Introduction
Ein ependymalen Zellschicht Leitungen Ventrikelsystem des Gehirns welche bidirektionalen Barriere und Transportfunktionen zwischen der Rückenmarksflüssigkeit (CSF) und interstitieller Flüssigkeit (ISF) 1-3. Diese Funktionen helfen, das Gehirn Giftstoff-frei und in physiologische Gleichgewicht 2,3 zu halten. Beim Menschen Verlust von Teilen dieses Futter durch Verletzung oder Krankheit scheint nicht in regenerative Ersatz Ergebnis als in anderen epithelialen Auskleidungen gefunden; eher Verlust ependymaler Zellenabdeckung scheint in periventrikuläre Astrogliose mit einem Geflecht von Astrozyten abdeckt Regionen Ependymzellen entblößt an der Herzkammer Oberfläche führen. Schwerwiegende Auswirkungen auf wichtige CSF Tausch / ISF und Clearance-Mechanismen würde vorhergesagt werden, um den Verlust dieser Epithelschicht 1,2,4-7 führen.
Ein gemeinsames Merkmal der menschlichen Alterung Seitenventrikel (Ventrikulomegalie) und die damit verbundenen periventrikuläre Ödem als observ vergrößertvon MRI und flüssigkeits abgeschwächten Inversion-Recovery-MRI (MRI / FLAIR) 8-14 ed. Um die Beziehung zwischen Ventrikulomegalie und der zellulären Organisation des Ventrikels Futter zu untersuchen, wurden postmortalen humanen MR-Sequenzen mit histologischen Präparationen Seitenventrikel periventricular Gewebe abgestimmt. In Fällen von Ventrikulomegalie hatte wesentliche Bereiche Gliose ependymaler Zellenabdeckung entlang der lateralen Ventrikelwand ersetzt. Wenn Ventrikel Expansion wurde nicht von MRI-basierte Volumen-Analyse nachgewiesen, die ependymaler Zellauskleidung war intakt und Gliose nicht entlang der Ventrikel Futter 6 erkannt. Diese kombinatorischen Ansatz stellt die erste umfassende Dokumentation Detaillierung Veränderungen im zellulären Integrität des Seitenventrikels Futter mit wholemount Zubereitungen von Teilen oder der gesamten seitlichen Ventrikelwand und 3D-Modellierung der Herzkammer 6 Bände. Mehrere Krankheiten (Alzheimer-Krankheit, Schizophrenie) und Verletzungen (Schädel-Hirn-Verletzung)zeigen Ventrikulomegalie als frühe neuropathologischen Merkmal. Denudation Bereiche der ependymalen Zellauskleidung dadurch würde vorhergesagt werden, die den normalen ependymalen Zellfunktion stören und beeinträchtigen die homöostatische Gleichgewicht zwischen CSF / ISF Fluid und Stoffaustausch. So wird eine gründlichere Untersuchung der Änderungen der ventrikulären System, seine zelluläre Zusammensetzung und der Folge, um die darunterliegende oder benachbarte Hirnstrukturen schließlich beginnen, mehr über die Neuropathologie mit Ventrikel Erweiterung assoziiert zu offenbaren.
Das Fehlen von multimodalen Bilddaten, insbesondere Längsschnittdaten-Sequenzen zusammen mit begrenzten Zugang zu entsprechenden histologischen Gewebeproben ermöglicht Analyse der menschlichen Hirnerkrankungen schwierig. Modellierung Phänotypen in den menschlichen Alterungsprozess oder Krankheit gefunden werden oft mit Mausmodellen erreicht werden und Tiermodellen zu einem unserer besten Mittel, um Fragen über die menschliche Krankheit Initiierung und Progression zu erkunden. Mehrere Studien ingesunden jungen Mäusen haben die Zellarchitektur der Seitenventrikel Wänden und dem darunterliegenden Stammzellnische 4,7-15 beschrieben. Diese Studien wurden erweitert, um die 3D-Modellierung und zelluläre Analyse der Herzkammer Wände durch Alterung 6,15 umfassen. Weder periventrikuläre Gliose noch Ventrikulomegalie sind in alten Mäusen beobachtet, statt Mäuse zeigen eine relativ robust subventicular Zone (SVZ) Stammzellnische darunterliegenden zu einer intakten Zelle ependymaler Futter 6,15. Somit ergeben sich markante speziesspezifische Unterschiede sowohl in der allgemeinen Wartung und Integrität der Seitenventrikel Auskleidung während des Prozesses der Alterung 6,15. Daher eine optimale Nutzung Mäusen, die Bedingungen in Menschen gefunden abzufragen, Unterschiede zwischen den zwei Arten müssen gekennzeichnet werden und in geeigneter Weise in jeder Modellierungsparadigma betrachtet. Hier präsentieren wir Verfahren, die Längs Änderungen an den lateralen Ventrikel und zugehörige periventrikuläre Gewebe in Mensch und m bewertenOuse. Unsere Verfahren sind 3D-Rendering und Volumetrie von Maus und menschlichen Herzkammern, und die Verwendung von immunhistochemischen Analyse der ganze Berg Zubereitungen periventrikuläre Gewebe sowohl zelluläre Organisation und Struktur zu charakterisieren. Zusammen stellen diese Verfahren liefern ein Mittel, um Änderungen in der Herzkammersystem und die zugehörige periventricular Gewebe zu charakterisieren.
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Protocol
HINWEIS: Tierverfahren wurden von der University of Connecticut IACUC zugelassen und entsprechen den NIH-Richtlinien. Menschliches Gewebe und Datenanalyse und Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den von der University of Connecticut IRB zugelassen und entsprechen den NIH-Richtlinien.
