Introduction
En ependymala cellmonoskiktet linjer kammarsystemet i hjärnan som ger dubbelriktad barriär och transportfunktioner mellan cerebrospinalvätskan (CSF) och interstitiell vätska (ISF) 1-3. Dessa funktioner hjälper till att hålla hjärnan toxikanten fria och i fysiologisk balans 2,3. Hos människa förlust av delar av detta foder på grund av skada eller sjukdom inte tycks resultera i regenerativ ersättning som återfinns i andra epitelceller foder; snarare förlust av ependymala celltäckning tycks resultera i periventrikulär astroglios med nätverket av astrocyter som omfattar regioner avklädda av ependymalceller på ventrikeln ytan. Allvarliga konsekvenser för viktiga CSF / ISF utbyte och klare mekanismer skulle förväntas resultera från förlust av denna epitelskikt 1,2,4-7.
Ett gemensamt drag för människans åldrande förstoras laterala ventriklarna (ventriculomegaly) och tillhörande periventrikulär ödem som Observed av MRI och vätske försvagade inversion återhämtning MRI (MRI / FLAIR) 8-14. För att undersöka förhållandet mellan ventriculomegaly och den cellulära organisationen av ventrikeln foder, var postmortem humana MRI sekvenser matchas med histologiska preparat av laterala ventrikeln periventrikulär vävnad. Vid ventriculomegaly hade stora områden av glios ersättas ependymal cell täckning längs den laterala ventrikeln väggen. När ventrikeln expansionen inte upptäcktes med MRI-baserade volymanalys, det ependymala cellfodret var intakt och gliosis inte upptäcks längs kammaren foder 6. Denna kombi tillvägagångssätt representerar de första omfattande dokumentation som beskriver förändringar i cellulär integritet den laterala ventrikeln foder med hjälp av wholemount beredningar av delar eller hela sido ventrikelväggen och 3D-modellering av ventrikeln volymer 6. Flera sjukdomar (Alzheimers sjukdom, schizofreni) och skador (traumatisk hjärnskada)visa ventriculomegaly som en tidig neuropatologiska funktion. Denudation områden av ependymal cellfodret därigenom skulle förutsägas att störa normala ependymal cellfunktion och äventyra den homeostatiska balansen mellan CSF / ISF vätska och lösta ämnen utbyte. Således kommer en mer grundlig undersökning av förändringar i ventrikulära systemet, dess cellulära sammansättning, och följden till underliggande eller närliggande hjärnstrukturer slutligen börja avslöja mer om neuropatologi i samband med ventrikeln utvidgningen.
Bristen på multimodala bilddata, särskilt longitudinella datasekvenser, tillsammans med begränsad tillgång till motsvarande histologiska vävnadsprover gör analys av mänskliga hjärnan patologier svårt. Modellering fenotyper som finns i människans åldrande eller sjukdom kan ofta uppnås med musmodeller och djurmodeller blivit en av våra bästa sättet att utforska frågor om mänskliga sjukdomar initiering och progression. Flera studier ifriska unga möss har beskrivit cytoarchitecture av sidoväggarna ventrikeln och den underliggande stamcellsnischen 4,7-15. Dessa studier har utökats till att omfatta 3D-modellering och cellulär analys av ventrikeln väggarna genom åldrande 6,15. Varken periventrikulär glios eller ventriculomegaly observeras i äldre möss, snarare möss visar en relativt robust subventicular zon (SVZ) stamceller nisch underliggande till en intakt ependymal cell foder 6,15. Således finns slående artspecifika skillnader i både allmänt underhåll och integritet den laterala ventrikeln foder under åldrandet 6,15. Därför att du ska utnyttja möss att förhöra villkor som finns i människor, skillnader mellan de två arterna måste karakteriseras och på lämpligt sätt beaktas i alla modellerings paradigm. Här presenterar vi rutiner för att utvärdera längsgående förändringar de laterala ventriklarna och tillhörande periventrikulär vävnad hos både människor och mouse. Våra rutiner inkluderar 3D-rendering och volumetry både mus och mänskliga kamrarna, och användning av immunhistokemisk analys av hela berget beredningar av periventrikulär vävnad för att karakterisera både cellulär organisation och struktur. Tillsammans dessa förfaranden ger ett medel för att karakterisera förändringar i ventrikulära systemet och tillhörande periventrikulär vävnad.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: djurförsök godkändes av University of Connecticut IACUC och överensstämmer med NIH riktlinjer. Mänskliga vävnader och dataanalys och förfaranden var i överensstämmelse med och godkänts av University of Connecticut IRB och överensstämmer med NIH riktlinjer.
1. Mus: Analys av periventrikulär cellulär integritet och 3D-modellering av den laterala ventrikeln
1.1) Framställning av mus laterala ventrikeln väggen hela Mounts
- Förbered mus laterala ventrikeln hela fästen för immunohistokemi (IHC) som tidigare beskrivits 16,17.
1.2) Immunohistokemi för laterala ventrikeln Analys
- Fix och avsnitt musen hjärnvävnad som tidigare beskrivits 18,19.
- I korthet, skölj möss transkardiellt med normal rumstemperatur saltlösning, tills organ har rensat (indikeras av en blek färg), följt av rumstemperatur 4% paraformaldehyd(PFA) i 0,1 M fosfat-buffrad saltlösning (PBS) tills vävnaden har stelnat.
