Introduction
En ependymal cellemonolag linjer ventrikkel systemet i hjernen som gir toveis barriere og transportfunksjoner mellom cerebrospinalvæsken (CSF) og interstitiell væske (ISF) 1-3. Disse funksjonene bidrar til å holde hjernen giftstoffet frie og i fysiologisk balanse 2,3. Hos mennesker tap av deler av denne foring på grunn av skade eller sykdom synes ikke å resultere i regenerativ erstatning som finnes i andre epitel foringer; heller tap av ependymal celle dekning synes å resultere i periventricular astrogliosis med en nettvare av astrocytter som dekker områder ribbet for ependymal celler ved ventrikkelen overflaten. Alvorlige konsekvenser på viktige CSF / ISF valutakurser og rydnings mekanismer ville bli spådd å skyldes tap av denne epitellaget 1,2,4-7.
Et fellestrekk ved menneskelig aldring er forstørret sideventriklene (ventriculomegaly) og tilhørende periventricular ødem som observatøred ved MR og væske svekket inversjon recovery MR (MRI / FLAIR) 8-14. For å undersøke forholdet mellom ventriculomegaly og mobil organisering av ventrikkelen fôr, ble postmortem menneskelige MR sekvenser matchet med histologiske preparater av lateral ventrikkel periventricular vev. I tilfeller av ventriculomegaly, hadde betydelige områder av gliose erstattet ependymal celle dekning langs side ventrikkel veggen. Når ventrikkel utvidelse ikke ble oppdaget av MRI-baserte volumanalyse, den ependymal celleforingen var intakt og gliose ble ikke påvist langs ventrikkel fôr 6. Dette kombi tilnærming representerer de første omfattende dokumentasjon detaljering endringer i cellulær integritet laterale ventrikkel fôr bruker wholemount preparater av deler eller hele laterale ventrikkel vegg og 3D modellering av ventrikkel volumer 6. Flere sykdommer (Alzheimers sykdom, schizofreni) og skader (traumatisk hjerneskade)vise ventriculomegaly som en tidlig nevropatologiske trekk. Denudasjon områder av ependymal celleforingen dermed ville bli spådd å forstyrre normal ependymal cellefunksjon og kompromittere homeostatic balanse mellom CSF / ISF væske og oppløst stoff utveksling. Dermed vil en grundigere undersøkelse av endringer i ventrikkel systemet, dets cellulære sammensetningen, og konsekvensen til underliggende eller nabo strukturer i hjernen til slutt begynne å avsløre mer om nevropatologi forbundet med ventrikkel utvidelse.
Mangelen på multimodale bildedata, særlig langsgående datasekvenser sammen med begrenset tilgang til tilsvarende histologiske vevsprøver gjør analyse av humane hjernesykdommer vanskelig. Modellering fenotyper funnet i menneskelig aldring eller sykdom kan ofte oppnås med musemodeller og dyremodeller blitt en av våre beste middel til å utforske spørsmål om menneskelig sykdom initiering og progresjon. Flere studier påfriske unge mus har beskrevet cytoarchitecture av laterale ventrikkel vegger og underliggende stamcelle nisje 4,7-15. Disse studiene har blitt utvidet til å inkludere 3D-modellering og cellulær analyse av ventrikkelen veggene gjennom aldring 6,15. Verken periventricular gliose heller ventriculomegaly er observert hos eldre mus, snarere mus viser en relativt robust subventicular sone (SVZ) stamcelle nisje underliggende til en intakt ependymal celle fôr 6,15. Således slående artsspesifikke forskjeller i både generelt vedlikehold og integriteten av den laterale ventrikkel slimhinnen i løpet av aldringsprosessen 6,15. Derfor, for å sikre best mulig utnyttelse mus å avhøre betingelser som finnes hos mennesker, forskjeller mellom de to artene må være preget og hensiktsmessig betraktes i enhver modellering paradigme. Her presenterer vi rutiner for å evaluere langsgående endringer i sideventriklene og tilhørende periventricular vev i både mennesker og mOuse. Våre prosedyrer inkluderer 3D-gjengivelse og volumetri av både mus og menneske ventriklene, og bruk av immunhistokjemisk analyse av hele mount preparater av periventricular vev for å karakterisere både mobilnettet organisering og struktur. Sammen danner disse fremgangsmåtene gir et middel til å karakterisere endringer i det ventrikulære systemet og tilhørende periventricular vev.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Animal prosedyrene ble godkjent av University of Connecticut IACUC og i samsvar med NIH retningslinjer. Menneskelig vev og dataanalyse og prosedyrer var i samsvar med og godkjent av University of Connecticut IRB og i samsvar med NIH retningslinjer.