1. Maus: Analyse der Periventrikuläre zelluläre Integrität und 3D-Modellierung des Seitenventrikels
1.1) Herstellung von Maus-Lateral Ventrikelwand Whole Mounts
- Vorbereitung Maus Seitenventrikel Gesamtpräparate für die Immunhistochemie (IHC), wie zuvor beschrieben 16,17.
1.2) Immunhistochemie für Seitenventrikel Analysis
- Fix und Abschnitt Maus Hirngewebe, wie oben beschrieben 18,19.
- Kurz, bündig Mäusen transkardial mit normaler Raumtemperatur Kochsalzlösung, bis Organe gelöscht (durch eine blasse Färbung angedeutet), die von Raumtemperatur 4% Paraformaldehyd, gefolgt(PFA) in 0,1 M phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) bis Gewebe versteift.
- Entfernen Gehirn aus dem Schädel. Verwenden iris Dissektion Schere aus der Schädelbasis entlang der Pfeilnaht geschnitten.
- Expose Schädel und Gehirn mit einer Pinzette entfernen. Tauchen Sie das Gehirn in 4% PFA Fixiermittel über Nacht bei 4 ° C. Dann waschen 3 Mal für 20 Minuten mit PBS.
- Bereiten Serienschnitte für die Immunhistochemie und Volumenanalyse.
- Verwendung eines mikrochirurgischen Skalpell einen kleinen Schnitt in Längsrichtung entlang der Rinde der linken Hemisphäre, die Identifikation der linken Hemisphäre von der rechten Hemisphäre zu ermöglichen, wenn schwimmende Abschnitte immunogefärbt.
- EnCase bei Vibratom Schnitte fixiert Gehirne in 3% Agarose für zusätzliche strukturelle Unterstützung. Warm 3% Agarose in destilliertem Wasser (w / v) bis zur vollständigen Lösung unter Verwendung von entweder einer Mikrowelle oder Heißplatte.
- Mit einer Rasierklinge, entfernen Sie den kaudalen Abschnitt des Gehirns auf das Kleinhirn mit einkoronalen Schnitt, so dass eine flache und ebene Oberfläche. Bewerben Sekundenkleber auf das Gewebe der Bühne und positionieren das Gehirn auf der neu geschnittenen Oberfläche mit den Riechkolben nach oben zeigt.
- Wenn flüssige Agarose-Lösung wurde auf eine Temperatur gerade warm an gekühlt, gelten gleichmäßig über das Gehirn, um das gesamte Gehirn vollständig umhüllen. Ermöglichen die Agarose verfestigt.
- Section Agarose ummantelt Gehirne koronal auf einem Vibratom in 50 & mgr; m Abschnitte mit Abschnitten seriell in einer 24-Well-Platte mit PBS, um die Reihenfolge zu erhalten platziert.
HINWEIS: In der Regel 12 Wells für ein Gehirn vor sehen die Entstehung der Seitenventrikel beginnend mit gut A1, bewegen numerisch bis zur B6 und Radfahren zurück zu A1 verwendet, mit Sammlung von Anfang 5 Abschnitte Gewebe. Dies ermöglicht mehreren unterscheidbaren Abschnitten aus dem gleichen Gehirn innerhalb derselben gut verarbeiten. Für Seitenventrikel Volumenanalyse, aufgehört Gewebesammlung, wenn die lateralen Ventrikels und dritten Ventrikels merge, was in etwa 3 Abschnitte pro Well oder 36 Abschnitte insgesamt. - Saugen Sie das PBS unter Verwendung einer Transferpipette mit einer 20 bis 200 & mgr; l Mikropipettenspitze befestigt ist, um sicherzustellen, dass schwimmende Abschnitte sind nicht aus Versehen eingesaugt. Block und permeabilisieren schwebenden Abschnitte in 10% Serum, 0,1% Triton X-100 (TX) in PBS (PBS-TX) für 1 h bei Raumtemperatur. Verwenden Sie 300 ul Lösung pro Vertiefung zu frei schwebenden Gewebeschnitte in eine 24-Well-Platte abdecken und führen alle Inkubationen von Abschnitten auf einer Schwenkplatte.
- Absaugen Blockierungslösung und Inkubieren Abschnitte mit primären Antikörpern in PBS-TX über Nacht (mindestens 12 h) bei 4 ° C. Für Ventrikelvolumens Spuren mit Koronalschnitte, verwenden Anti S100β Antikörper gegen Ependymzellen beschriften.
- Saugen primären Antikörperlösung und waschen Abschnitte 3 mal je 10 min mit PBS-TX.
- Abschnitte in dunklen Inkubation für 1 Stunde bei Raumtemperatur mit fluoreszierenden Sekundärantikörper, bei Konzentrationen von 1: 1000 in 10% Serum, PBS-TX. Halten Sie Abschnitte in der Dunkelheit für den restlichen Inkubationsschritte.
- Aspirat sekundäre Antikörperlösung und Inkubation Abschnitte mit 4 ', 6-Diamidino-2-phenylindol in PBS (DAPI, 10 ug / ml) für 5 min, um die Zellkerne gegenfärben. Saugen Sie das DAPI-Lösung und spülen Abschnitte 3 mal für jeweils 10 Minuten mit PBS.
- Berg Abschnitte seriell auf Objektträger mit der kortikalen Marke nach links preserve gegen rechte Hemisphäre Orientierung. Luft trocknen Abschnitte im Dunkeln und dann Deckglas durch Aufbringen einer dünnen Schicht der Montage Medien auf den Objektträger und sanft legen Sie eine Deckglas an der Spitze. Ermöglichen Deckglas gleitet über Nacht bei Raumtemperatur trocknen.