- Ta hjärnan från skallen. Använd iris dissekering sax för att klippa från basen av skallen längs sagittala suturen.
- Exponera skallen och ta bort hjärnan med pincett. Doppa hjärnan i 4% PFA fixativ över natten vid 4 ° C. Tvätta sedan 3 gånger under 20 min med PBS.
- Förbered seriesnitt för immunohistokemi och volymanalys.
- Med hjälp av en mikro skalpell, gör ett litet snitt i längdriktningen längs cortex av vänster hjärnhalva för att möjliggöra identifiering av den vänstra hjärnhalvan från den högra hjärnhalvan när flytande sektioner immunostained.
- Innesluta fasta hjärnor i 3% agaros för extra strukturellt stöd under vibratome sektionering. Varm 3% agaros i destillerat vatten (vikt / vol) till fullständig upplösning med användning av antingen en mikrovågsugn eller värmeplatta.
- Med ett rakblad, avlägsna den kaudala delen av hjärnan vid cerebellum med enkoronalt snitt, vilket ger en plan och jämn yta. Applicera superlim till vävnaden scenen och placera hjärnan på nyklippt ytan med luktsinnet glödlampor vända uppåt.
- När flytande agaros lösningen svalnat till en temperatur strax varm vid beröring, applicera jämnt över hjärnan för att fullständigt innesluta hela hjärnan. Låt agarosen att stelna.
- Avsnitt agaros inneslutna hjärnor koronalt på en vibratome i 50 um sektioner med sektioner placerade i serie i en 24-brunnar innehåller PBS i syfte att bevara ordningsföljd.
OBS: Generellt 12 brunnar används för en hjärna, med insamling av vävnad börjar 5 sektioner innan du ser uppkomsten av de laterala ventriklarna börjar med väl A1, flytta numeriskt genom att B6 och cykla tillbaka till A1. Detta gör att flera urskiljbara delar från samma hjärna som ska behandlas inom samma brunn. För sido analys ventrikeln volym, upphörde vävnadssamling när den laterala ventrikelns och tredje ventrikeln samman, vilket resulterar i cirka 3 sektioner per brunn eller 36 sektioner totalt. - Aspirera PBS med hjälp av en överföringspipett fäst med en 20-200 pl mikropipett tips för att säkerställa att flytande sektioner inte av misstag sugs. Block och permeabilisera flytande sektioner i 10% serum, 0,1% Triton X-100 (TX) i PBS (PBS-TX) under en timme vid rumstemperatur. Använd 300 pl lösning per brunn för att täcka fritt flytande vävnadssnitt i en 24-brunnar och utföra alla inkubationer i avsnitten på en gungande platta.
- Aspirera den blockerande lösningen och inkubera sektioner med primära antikroppar i PBS-TX över natten (minst 12 timmar) vid 4 ° C. För ventrikeln volym spår med hjälp av koronalt sektioner, använd anti-S100β antikropp för att märka ependymalceller.
- Sug primära antikroppen lösning och tvätta avsnitt 3 gånger under 10 minuter vardera med PBS-TX.
- Inkubera avsnitt i mörker under 1 timme vid rums temperature med fluorescerande sekundära antikroppar, vid koncentrationer av 1: 1000 i 10% serum, PBS-TX. Håll avsnitt i mörkret för alla återstående inkubationssteg.
- Aspirera sekundär antikroppslösning och inkubera sektioner med 4 ', 6-diamidino-2-fenylindol i PBS (DAPI, 10 | ig / ml) i 5 min för att motfärga cellkärnor. Aspirera DAPI lösningen och skölj avsnitt 3 gånger under 10 minuter vardera med PBS.
- Mount sektioner seriellt på bilder med hjälp av kortikala varumärket att bevara vänster kontra högra hjärnhalvan orientering. Lufttorka sektioner i mörker och sedan täck genom att tillämpa ett tunt lager av monterings media till bilden och försiktigt placera ett täckglas ovanpå. Låt täckglasen torka över natten vid rumstemperatur.
1.3) laterala ventrikeln Segmentering för 3D Rekonstruktioner
OBS: Utför spårning av laterala ventriklarna att använda kartprogram på en upprätt epifluorescence microscope med en automatiserad stadium och en digital CCD-kamera för fluorescensdetektering.
- Slå på fluorescensmikroskop utrustning och lansera kartprogram i fluorescens-läge. Öppna "Visningsalternativ" för att ladda rätt verktygsfält och dockningsverktygstavlor som behövs för att spåra. Val> Visningsalternativ> Tillbehör och välj "Main" och "Marker" verktygsfält. I samma meny, välj "Kamera Histogram", "Multichannel Control", "Kamerainställningar" och "bildtagning" under "Docking verktygstavlor."
- Följ början av kamrarna baserat på stark S-100β fluorescens som märker ependymala celler som klär den laterala ventrikeln. Identifiera den första bit vävnad innehållande de laterala ventriklama.
