face: wholemount staining and ependymal flow. J Vis Exp. , (2010).
- Luo, J., Daniels, S. B., Lennington, J. B., Notti, R. Q., Conover, J. C. The aging neurogenic subventricular zone. Aging Cell. 5, 139-152 (2006).
- Luo, J., Shook, B. A., Daniels, S. B., Conover, J. C. Subventricular zone-mediated ependyma repair in the adult mammalian brain. J Neurosci. 28, 3804-3813 (2008).
- Marcus, D. S., Fotenos, A. F., Csernansky, J. G., Morris, J. C., Buckner, R. L. Open access series of imaging studies: longitudinal MRI data in nondemented and demented older adults. J Cogn Neurosci. 22, 2677-2684 (2010).
- Giorgio, A., De Stefano, N. Clinical use of brain volumetry. J Magn Reson Imaging. 37, 1-14 (2013).
- Caspers, S., et al. Studying variability in human brain aging in a population-based German cohort-rationale and design of 1000BRAINS. Front Aging Neurosci. 6, 149 (2014).
- Keuken, M. C., et al. Ultra-high 7T MRI of structural age-related changes of the subthalamic nucleus. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33, 4896-4900 (2013).
- Marti-Bonmati, L., Sopena, R., Bartumeus, P., Sopena, P. Multimodality imaging techniques. Contrast Media Mol Imaging. 5, 180-189 (2010).
- Bergmann, O., et al. The age of olfactory bulb neurons in humans. Neuron. 74, 634-639 (2012).
- Sanai, N., et al. Corridors of migrating neurons in the human brain and their decline during infancy. Nature. 478, 382-386 (2011).
- Wang, C., et al. Identification and characterization of neuroblasts in the subventricular zone and rostral migratory stream of the adult human brain. Cell Res. 21, 1534-1550 (2011).
- Carmen Gomez-Roldan, D. el, M,, et al. Neuroblast proliferation on the surface of the adult rat striatal wall after focal ependymal loss by intracerebroventricular injection of neuraminidase. The Journal of Comparative Neurology. 507, 1571-1587 (2008).