1.3) Seitenventrikel Segmentation für 3D-Rekonstruktionen
ANMERKUNG: Führen Sie Verfolgung der Seitenventrikel mit Mapping-Software auf eine aufrechte Epifluoreszenz microscoPET, das mit einer automatisierten Stufe und einer digitalen CCD-Kamera für die Fluoreszenzdetektion.
- Schalten Sie das Fluoreszenzmikroskop Ausrüstung und starten Mapping-Software in der Fluoreszenz-Modus. Open 'Anzeigeoptionen', um die richtigen Werkzeugleisten und Andocken Werkzeugtafeln für die Rückverfolgung benötigt laden. Optionen> Anzeigeoptionen> Zubehör, und wählen Sie die 'Main' und 'Markierung' Symbolleisten. Im selben Menü die Option "Kamera Histogramm", "Multichannel-Steuerung", "Kamera-Einstellungen" und "Bildaufnahme" unter "Docking Werkzeugtafeln."
- Beachten Anfänge der Ventrikel basierend auf starken S-100β Fluoreszenz, die Ependymzellen, die den lateralen Ventrikel Linienbeschriftungen. Identifizieren Sie das erste Stück Gewebe, das die lateralen Ventrikel.
- Erstellen Sie eine neue Datendatei und benennen einen Bezugspunkt für die Tischbewegung, indem Sie im Bildfenster oberhalb des linken Seitenventrikels. Achten Sie auf das kleineEinschnitt von rechten Hemisphäre links zu orientieren. Halten Sie den Bezugspunkt in einer konsistenten Position relativ zu der lateralen Ventrikel über Tracing-Dateien beim Importieren von Konturen für serielle Wiederaufbau zu helfen.
- Wählen Sie den entsprechenden Preset-Konturtyp von der Kontur im Dropdown-Menü, zum Beispiel 'linken Seitenventrikels.' Verwenden Sie eine einzigartige Farbe für jedes der linken und rechten Seitenventrikels Kurven. Wenn Änderungen in der Kontur Namen und die Farbe benötigt werden, gehen Sie zu Optionen> Anzeigeeinstellungen> Contours, dann die Namen der Konturfarben zu ändern oder wählen Sie "Add Contour Type '.
- Mit ausgewählten der "linken Seitenventrikels 'Kontur, klicken Sie auf der apikalen Oberfläche der ependymaler Futter, um die Trace-Kontur zu beginnen. Verfolgen Sie die Herzkammer durch die weitere sukzessive entlang der apikalen Oberfläche klicken.
- Für unregelmäßige Flächen mehr Finesse erfordern, klicken Sie und halten Sie die linke Maustaste, um freie Hand zu verfolgen. Drücken Sie Strg + Z, oder gehen Sie to Optionen> Rückgängig, um die vorherige Konturpunkt rückgängig zu machen. Bewegen Sie das Suchfenster mit den Pfeiltasten oder durch ein Konturpunkt außerhalb des Bildschirms und man die Fenster, um sich automatisch zu zentrieren. Um die Herzkammer Verfolgung der rechten Maustaste beenden und wählen Sie "Close Contour".
- Wählen Sie eine neue Farbe Kontur (Kontur-Typ) für den rechten Seitenventrikels mit dem Dropdown-Menü. Verfolgen Sie die rechte Herzkammer, wie in Schritt 1.3.4 für das linke.
- Wenn Änderungen in der Kontur Namen und die Farbe erforderlich sind, klicken Sie rechts auf die Kontur und wählen Sie Ändern Contour Type, um die entsprechende Farbe auszuwählen.
- Fügen Sie Markierungen entlang der Mittellinie, um das Ausrichten Serien Konturen zur 3D-Rekonstruktion zu unterstützen. Marker hinzufügen möchten, wählen Sie die entsprechende Markierung (verwenden Sie das 'X') von der Markierungssymbolleiste auf der linken Seite und klicken Sie auf, um sie auf der Rückverfolgung Bildschirm fallen. Import-Marker zusammen mit den Konturen für jeden Gewebeschnitt Spur.
- So speichern Sie das Gewebe Spuren, wählen Sie Datei> SpeichernData File As und einen neuen Ordner und Dateinamen. Anzahl der Kurven [slide #] - [Gewebe #] für eine einfache Identifizierung von Spuren von Serienschnitten. Zum Beispiel kann die dritte Gewebeabschnitt an dem zweiten Schieber hat den Dateinamen, 2-3 'in dem Verzeichnis für jedes Gehirn.
- Wiederholen Sie die Schritte 1.3.4 bis 1.3.9 für jede serielle Abschnitt des Hirngewebes, um die Herzkammern durch das gesamte Gehirn zu verfolgen, ohne Regionen Ventrikelwand Haftung.
- Wenn der Ventrikel weist einen Bereich der Adhäsion, Subsegment anterioren Bereich von jenen dorsal und ventral zur Adhäsionsstelle. Erstellen Sie zwei neue Konturtypen für jede Herzkammer (zB 'Rücken Linke Herzkammer "und" Bauch Linke Herzkammer). Auf der ersten Gewebescheibe mit Haft, Spuren Seitenventrikel sowohl mit dem ursprünglichen Seitenventrikel Kontur und der neuen dorsalen und ventralen Konturen zur Gewährleistung einer vollständigen Rekonstruktion Ventrikel erzeugt werden.
- In Abschnitten posterior zu einem ventricle Wandhaftung, erstellen Sie eine Reihe von neuen Konturfarben für den hinteren Teil jeder Herzkammer (zB "posterior Linke Herzkammer). Doppelklicken Spuren diesen ersten Wieder verbundenen Abschnitt sowohl mit dem Strom Haftung und neue hintere Kontur Typen.