- Skapa en ny datafil och utse en referenspunkt för steg rörelse genom att klicka på bildfönstret ovanför vänster laterala ventrikeln. Leta efter den lillasnitt för att orientera vänster från högra hjärnhalvan. Håll referenspunkten på ett konsekvent läge i förhållande till de laterala ventriklama över spåra filer för att hjälpa när du importerar konturer för seriell rekonstruktion.
- Välj lämplig förinställd kontur typ från konturen rullgardinsmenyn, t.ex. "Left laterala ventrikeln." Använd en unik färg för varje vänster och höger sido kurvor ventrikeln. Om ändringar i konturen namn och färg krävs, gå till Alternativ> Visnings Inställningar> konturer, sedan ändra namnen på de konturfärger eller välj "Lägg till Contour Type".
- Med "vänster laterala ventrikeln" kontur markerat klickar längs apikalytan av ependymala foder för att börja spåra kontur. Trace ventrikeln genom att fortsätta att klicka successivt längs apikalytan.
- För oregelbundna områden som kräver mer finess, klicka och håll nere vänster musknapp för att spåra fria händer. Tryck på Ctrl + Z, eller gå to Val> Ångra för att ångra föregående konturpunkten. Flytta spåra fönstret med piltangenterna eller genom att göra en konturpunkten utanför skärmen och låta fönstret för att automatiskt centrera sig. För att avsluta ventrikeln spåra högerklicka och välj "Stäng Contour".
- Välj en ny kontur färg (kontur typ) för rätt laterala ventrikeln med hjälp av rullgardinsmenyn. Trace höger kammare som i steg 1.3.4 för vänster.
- Om ändringar i konturen namn och färg krävs, högerklicka på konturen och välj Byt Contour Type för att välja rätt färg.
- Lägg markörer längs mittlinjen för att underlätta anpassningen serie konturer för 3D-rekonstruktion. För att lägga till markörer, välj lämplig markör (använd "X") från Markörer menyn till vänster och klicka för att släppa dem på spårning skärmen. Import markörer tillsammans med konturerna för varje vävnadssnitt spår.
- Om du vill spara vävnads spår, väljer du Arkiv> SparaDatafil som och skapa en ny mapp och filnamn. Antal kurvorna [slide #] - [vävnads #] för enkel identifiering av spår från seriesnitt. Till exempel, har den tredje vävnadssnitt på den andra sidan filnamnet "2-3" i katalogen för varje hjärna.
- Upprepa steg 1.3.4 till 1.3.9 för varje serie delen av hjärnvävnad att spåra kamrarna genom hela hjärnan, exklusive regioner ventrikelväggen vidhäftning.
- Om ventrikeln har ett område av vidhäftning, delsegment den främre regionen från de dorsala och ventrala till det adhesionsplatskontrollerande. Skapa två nya typer kontur för varje kammare (t.ex. "Rygg vänster kammares" och "ventrala vänster kammares"). På den första vävnads skiva med vidhäftning, spåra den laterala ventrikeln med både den ursprungliga sidokontur ventrikeln och den nya dorsala och ventrala konturer för att säkerställa en komplett ventrikel rekonstruktion kan skapas.
- I avsnitten posteriort en ventricle vägg vidhäftning, skapa en uppsättning nya kontur färger för den bakre delen av varje kammare (t.ex. "posterior vänster kammares"). Dubbel spåra den första re-joined sektion med både nuvarande vidhäftning och nya typer bakre konturen.
1,4) laterala ventrikeln 3D rekonstruktion
- Rikta och sammanställa seriekontur kurvor på musen i sidled kamrarna att generera 3D-rekonstruktioner och volymuppgifter.
- Öppna 3D-återuppbyggnadsprogram. Klicka på Arkiv> Öppna och välj konturfilen för den första spårade serie avsnitt. Importera kontur kurvor för vänster och höger kammare samt eventuella tillsatta markörer.
- För att välja konturer, klicka på 'Select Objects knappen (markör ikonen) och välj de två kamrarna och markörer genom att hålla "Ctrl". För att fastställa Z-position av konturerna, högerklicka och välj "Ändra Z Position". Ställ in den första vävnaden slice till 0 pm. <li> Om du vill spara återuppbyggnaden genom att välja Arkiv> Spara datafil som. Spara efter varje fil import, så om ett misstag görs återhämtning är lika enkelt som åter laddar föregående fil.
- Om du vill lägga till nästa vävnaden slice till återuppbyggnaden, klickar du på Arkiv> Bifoga till Visa. Välj DAT fil som ska bifogas, och kontrollera "Merge" rutan.
- Följ steg 1.4.3 för att åter justera Z-position för den nyligen importerade spårningsfilen. Välj bara de nytillkomna vänster och höger konturerna i huvudfönstret för att undvika att flytta andra spår. Ställ in varje successiv spårningsfil till 50 um från Z position där det tidigare konturen för 50 um sektioner. (Första kontur: z = 0, andra kontur: z = 50, tredje kontur: z = 100, etc.)
- För att justera X, Y-positionen av utvalda konturer och markörer, klicka på "Aktivera översättning med musen knappen och dra konturerna för att anpassa de tidigare vävnads konturer. Håll både vänster och höger konturerna av nuvarande spår valdaför att tillåta synkron rörelse.
- Om du vill rotera spåren medsols eller motsols för att rada upp mittlinjen markörer, välj "Z-axeln rotation" -knappen. För att vända konturer över Y-axeln (om vänster konturen till höger) väljer både importerade konturer och markörer, högerklicka och välj "Set Rotationsvinkel", och ange "180" till "Y rotation".
- Se till att kamrarna och mittlinjen markörer bäst i linje innan du sparar återuppbyggnaden filen, som i steg 1.4.4.
- Upprepa steg 1.4.5 till 1.4.9 för varje efterföljande vävnad skiva tills alla har importerats och korrekt inriktade.
- Om du vill visa volymuppgifter i serie återuppbyggnad, klicka Analys> "Markörer och Region analys" och välj "3D Contour Sammanfattning". Välj alla konturer i den vänstra panelen och klicka sedan på "3D-visualisering" knappen för att visa den slutliga 3D-rekonstruktion.
2. Human: Analys av periventrikulär cellulär integritet och 3D-modellering av den laterala ventrikeln
2.1) Human MRI Data Analysis
OBS: Protokoll listas för att skapa 3D-bild rekonstruktioner och volymetriska kvantifiering av de laterala ventriklama och bedöma volymförändringar över tid med längd overlay analys. Det är viktigt att notera att konsekvent MR datainsamling (t.ex. maskin och magnet styrka, snittjocklek, orientering och upplösning) och efter förvärvet behandling är ytterst viktiga kriterier för införande av datamängder 20.
- Ventrikulär Segmente
OBS: ITK / Snap används för att segmentera kamrarna från högupplösta T1-viktade MR-bilder. Alternativt kan andra gratisprogram programvara såsom Freesurfer användas.- Öppna ITK / Snap, Arkiv> Öppna gråskalebild. Välj önskad fil och öppna som en .nii fil (NITFI fil).
- Bläddra igenom varje anatomical plan, noterar kammar avvikelser (förträngda regioner, stora eller små tids horn, etc.). I huvudverktygslådan klickar du på "Snake ROI Tool". Klicka på "Segment 3D". Välj "Intensity Region" alternativet.
- Klicka på "förbehandla bild". Välj "Above", till att även omfatta regioner under en viss intensitet tröskel för att markera ROI i vitt. Spela maximal intensitet med hjälp av skjutreglaget. Ställ in tröskelvärdet till 15% av maximal intensitet (rekord i värde). Ställ jämnhet parameter till 10. Klicka på "OK" och sedan "Nästa".
- Lägg 10-12 små (storlek 2) "bubblor" till varje ventrikel: två i den främre fronthornet, sju jämnt fördelade utmed den övre ytan av den laterala ventrikeln kroppen, en i occipital horn och en i den temporala hornet i laterala ventrikeln. "Välj parametrar" och ställ krökning kraft till 0,4. Klicka på Play Symbol för att börja aktivt kontur evolution.
- Klicka på "Uppdatera Mesh" att visualisera ytan; kontrollera "Auto-Update". Stoppa segmente när alla områden av den laterala ventrikeln ingår i regionen av intresse (ROI). Undvika införandet av den tredje ventrikeln. Klicka på "Finish".
- Manuellt redigera bilden om det är nödvändigt att avlägsna oönskade regioner av följande metoder (vanligtvis behöver radera tredje ventrikeln läckage). Använd manuellt "3D Skalpell" för att ta bort överskott regioner eller manuellt använda "Paintbrush" verktyg med "Clear Label" som den aktiva ritningen etiketten radera någon integration bortom ROI.
- Spara segmente resultat som en .nii bild (nifti "filformat).
- För att få total kammare volym, välj "Segmentering> Volym" och statistik; få den totala volymen av kammaren med hjälp av inställda färgetikett.
- Longitudinal representation laterala ventriklama Från MRIScans
OBS: AnvändaMango programvara, är längsgående ROI överlagras för att kvalitativt och kvantitativt påvisa förändringar i ventrikeln volymen inom ämnen över tiden.- Öppna mango. Klicka på Arkiv> Ladda ROI för första ROI tidpunkt (baslinjen) som GREEN. Arkiv> Ladda ROI av andra ROI tidpunkt som RED. Spara längdlagring genom att välja Arkiv> Spara som; tilldela varje bild som "fil name_ [första tidpunkt ålder] - [andra tidpunkt ålder] .nii".
- Öppna ITK-SNAP. Öppna den kombinerade ROI som "gråskala", genom att välja segmentering> Ladda Från Bild> kombinerad ROI-fil. För att få longitudinella volymuppgifter kör följande: Segmentering> Volym och statistik> Etikett 1 (röd) = volymexpansion; Etikett 2 (grön) = stenos volym; Etikett 3 (blå) = basvolym.
2.2) Human periventrikulär Vävnadsberedning och analys
- Säkerhetsanvisningar för att arbeta med mänsklig vävnad
- Erhåll appropriate säkerhetsutbildning (t ex., blodburna patogener kurs).
- Beakta standard (universella) säkerhetsåtgärder. Använd handskar. Byt handskar innan du rör någon gemensam utrustning eller ytor som inte är av engångskaraktär. Märk alla poster rutinmässigt hanteras när man arbetar med mänsklig vävnad med "mänsklig vävnad användning" beteckningar.