1.4) Seitenventrikel 3D-Rekonstruktion
- Richten Sie und kompilieren Serienkonturzeichnungen der Maus Seitenventrikel zu 3D-Rekonstruktionen und Volumendaten zu erzeugen.
- Öffnen Sie 3D-Wiederaufbauprogramm. Klicken Sie auf Datei> Öffnen und wählen Sie die Kontur-Datei des ersten zurückSerienBereich. Importieren Sie die Konturzeichnungen der linken und der rechten Herzkammer sowie alle Markierungen hinzugefügt.
- Konturen auszuwählen, klicken Sie auf die Schaltfläche "Objekte auswählen" (Cursor-Symbol), und wählen Sie die beiden Herzkammern und Markierungen durch Halten von Digi-Key. Um die Z-Position der Konturen zu schaffen, der rechten Maustaste und wählen Sie "Ändern Z Position '. Stellen Sie die erste Gewebeschnitt auf 0 & mgr; m. <li> Um den Wiederaufbau, wählen Sie Datei> Save Data File As speichern. Speichern Sie nach jeder Datei zu importieren, so dass, wenn ein Fehler gemacht Wiederherstellung ist so einfach wie erneute Laden der vorherigen Datei.
- Um die nächste Gewebeschnitt für den Wiederaufbau hinzuzufügen, klicken Sie auf Datei> Anhängen zum anzeigen. Wählen Sie die DAT-Datei angehängt werden soll, und überprüfen Sie die "Merge" Box.
- Befolgen Sie Schritt 1.4.3 wieder die Z-Position des neu importierten Trace-Datei anpassen. Wählen Sie nur die neu hinzugefügten linken und rechten Konturen im Hauptfenster eine Bewegung zu vermeiden Sie die anderen Spuren. Stellen Sie jeden sukzessiven Trace-Datei bis 50 um von der Z-Position des vorherigen Kontur 50 um Abschnitte. (Erste Kontur: z = 0, zweite Kontur: z = 50, dritte Kontur: z = 100, etc.)
- Zum Einstellen der X, Y-Position des ausgewählten Konturen und Marken, klicken Sie auf den "Translation Aktivieren mit Maus 'Taste und ziehen Sie die Konturen mit den vorherigen Gewebekonturen anzupassen. Halten Sie die linke und rechte Konturen der aktuellen Spur ausgewähltum eine synchrone Bewegung zu ermöglichen.
- So drehen Sie die Spuren im oder gegen den Uhrzeigersinn, um Line-Up der Mittellinie Marker, wählen Sie die "Z-Achsen-Rotation" Knopf. Konturen auf der Y-Achse drehen (wenn der linke Kontur rechts) wählen Sie beide importierten Konturen und Markierungen der rechten Maustaste, wählen Sie "Set Drehwinkel", und geben Sie "180" in das "Y Drehung".
- Stellen Sie sicher, dass die Herzkammern und Mittellinienmarkierungen werden am besten vor dem Speichern der Datei Rekonstruktion, wie in Schritt 1.4.4 ausgerichtet sind.
- Wiederholen Sie die Schritte 1.4.5 bis 1.4.9 für jede nachfolgende Gewebeschnitt bis alle importiert wurden und korrekt ausgerichtet.
- Um die Lautstärke zu Daten der seriellen Rekonstruktion anzuzeigen, klicken Sie Analyse> "Marker und Region Analysis" und wählen Sie "3D Contour Zusammenfassung '. Wählen Sie alle Konturen im linken Bereich und dann auf die "3D-Visualisierung ', um die endgültige 3D-Rekonstruktion anzuzeigen.
2. Menschen: Analyse der Periventrikuläre zelluläre Integrität und 3D-Modellierung des Seitenventrikels
2.1) Menschliche MRI Data Analysis
HINWEIS: Protokolle aufgelistet, um 3D-Bildrekonstruktionen und volumetrische Quantifizierung der lateralen Ventrikel zu erstellen und zu bewerten Volumenänderungen im Laufe der Zeit mit Längs Overlay-Analyse. Es ist wichtig anzumerken, dass die Konsistenz bei der MR-Datenerfassung (zB Maschinen und Magnetstärke, Schnittdicke, Orientierung und Auflösung) und Post-Erfassungsverarbeitung sind extrem wichtige Kriterien für die Aufnahme von Datensätzen 20.
- Ventrikuläre Segmentation
HINWEIS: ITK / Snap wird das Segment der Kammern von hochauflösenden T1-gewichteten MR-Bildern verwendet. Alternativ können auch andere Freeware-Software, wie beispielsweise Freesurfer verwendet werden.- Öffnen ITK / Snap, Datei> Öffnen Graustufen Bild. Wählen Sie die gewünschte Datei und offener als .nii Datei (NITFI Datei).
- Blättern Sie durch die einzelnen anatomical Ebene und stellt fest, ventrikuläre Anomalien (stenosierten Regionen, groß oder klein Temporalhörner, etc.). In der Haupt-Toolbox klicken Sie auf "Snake ROI Tool '. Klicken Sie auf 'Segment 3D'. Wählen Sie die Option "Intensity Region '.
- Klicken Sie auf "Vorverarbeitung Bild '. Wählen Sie "Vor", um Bereiche unterhalb einer bestimmten Intensitätsschwelle, um die ROI in weiß zu markieren sind. Nehmen Sie die maximale Intensität mit Schieberegler. Stellen Sie die Schwelle von 15% der maximalen Intensität (record diesen Wert). Stellen Glätte Parameter auf 10. Klicken Sie auf "OK", dann auf "Weiter".
- Hinzuzufügen 10-12 klein (Größe 2) "Blasen" zu jedem Ventrikel: zwei in der vorderen Stirnhorn, sieben an der oberen Fläche des lateralen Ventrikels Körper, eine im Okzipitalhorn und eine im zeitlichen Horn der gleichmäßig beabstandeten Seitenventrikel. 'Wählen Sie Parameters' und setzen Krümmungskraft auf 0,4. Auf den Abspielen-Symbol, um aktive Kontur Evolution beginnen.
- Klicken Sie auf "Update-Netz 'to Oberfläche zu visualisieren; überprüfen "Auto-Update". Stoppen Sie die Segmentierung, wenn alle Bereiche der lateralen Ventrikel sind in der Region von Interesse (ROI) enthalten. Aufnahme des dritten Ventrikels zu vermeiden. Klicken Sie auf "Fertig stellen".
- Manuell bearbeiten Bild ggf. zu unerwünschten Bereichen durch die folgenden Verfahren zu entfernen (in der Regel müssen dritten Ventrikels Leckage zu löschen). Manuell verwenden die '3D Skalpell' Werkzeug, um überschüssige Bereiche zu entfernen oder manuell verwenden Sie die "Paintbrush" -Tool mit 'Clear Label' als aktive Zeichnungskennung, jede Aufnahme über ROI zu löschen.
- Sparen Segmentierungsergebnisse als .nii Bild ('NIfTI' Dateiformat).
- Um insgesamt Ventrikel Volumen zu erhalten, wählen Sie "Segmentation> Volume" und Statistik; zu erhalten, das Gesamtvolumen der Herzkammer mit Satz Farbe Label.
- Längs Darstellung Seitenventrikel Von MRIScans
HINWEIS: Die VerwendungMango-Software, sind Längs ROIs überlagert, um Veränderungen in der Herzkammer Volumen innerhalb Themen im Laufe der Zeit qualitativ und quantitativ zu demonstrieren.- Öffnen Mango. Klicken Sie auf File> Load ROI des ersten ROI Zeitpunkt (Baseline) als GREEN. File> Load ROI des zweiten ROI Zeitpunkt als RED. Sparen Längslagerung, indem Sie Datei> Speichern unter; weisen Sie jedem Bild als 'Datei name_ [ersten Zeitpunkt Alter] - [zweiten Zeitpunkt Alter] .nii'.
- Öffnen ITK-SNAP. Öffnen Sie das kombinierte ROI als "Graustufenbild", indem Sie Segmentation> Load From Bild> kombiniert ROI-Datei. Zu erhalten Längsvolumendaten führen Sie den folgenden: Segmentierung> Lautstärke und Statistik> Label 1 (rot) = Ausdehnungsvolumen; Label 2 (grün) = Stenose Volumen; Label 3 (blau) = Basisvolumen.
2.2) Menschliche Periventrikuläre Gewebepräparation und Analyse
- Sicherheitshinweise für den Umgang mit menschlichem Gewebe
- Erhalten appropriate Sicherheitstraining (z. B. durch Blut übertragbaren Krankheitserreger natürlich).
- Beachten Sie Standard (universal) Sicherheitsvorkehrungen. Schutzhandschuhe tragen. Handschuhe verändern bevor Sie jede gemeinsame Anlagen oder Oberflächen, die nicht zu entsorgen sind. Beschriften Sie alle mögliche Einzelteile routinemäßig behandelt werden, wenn die Arbeit mit menschlichen Gewebe mit "menschlichem Gewebe Verwendung" Bezeichnungen.
- Folgen Sie Dekontamination Praktiken für alle Einzelteile in Kontakt menschlichem Gewebe. Bleichen alle verunreinigten Flüssigkeiten für mindestens 24 Stunden vor der Entsorgung, Behandlung kontaminierten Oberflächen mit einem Bleichmittel getränkten Tuch (zB Tischplatte) oder indem Objekt direkt in Bleichmittel (zB Zange).
- Bereiten Sie Notfallplan für den Kontakt mit menschlichem Gewebe direkt auf der Haut, die umfassen können Tränken Sie ein Papiertuch in Bleichmittel und das Festhalten an dem betroffenen Bereich (5-10 min).
- Verwenden Sie geeignete Entsorgung für alle Einzelteile kommen in Kontakt mit menschlichem Gewebe.
- Seitenventrikel Ganze Berge Vorbereitung
- Beginning mit intaktem Hemisphäre (in 10% Formalin fixiert und gründlich mit 0,1 M PBS gespült) schneiden 1,5 cm dicke koronale Schnitte durch gesamten Halb Verwendung großer Messer.
HINWEIS: Alle Fixierung Protokolle bedürfen der vorherigen Überprüfung Antikörper. - Label Abschnitte von vorne nach hinten mit ersten Abschnitt mit dem lateralen Ventrikel. Verwenden Sie einen alphanumerischen Kennzeichnungssystem, Kennzeichnung der Scheiben mit Buchstaben (vorne nach hinten) und Unterabschnitt mit Nummern (von oben nach unten). Nicht zu stören ependymaler Oberfläche.
- Verwendung mikrochirurgischen Skalpells, sezieren Ventrikelwand 1 cm tief, die Aufrechterhaltung einer durchgehenden Abschnitt für ganze Seitenwand. Teilen Wand wie notwendig, um entsprechend dimensionierten Abschnitten zur Färbung gut zu schaffen. Kerbabschnitt auf der gegenüberliegenden Seite der Ventrikelwand zu superior / inferior Orientierung zu identifizieren.