- Följ saneringsmetoder för alla poster i kontakt mänsklig vävnad. Bleach alla förorenade vätskor i minst 24 timmar innan det bortskaffas, behandla kontaminerade ytor med ett blekmedel blöt handduk (t.ex. bänkskiva) eller genom att placera föremål direkt i blekmedel (t ex pincett).
- Förbered beredskapsplan för kontakt med mänsklig vävnad direkt på huden, vilket kan innefatta blötläggning en pappershandduk i blekmedel och hålla på det drabbade området (5-10 min).
- Använd omhändertagande lämplig avfall för alla objekt som kommer i kontakt med mänsklig vävnad.
- Laterala ventrikeln Hela Mount Beredning
- Beginning med en intakt halvklotet (fixerades i 10% formalin och sköljas noggrant med 0,1 M PBS), skiva 1,5 cm tjocka koronala snitt genom hela halvklotet med hjälp av stor kniv.
OBS: Alla fixeringsprotokoll kräver verifiering innan antikropp. - Etikett avsnitt framifrån och bakåt börjar med första delen innehåller den laterala ventrikeln. Använd en alfanumerisk märkningssystem, märkning skivorna med bokstäver (främre till bakre) och avsnitt med siffror (uppifrån och ned). Undvik att störa ependymal yta.
- Med hjälp av mikro skalpell dissekera ventrikelväggen 1 cm djupt, att upprätthålla en kontinuerlig sektion för hela sidovägg. Dela upp väggen som behövs för att skapa lämplig storlek sektioner för färgning väl. Notch avsnitt på motsatt sida av ventrikelväggen att identifiera överlägsen / sämre orientering.
- Utför antigenåtervinning genom att inkubera vävnadssnitt i 10 mM natrium-citratbuffert (pH 6,0) vid 100 ° C under 10 till 20 min med användning av en dubbel boiler (optimala inkubationstiden bestäms empiriskt). Skölj tre gånger i PBS / 0,1% Triton X-100 (PBS-TX).
- Block i 10% hästserum med användning av PBS / PBS-TX under 1 h vid rumstemperatur.
- Inkubera med primära antikroppar för 48 h vid 4 ° C. Att visualisera ventrikelväggen foder, immunostain hela monteringar med följande antikroppskombinationer: mus-anti-β-catenin (1: 250); get-anti-GFAP (1: 250); kanin-anti-AQP4 (1: 400).
- Utför alla efterföljande steg i mörker. Skölj vävnaden tre gånger i PBS, inkubera med sekundära antikroppar (1: 500) under 24 h vid 4 ° C eller 2 timmar vid rumstemperatur, och skölj ytterligare tre gånger i PBS. Inkubera vävnad i DAPI under 7 minuter vid rumstemperatur följt med ytterligare tre sköljningar i PBS.
- Förbered vävnad för sista dissektion genom att täcka ett vax nedre skålen med parafilm. Fyll skålen med PBS, placera vävnaden i skålen med fin pincett, undvika att ta kontakt med ependymal vägg.
- Enligt dissekera mikroskop, fast SECUre vävnad på sin sida med hjälp av stift. Med en 22,5 ° mikro stab kniv, skapa enhetliga tunna sektioner (ca 300 um tjock) i sidled ventrikelväggen. För stora delar eller sektioner med svår krökning, skuren i mindre kuber innan styckning i slut sektioner för montering och notera platsen.
- Placera försiktigt dissekerade avsnitt ependymceller uppåt på bilden med hjälp av fin pincett, tagit del av regionala plats och orientering på bilden. Täck vävnad med tunt lager av aquapolymount, var noga med att undvika bubblor. Placera täck över vävnaden, lägga till ytterligare aquapolymount som behövs för att fylla eventuella luckor i täck.
- Placera monterade sektioner i mörka och torra under 2-3 dagar vid rumstemperatur. Lagra i slidebox vid 4 ° C.
- Beginning med en intakt halvklotet (fixerades i 10% formalin och sköljas noggrant med 0,1 M PBS), skiva 1,5 cm tjocka koronala snitt genom hela halvklotet med hjälp av stor kniv.
- Immunohistokemi och Histologisk analys
- Använda konfokalmikroskopi att visa fluorescerande immunohistokemi, ställa bild fokalplan på ventrikeln ytan, bestämd med användning of β-catenin (markör för apikala adherens proteiner av ependymalceller). Avgränsa regioner ependymal nättäckning och yta astroglios (GFAP färgning vid ventrikel yta).
- Att dokumentera och montage hela ventrikeln ytan, använd överlappande bilder för att täcka hela ytan. För att skapa montage av seriebilder, öppna Adobe Photoshop. Använd Arkiv> Automatisera> Photomerge> Interaktiv layout för att välja bilder att överlappa, vilket gör manuella justeringar om det behövs.
- Skapa nytt lager att spåra montage att generera tecknad representation av intakt ependymceller nättäckning eller ventrikeln ytan glios. Upprepa för varje bild eller ROI. Sammanställa alla sektioner för att rekonstruera karta över ventrikelväggen och länk till motsvarande region på MR återuppbyggnad.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Contour spårning av musen laterala ventriklarna baserade på immun 50 pm koronala sektioner och 3D rekonstruktioner (Figur 3) kan volymdata som ska samlas in i olika experimentella paradigm med musen som ett modellsystem för sjukdom eller skada. Avgörande för detta förfarande är att utesluta regioner där sidoväggarna ventrikeln vidhäftar till varandra. Genom subsegmenting regioner kamrarna och utse en annan färg för varje region (Figur 3C), kan angränsande delar följas och regional och totalvolym kan beräknas utifrån sammanställts delsegment.