- Antigen-Wiedergewinnung durchzuführen durch Inkubieren Gewebeschnitte in 10 mM Natriumcitrat-Puffer (pH 6,0) bei 100 ° C für 10-20 min unter Verwendung eines Doppel boiler (optimale Inkubationszeit wird empirisch bestimmt). 3 mal Spülen in PBS / 0,1% Triton X-100 (PBS-TX).
- Block in 10% Pferdeserum, unter Verwendung von PBS / PBS-TX für 1 h bei Raumtemperatur.
- Inkubieren mit primären Antikörpern für 48 Stunden bei 4 ° C. Um Ventrikel Wandverkleidung sichtbar zu machen, immunostain ganze Halterungen mit den folgenden Antikörperkombinationen: Maus-Anti-β-Catenin (1: 250); Ziege-Anti-GFAP (1: 250); Kaninchen-Anti-AQP4 (1: 400).
- Führen Sie alle nachfolgenden Schritte in der Dunkelheit. Gewebe spülen 3 mal in PBS, Inkubation mit sekundären Antikörpern (1: 500) für 24 h bei 4 ° C oder 2 Stunden bei Raumtemperatur und weitere 3 mal Spülen in PBS. Inkubieren Gewebe DAPI für 7 min bei Raumtemperatur gefolgt von weiteren 3 Spülungen in PBS.
- Bereiten Gewebe für die endgültige Präparation durch Abdecken einer Wachsbodenschale mit Parafilm. Füllen Schale mit PBS, legen Gewebe in Schale mit feinen Pinzette, Vermeidung von Kontakt mit ependymaler Wand.
- Unter dem Binokular, fest secure Gewebe auf seiner Seite mit Hilfe der Pins. Mit einem 22,5 ° mikro stab Messer, schaffen einheitliche Dünnschnitte (etwa 300 & mgr; m dick) aus seitlichen Ventrikelwand. Für große Teile oder Abschnitte mit schwierigen Krümmung, schneiden in kleinere Würfel vor dem Schneiden in die letzten Abschnitte für die Montage und Mitteilungs Lage.
- Vorsichtig seziert Abschnitt Ependym Seite nach oben auf die Folie mit feinen Pinzette, in Kenntnis der regionalen Lage und Orientierung auf der Folie. Decken Gewebe mit dünnen Schicht aus aquapolymount, kümmert sich um Blasen zu vermeiden. Deckglas über Gewebe, fügen Sie zusätzliche aquapolymount wie nötig, um alle Lücken unter Deckglas zu füllen.
- Zeigen montiert Abschnitte in dunklen und trockenen für 2-3 Tage bei Raumtemperatur. Shop in slidebox bei 4 ° C.
- Beginning mit intaktem Hemisphäre (in 10% Formalin fixiert und gründlich mit 0,1 M PBS gespült) schneiden 1,5 cm dicke koronale Schnitte durch gesamten Halb Verwendung großer Messer.
- Immunhistochemie und histologische Analyse
- Mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie an fluoreszierenden Immunhistochemie anzuzeigen, setzen Sie die Bildbrennebene an der Herzkammer Oberfläche, wie durch die Verwendung o bestimmtf β-Catenin (Marker für apikale adherens junction-Proteine Ependymzellen). Abzugrenzen Regionen ependymaler Zellenabdeckung und Oberflächen Astrogliose (GFAP-Färbung bei Ventrikel Oberfläche).
- Zu dokumentieren und Montage der gesamten Ventrikels Oberfläche, verwenden Sie überlappende Bilder auf gesamten Oberfläche zu bedecken. Um Montage von Serienbilder erstellen, öffnen Sie Adobe Photoshop. Verwenden Sie Datei> Automatisieren> Photomerge> Interaktiver Layouts zur Auswahl von Bildern zu überlagern, manuelle Einstellungen, wenn nötig.
- Erstellen Sie neue Ebene zu Montage Cartoon Darstellung intakt Ependym Zellenabdeckung oder Ventrikel Gliose Oberfläche generieren zu verfolgen. Wiederholen Sie für jede Folie oder ROI. Kompilieren Sie alle Teile auf die Landkarte Ventrikelwand und Link zur entsprechenden Region auf MRI Wiederaufbau zu rekonstruieren.
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Representative Results
Konturverfolgung der Maus Seitenventrikel basierend auf immun 50 um Koronalschnitte und 3D-Rekonstruktionen (Figur 3) ermöglicht Volumendaten in verschiedenen experimentellen Paradigmen mit Maus als Modellsystem für die Krankheit oder Verletzung gesammelt werden. Entscheidend für diese Vorgehensweise ist der Ausschluß von Bereichen, wo die lateralen Ventrikel Wänden aneinander haften. Durch subsegmenting Regionen der Herzkammern und die Bestimmung einer anderen Farbe für jeden Bereich (3C), können zusammenhängende Abschnitte eingehalten werden und die regionalen und Gesamtvolumen aus zusammengestellt Subsegmenten berechnen.
Ähnliche Studien unter Verwendung von MRI-Scans des Gehirns zusammen mit halbautomatischen Segmentierung (ITK-SNAP) der Seitenventrikel für 3D-Renderings werden. Für die direkte Kopplung von Ventrikel Volumina und periventrikuläre Gewebeanalyse, Pre- oder Post-mortem-MRI-Scans werden segmentiert und ausgerichtet, um 3D-Rekonstruktionen zu erstellen (
Abbildung 1: Darstellende Seitenventrikel Segmentierung mit dem ITK / Snap Snake ROI-Werkzeug (A) 'Bubbles' sind Seitenventrikel aufgenommen. (B) 'Bubbles' während der aktiven Kontur Entwicklung zu erweitern. (C) Die Segmentierung ist abgeschlossen, wenn gesamten lateralen Ventrikel gefüllt ist. (Es wird darauf geachtet, den 3. Ventrikel zu vermeiden.)