Liknande studier kan utföras med hjälp av magnetröntgen av hjärnan tillsammans med halvautomatisk segmente (ITK-SNAP) av de laterala ventriklama för 3D renderingar. För direkt hopkoppling av ventrikeln volymer och periventrikulär vävnadsanalys, före eller efter slakt MRT är segmenteras och anpassas för att skapa 3D-rekonstruktioner (
Figur 1: Utföra laterala ventrikeln segmente använder ITK / Snap Snake ROI Tool (A) "Bubbles" läggas till laterala ventriklarna. (B) "Bubbles" expandera under aktiv kontur evolution. (C) Segmentering är klar när hela laterala ventrikeln är fylld. (Försiktighet vidtas för att undvika den 3: e ventrikeln.)
Figur 2: Human sido ventrikelväggen dissektion (
Figur 3: Spåra och 3D-rekonstruktion av mus laterala ventriklarna (A Coronal mushjärna avsnitt inklusive laterala ventriklarna, som beskrivs av S100β-immunoreaktiva ependymalceller (*, laterala ventriklama, fäste, region adhE. sionen; skala bar, 500 nm). (B) Mus laterala ventriklarna spåras som "konturer" och arrangeras som undersegmente sektioner, exklusive regioner intraventrikulär vidhäftning stör volymetriska analyser. (C) 3D-rekonstruktion laterala konturer ventrikeln. Gul, konturen av hela hjärnan volym som spänner över området av intresse som innehåller de laterala ventriklarna.
Figur 4: MRI-baserade laterala ventrikeln segmente (A) MR-bilder monteras. (B) laterala ventrikeln definieras som ROI (röd). (C) 3D bildrekonstruktion möjliggör volymetriska kvantifiering och kvalitativ visualisering av laterala ventrikeln.
annons / 52328 / 52328fig5highres.jpg "/>
Figur 5: Bedömning av längsgående kammare expansionsLängsGående MRI från flera punkter kan anpassas och över att visualisera och kvantifiera ventrikeln volymexpansion inom ämnen över tiden.
Figur 6: Immunohistokemisk utvärdering och regional kartläggning av humant sidoyta ventrikeln (A) Områden i intakta ependymceller celler, beskrivs av β-katenin-färgning visar en gatsten utseende (asterisk) och avgränsas med en streckad linje från regioner av astroglios på ventrikeln ytan (GFAP + färgning). (B) Serie konfokala bilder överlagras för att skapa en regional montage och spåras med hjälp av Adobe Photoshop för en tecknad representation av cellulär organisation ventrikeln ytan. (C) Tecknad film avbild montage mappas till ventrikeln yta motsvarande MRI baserad 3D ventrikeln rekonstruktion. (Skalstreck (A), 40 ^ m; Skalstreck (B), en mm)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi presenterar verktyg och protokoll som kan användas för att utvärdera integriteten hos hjärnans ventrikulära systemet i möss och hos människor. Dessa verktyg kan emellertid också tillämpas på andra hjärnstrukturer eller organsystem som genomgår förändringar på grund av skada, sjukdom, eller under åldrandet 14,21,22. Strategierna presenteras dra nytta av programvara som gör det möjligt att anpassningen av tvärsnitts och longitudinella MRI sekvenser för att generera 3D volym representationer av specifika regioner eller strukturer av intresse. Längsgående MRI sekvenser tillåter sammanställning av 3D volymförändringar som sker över tid och kan utökas till att omfatta total hjärnvolym, för laterala ventrikeln till totala hjärnvolym förhållanden, och / eller andra hjärnstrukturer (t.ex. nucleus nucleus 23 eller corpus callosum vita substansen skrifter med hjälp av diffusion vägda tensor imaging). Tillsammans kan genomföras en omfattande analys av hjärn strukturella förändringar. I slutändan,att utvärdera åldersrelaterade och sjukdomsrelaterade förändringar i hjärnans strukturer en samling av multimodala avbildningstekniker behövs för att ge den mest rättvisande bild av hjärnans hälsotillstånd 24. Dokumentation och sammanställning av kritiska strukturella uppgifter, tillsammans med ämnes ämne variabilitet och utbudet av variationen mellan individer, skulle med fördel kunna användas för att generera ultrahög fält MRI atlaser till bästa guide klinisk diagnos av vävnad i hälsa eller sjukdom.
Flera viktiga steg är viktigt att notera för att minska förvärv och förädling variabilitet mellan och inom ämnesdatamängder. Helst att få matchade datasekvenser, bör samma magnetkamera och sekvens typ användas under hela studien. Obduktion hjärnvävnad är ofta av varierande kvalitet; kritiska faktorer såsom dödsorsaken, efter döden intervall, kvaliteten på perfusion, och tid i fixativ alla kan påverka färgning effekt och behovet av enantigenåtervinning protokoll. Dessutom har storleken av den mänskliga hjärnan kräver flera slice sektioner med varje skiva som kräver ytterligare manipulation för att erhålla vävnad som innehåller de regioner av intresse. Därför, är det kritiskt att läget och orienteringen av varje sektion är tydligt märkta och registreras. Ytterst är det primära problemet med döden vävnadsanalys just det - det är döden - och därför ger bara en ögonblicksbild bild av vävnaden vid livets slut. Förbättrade multimodala avbildningstekniker krävs för realtidsanalys av förändringar i hjärnans strukturer och morfologiska-funktionell information med cellulär upplösning.