Abbildung 2: Menschlicher seitlicher Ventrikelwand Dissektion (
Abbildung 3: Ablaufverfolgung und 3D-Rekonstruktion der Maus Seitenventrikel (koronaler Maushirn Abschnitt, der Seitenventrikel, durch S100β-immunreaktiven Ependymzellen umrissen (*, Seitenventrikel, Halterung, in der Region adhe. sion; Maßstab, 500 & mgr; m). (B) Maus Seitenventrikel werden als "Konturen" zurückgeführt und als Unter segmentierten Abschnitten angeordnet, ohne Regionen intraventrikuläre Haftung stören Maßanalyse. (C) 3D-Rekonstruktion der Seitenventrikel Konturen. Gelb, Kontur des gesamten Hirnvolumens überspannt den Bereich von Interesse, welche die lateralen Ventrikel.
Abbildung 4: MRT-basierte Seitenventrikel Segmentierung (A) MR-Bildern zusammengesetzt werden. (B) Seitenventrikel als ROI (rot) definiert. (C) 3D-Bildrekonstruktion ermöglicht volumetrische Quantifizierung und qualitative Darstellung der lateralen Ventrikel.
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Abbildung 5: Bewertung der Längs Ventrikel Expansion Longitudinal MRIs von mehreren Punkten ausgerichtet und überlagert, zu visualisieren und zu quantifizieren Ventrikel Volumenausdehnung in Themen im Laufe der Zeit werden.
Abbildung 6: Immunhistochemische Auswertung und regionale Zuordnung der menschlichen Seitenventrikel Fläche (A) Bereiche von intakten Ependymzellen, durch β-Catenin-Färbung dargelegt, zeigen einen Kopfsteinbild (Stern) und sind durch eine gestrichelte Linie von Bereichen Astrogliose auf Ventrikel Fläche abgegrenzt (GFAP + Färbung). (B) Serien konfokalen Bildern überlagert werden, um eine regionale montage generieren und verfolgt mit Adobe Photoshop für einen Cartoon Darstellung der zellulären Organisation an der Herzkammer Oberfläche. (C) Karikatur vonBildmontage wird Ventrikel Fläche an entsprechenden MRT-basierte 3D-Rekonstruktion Ventrikel abgebildet. (Maßstabsbalken (A), 40 & mgr; m; Maßstabsbalken (B), 1 mm)
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Discussion
Wir präsentieren Werkzeuge und Protokolle, die verwendet werden können, um die Integrität der Ventrikelsystem des Gehirns bei Mäusen als auch bei Menschen zu bewerten. Diese Werkzeuge können jedoch auch auf andere Hirnstrukturen oder Organsysteme, die Änderungen aufgrund einer Verletzung, Krankheit oder während des Vorgangs der Alterung 14,21,22 zogen angewendet werden. Die Strategien vorgestellt Profitieren Sie von Software, die die Ausrichtung der Querschnitts- und Längs MRI-Sequenzen zu 3D-Volumendarstellungen bestimmte Regionen oder Strukturen von Interesse generieren. Längs MRI Sequenzen erlauben Kompilation 3D-Volumenänderungen, die über die Zeit auftreten können und es somit insgesamt Hirnvolumen, für eine seitliche Ventrikel zum Gesamthirnvolumen-Verhältnisse und / oder andere Strukturen des Gehirns (zB Nucleus subthalamicus 23 oder Corpus callosum weißen Substanz Bahnen einzuschließen mit diffusionsgewichteten Tensor Imaging). Gemeinsam können eine umfassende Analyse der Gehirn strukturelle Veränderungen durchgeführt werden. Letztendlichaltersbedingte und krankheitsbedingte Änderungen an Hirnstrukturen zu bewerten eine Sammlung von multimodalen Bildgebungsverfahren sind notwendig, um ein möglichst genaues Bild der Hirn Gesundheitszustand 24 bereitzustellen. Dokumentation und Erstellung der kritischen Strukturdaten zusammen mit Subjekt-Subjekt Variabilität und des Bereichs der Variabilität über Themen, könnte idealerweise verwendet werden, um Ultrahochfeld-MRT Atlanten auf beste Führer der klinischen Diagnose von Gewebe in Gesundheit oder Krankheit zu erzeugen.
Einige wichtige Schritte sind wichtig zu beachten, um die Erfassung und Verarbeitung Variabilität zwischen und innerhalb Thema Datensätzen zu verringern. Ideal abgeglichen Datensequenzen zu erhalten, sollten die gleichen MRI-Scanner und Sequenztyp während der Studie verwendet werden. Postmortem Hirngewebe ist oft von unterschiedlicher Qualität; kritische Faktoren wie die Todesursache Obduktionsintervalls Qualität der Perfusion und die Länge der Zeit in Fixiermittel können alle Anfärben Wirksamkeit und die Notwendigkeit für einen EinflussAntigen-Retrieval-Protokoll. Darüber hinaus ist die Größe des menschlichen Gehirns erfordert mehrere Slice Abschnitte mit jeder Scheibe erfordern weitere Manipulation auf, die die Regionen von Interesse Gewebe zu erhalten. Daher ist es entscheidend, dass der Ort und die Ausrichtung der einzelnen Abschnitte ist deutlich gekennzeichnet und aufgezeichnet. Letztendlich ist das Hauptproblem bei postmortalen Gewebeanalyse genau das - es ist Obduktion - und bietet daher nur eine Momentaufnahme des Gewebes am Ende des Lebens. Verbesserte multimodalen Bildgebungsverfahren ist für die Echtzeit-Analyse von Änderungen an Hirnstrukturen und morpho-funktionelle Informationen mit zellulärer Auflösung erforderlich.
Maus-Studien ermöglichen Verhör des Menschs variable durch variable und nicht präsentieren viele der Schwierigkeiten gefunden, wenn mit menschlichem Gewebe. Verwendet werden, um menschliche Krankheiten oder Verletzungen zu modellieren durch die Analyse von Kausalstrukturdynamik Maus Studien können Verbesserungen für Krankheit-Modell val bietendierung. Jedoch sollte speziesspezifische Unterschiede angemerkt werden. In unserer Analyse der lateralen Ventrikel, ist es wichtig zu beachten, dass Mäuse, behalten eine aktive Stammzellen Nischen entlang der Seitenwand der Seitenventrikel und Stamm-Zell-vermittelte regenerative Reparatur der Auskleidung der Herzkammer in den Fällen von bescheidener ependymalen Zellverlust auftritt, wie in alten Mäusen gefunden wird oder wenn beschränkt ependymaler Zell Denudation durch Belichtung des Ependym tritt auf Neuraminidase 19. Im Gegensatz dazu sind die Menschen nicht eine robuste Stammzellnische halten entlang der Seitenventrikel Wände 25-27 und, wenn überhaupt, Regeneration wahrscheinlich ist. Im Gegensatz zu älteren Mäusen, im Alter von Menschen zeigen umfangreiche Astrogliose an der Herzkammer Oberfläche mit Ventrikel Expansion 6 verbunden. Dieses Niveau der Entblößung und "Narben" des Ventrikels Futter kann in der Maus mit Neuraminidase, um die Auskleidung der Ventrikel Ependymzellen 6,28 entblößen modelliert werden. Darüber hinaus ist es wichtig zu erkennen, thbei Vivarium gepflegt Mäusen nicht erleben Infektionen, Krankheit oder Trauma, präsentiert eine ganz andere medizinische Geschichte von den meisten Menschen. Außerdem Mäusen in der Regel nicht altersbedingte neurodegenerative Erkrankung, Ventrikulomegalie oder periventrikuläre Gliose zeigen. Deshalb, um diese Phänotypen sie müssen modelliert werden zu beobachten. Letztlich kann kein Tiermodell vollständig rekapitulieren die Ontogenese, Pathophysiologie und symptomatische Komplexität der menschlichen Krankheit und diese Beschränkungen müssen anerkannt werden und ordnungsgemäß mitgeteilt.
Zusammenfassend stellen wir Techniken und Protokolle zur lateralen Ventrikel Volumina in Mäusen und Menschen zu bewerten. Herzkammern können in 3D gerendert und Langzeitanalyse ermöglicht Erstellung von Raumzeit-Volumenänderungen. Zusätzlich mit paarGehirnGewebe zeigen wir, wie zelluläre Funktionen können zu Veränderungen Ventrikel Volumina verbunden werden. Jüngste Ergebnisse zeigen, erhöhte Aquaporin-4-Expression in Bereichen periventricular Gliose vorschlagen, Ödeme an den Ventrikel Oberfläche. Daher zukünftige Untersuchungen Paarung FLAIR-MRI mit Gewebe Histologie wird unser Verständnis der CSF und interstitielle Flüssigkeitsaustausch zu verbessern, und bieten wichtige Informationen über Herzkammer des Systemzustands und wie seine Verschlechterung wirkt sich auf verschiedene Hirnfunktionen.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Life Technologies | 21600-069 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 19210 | Use at 4% in PBS, 4 °C |
| Normal Horse Serum | Life Technologies | 16050 | 10% in PBS-TX (v/v) |
| Normal Goat Serum | Life Technologies | 16210 | 10% in PBS-TX (v/v) |
| Triton X-100 (TX) | Sigma-Aldrich | T8787 | 0.1% in PBS (v/v) |
| Vibratome | Leica | VT1000S | |
| Fluorescence Microscope | Zeiss | Imager.M2 | |
| Camera | Hamamatsu | ORCA R2 | |
| Microscope Stage Controller | Ludl Electronic Products | MAC 6000 | |
| Stereology software | MBF Bioscience | Stereo Investigator 11 | |
| Stereology software | ImageJ/NIH | NIH freeware | |
| 3D Reconstruction software | MBF Bioscience | Neurolucida Explorer | |
| Confocal Microscope | Leica | TCS SP2 | |
| MRI Software | |||
| Freesurfer | https://surfer.nmr.mgh.harvard.edu/fswiki/DownloadAndInstall | Segmentation and Volume | |
| ITK-Snap | http://www.itksnap.org/pmwiki/pmwiki.php | Segmentation and Volume | |
| Multi-image Analysis GUI (Mango) | http://ric.uthscsa.edu/mango/ | Longitudinal overlay | |
| Whole Mount Equipment | |||
| 22.5° microsurgical straight stab knife | Fisher Scientific | NC9854830 | |
| parafilm | |||
| wax bottom dissecting dish | |||
| pins | |||
| fine forceps | |||
| aquapolymount | |||
| Dissecting Microscope | Leica | MZ95 | |
| Whole Mount Antibodies | |||
| mouse anti-b-catenin | BD Bioschiences, San Jose, CA, USA | 1:250 | |
| goat anti-GFAP | Santa Cruz Biotechnology | 1:250 | |
| rabbit anti-AQP4 (aquaporin-4) | Sigma-Aldrich | 1:400 | |
| Coronal Antibodies | |||
| Anti-S100β antibody | Sigma-Aldrich | 1:500 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Life Technologies | D-1306 | 10 µg/ml in PBS |
References
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