Mus studier tillåter förhör av människans villkor variabel genom variabel och inte utgör många av de svårigheter som finns när man arbetar med mänsklig vävnad. Mus studier som används för att modellera mänsklig sjukdom eller skada genom analys av kausala strukturdynamik kan erbjuda förbättringar för sjukdomsmodell valsolideringen. Bör emellertid artspecifika skillnader noteras. I vår analys av de laterala ventriklama, är det viktigt att notera att möss behålla en aktiv stamcellsnischen längs den laterala väggen hos de laterala ventriklarna och stamceller medierad regenerativ reparation av ventrikeln fodret uppträder i fall av måttlig ependymceller cellförlust, såsom finns i äldre möss eller när begränsad ependymal cell denudation sker genom exponering av ependymceller att neuraminidas 19. Däremot har människor inte behålla en robust stamcells nisch längs den laterala ventrikeln väggarna 25-27 och lite, om något, regenerering är sannolik. Till skillnad från åldrade möss, i åldern människor visar omfattande astroglios på ventrikeln ytan i samband med ventrikeln expansionen 6. Denna nivå av denudation och "ärrbildning" av ventrikeln fodret kan modelleras i musen med neuraminidas att beröva kammaren slemhinnan i ependymalceller 6,28. Dessutom är det viktigt att inse thpå vivarium hållna möss inte upplever infektioner, sjukdom eller trauma, presenterar en mycket annorlunda sjukdomshistoria från de flesta människor. Dessutom möss normalt inte visar åldersrelaterad neurodegenerativ sjukdom, ventriculomegaly eller periventrikulär glios. Därför, att följa dessa fenotyper de måste modelleras. I slutändan kan ingen djurmodell helt rekapitulera ontogenin, patofysiologi och symtomatisk komplexiteten av sjukdomar hos människor och dessa begränsningar måste erkännas och korrekt meddelas.
Sammanfattningsvis presenterar vi metoder och protokoll för att bedöma sido volymer ventrikeln i mus och människa. Kamrarna kan göras i 3D och längsgående analys möjliggör sammanställning av Spatiotemporal volymförändringar. Dessutom, med hjälp av parade hjärnvävnad visar vi hur cellulära funktioner kan kopplas till förändringar i ventrikeln volymer. Nya resultat som visar ökade nivåer av Aquaporin-4 expression i områden av periventricular glios tyder ödem längs ventrikeln ytan. Därför framtida undersökningar para ihop FLAIR-MRI med vävnads histologi kommer att förbättra vår förståelse av CSF och interstitiell vätska utbyte, och ger viktig information om ventrikeln systemet hälsa och hur den försämras påverkar olika hjärnfunktioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Life Technologies | 21600-069 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 19210 | Use at 4% in PBS, 4 °C |
| Normal Horse Serum | Life Technologies | 16050 | 10% in PBS-TX (v/v) |
| Normal Goat Serum | Life Technologies | 16210 | 10% in PBS-TX (v/v) |
| Triton X-100 (TX) | Sigma-Aldrich | T8787 | 0.1% in PBS (v/v) |
| Vibratome | Leica | VT1000S | |
| Fluorescence Microscope | Zeiss | Imager.M2 | |
| Camera | Hamamatsu | ORCA R2 | |
| Microscope Stage Controller | Ludl Electronic Products | MAC 6000 | |
| Stereology software | MBF Bioscience | Stereo Investigator 11 | |
| Stereology software | ImageJ/NIH | NIH freeware | |
| 3D Reconstruction software | MBF Bioscience | Neurolucida Explorer | |
| Confocal Microscope | Leica | TCS SP2 | |
| MRI Software | |||
| Freesurfer | https://surfer.nmr.mgh.harvard.edu/fswiki/DownloadAndInstall | Segmentation and Volume | |
| ITK-Snap | http://www.itksnap.org/pmwiki/pmwiki.php | Segmentation and Volume | |
| Multi-image Analysis GUI (Mango) | http://ric.uthscsa.edu/mango/ | Longitudinal overlay | |
| Whole Mount Equipment | |||
| 22.5° microsurgical straight stab knife | Fisher Scientific | NC9854830 | |
| parafilm | |||
| wax bottom dissecting dish | |||
| pins | |||
| fine forceps | |||
| aquapolymount | |||
| Dissecting Microscope | Leica | MZ95 | |
| Whole Mount Antibodies | |||
| mouse anti-b-catenin | BD Bioschiences, San Jose, CA, USA | 1:250 | |
| goat anti-GFAP | Santa Cruz Biotechnology | 1:250 | |
| rabbit anti-AQP4 (aquaporin-4) | Sigma-Aldrich | 1:400 | |
| Coronal Antibodies | |||
| Anti-S100β antibody | Sigma-Aldrich | 1:500 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Life Technologies | D-1306 | 10 µg/ml in PBS |
References
- Del Bigio, M. R. Ependymal cells: biology and pathology. Acta Neuropathol. 119, 55-73 (2010).
- Johanson, C., et al. The distributional nexus of choroid plexus to cerebrospinal fluid, ependyma and brain: toxicologic/pathologic phenomena, periventricular destabilization, and lesion spread. Toxicol Pathol. 39, 186-212 (2011).
- Roales-Bujan, R., et al. Astrocytes acquire morphological and functional characteristics of ependymal cells following disruption of ependyma in hydrocephalus. Acta Neuropathologica. 124, 531-546 (2012).
- Cserr, H. F.
- Iliff, J. J., et al. A paravascular pathway facilitates CSF flow through the brain parenchyma and the clearance of interstitial solutes, including amyloid beta. Science Translational Medicine. 4, 147ra111 (2012).
- Shook, B. A., et al. Ventriculomegaly associated with ependymal gliosis and declines in barrier integrity in the aging human and mouse brain. Aging Cell. , (2013).
- Xie, L., et al. Sleep drives metabolite clearance from the adult brain. Science. 342, 373-377 (2013).
- Fazekas, F., et al. Pathologic correlates of incidental MRI white matter signal hyperintensities. Neurology. 43, 1683-1689 (1993).
- Meier-Ruge, W., Ulrich, J., Bruhlmann, M., Meier, E. Age-related white matter atrophy in the human brain. Ann N Y Acad Sci. 673, 260-269 (1992).
- Resnick, S. M., Pham, D. L., Kraut, M. A., Zonderman, A. B., Davatzikos, C. Longitudinal magnetic resonance imaging studies of older adults: a shrinking brain. The Journal Of Neuroscience : The Official Journal Of The Society For Neuroscience. 23, 3295-3301 (2003).
- Sener, R. N. Callosal changes in obstructive hydrocephalus: observations with FLAIR imaging, and diffusion MRI. Comput Med Imaging Graph. 26, 333-337 (2002).
- Sze, G., et al. Foci of MRI signal (pseudo lesions) anterior to the frontal horns: histologic correlations of a normal finding. AJR Am J Roentgenol. 147, 331-337 (1986).
- Tisell, M., et al. Shunt surgery in patients with hydrocephalus and white matter changes. Journal of Neurosurgery. 114, 1432-1438 (2011).
- Valdes Hernandez Mdel, C., et al. Automatic segmentation of brain white matter and white matter lesions in normal aging: comparison of five multispectral techniques. Magn Reson Imaging. 30, 222-229 (2012).
- Shook, B. A., Manz, D. H., Peters, J. J., Kang, S., Conover, J. C. Spatiotemporal changes to the subventricular zone stem cell pool through aging. The Journal of Neuroscience : The Official Journal Of The Society For Neuroscience. 32, 6947-6956 (2012).
- Mirzadeh, Z., Merkle, F. T., Soriano-Navarro, M., Garcia-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. Neural stem cells confer unique pinwheel architecture to the ventricular surface in neurogenic regions of the adult brain. Cell Stem Cell. 3, 265-278 (2008).
- Mirzadeh, Z., Doetsch, F., Sawamoto, K., Wichterle, H., Alvarez-Buylla, A. The subventricular zone en-face: wholemount staining and ependymal flow. J Vis Exp. , (2010).
- Luo, J., Daniels, S. B., Lennington, J. B., Notti, R. Q., Conover, J. C. The aging neurogenic subventricular zone. Aging Cell. 5, 139-152 (2006).
- Luo, J., Shook, B. A., Daniels, S. B., Conover, J. C. Subventricular zone-mediated ependyma repair in the adult mammalian brain. J Neurosci. 28, 3804-3813 (2008).
- Marcus, D. S., Fotenos, A. F., Csernansky, J. G., Morris, J. C., Buckner, R. L. Open access series of imaging studies: longitudinal MRI data in nondemented and demented older adults. J Cogn Neurosci. 22, 2677-2684 (2010).
- Giorgio, A., De Stefano, N.
- Caspers, S., et al. Studying variability in human brain aging in a population-based German cohort-rationale and design of 1000BRAINS. Front Aging Neurosci. 6, 149 (2014).
- Keuken, M. C., et al. Ultra-high 7T MRI of structural age-related changes of the subthalamic nucleus. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33, 4896-4900 (2013).
- Marti-Bonmati, L., Sopena, R., Bartumeus, P., Sopena, P.
- Bergmann, O., et al. The age of olfactory bulb neurons in humans. Neuron. 74, 634-639 (2012).
- Sanai, N., et al. Corridors of migrating neurons in the human brain and their decline during infancy. Nature. 478, 382-386 (2011).
- Wang, C., et al. Identification and characterization of neuroblasts in the subventricular zone and rostral migratory stream of the adult human brain. Cell Res. 21, 1534-1550 (2011).
- Carmen Gomez-Roldan, D. el, M,, et al. Neuroblast proliferation on the surface of the adult rat striatal wall after focal ependymal loss by intracerebroventricular injection of neuraminidase. The Journal of Comparative Neurology. 507, 1571-1587 (2008).