1. Mus: Analyse av periventricular Cellular Integritet og 3D modellering av Lateral ventrikkel
1.1) Fremstilling av Muse lateral ventrikkel Vegg Hele Mounts
- Forbered muse laterale ventrikkel hele mounts for immunhistokjemi (IHC) som tidligere beskrevet 16,17.
1.2) Immunhistokjemi for Lateral ventrikkel Analysis
- Fix og § mus hjernevev som tidligere beskrevet 18,19.
- I korthet strakt mus tran med normal romtemperatur saltvann, inntil organene har fjernet (indikert med en blek farge), etterfulgt ved romtemperatur 4% paraformaldehyd(PFA) i 0,1 M fosfat-bufret saltløsning (PBS) til vev har stivnet.
- Fjern hjernen fra skallen. Bruk iris disseksjon saks til å klippe fra bunnen av hodeskallen langs sagittal sutur.
- Expose skallen og fjerne hjernen med pinsett. Fordyp hjernen i 4% PFA fiksativ natten ved 4 ° C. Deretter vaskes tre ganger i 20 minutter med PBS.
- Forberede seriesnitt for immunhistokjemi og volumanalyse.
- Ved hjelp av en mikro skalpell, gjør et lite snitt i lengderetningen langs cortex av venstre hemisfære for å tillate identifisering av venstre hemisfære fra høyre hemisfære når flyteseksjoner immunostained.
- Omslutter fast hjerner i 3% agarose for ekstra strukturell støtte under vibratome snitting. Varm 3% agarose i destillert vann (w / v) inntil det er fullstendig oppløst ved hjelp av enten en mikrobølgeovn eller kokeplate.
- Med et barberblad, fjerner kaudal delen av hjernen ved cerebellum med enkoronale cut, etterlot seg en flat og jevn overflate. Påfør superlim til vevet scenen og posisjonere hjernen på nyklippet overflaten med olfactory pærer vendt oppover.
- Når flytende agarose løsning er avkjølt til en temperatur like varmt å ta på, påføre jevnt over hele hjernen til fullstendig omslutter hele hjernen. La agarose for å størkne.
- § agarose innkapslet hjerner coronally på en vibratome til 50 mikrometer seksjoner, med deler som er lagt inn i serie i en 24-brønners plate inneholdende PBS for å bevare sekvensiell rekkefølge.
NOTE: Generelt 12 brønner brukes til en hjerne, med samling av vev som begynner 5 seksjoner før til å se fremveksten av laterale ventrikler begynner med godt A1, beveger numerisk gjennom til B6 og sykling tilbake til A1. Dette gjør at flere seksjoner kan skjelnes fra den samme hjernen som skal behandles i den samme brønnen. For laterale ventrikkel volumanalyse, vev samling opphørt når den laterale ventrikkels og tredje ventrikkel fusjonere, noe som resulterer i ca 3 seksjoner per brønn eller 36 deler totalt. - Aspirer PBS ved hjelp av en overføring pipette festet med en 20-200 mL mikropipette tips for å sikre at flytende seksjoner ikke er et uhell aspirert. Blokk og permeabilize flyteseksjoner i 10% serum, 0,1% Triton X-100 (TX) i PBS (PBS-TX) i 1 time ved romtemperatur. Bruk 300 ul oppløsning per brønn for å dekke frittflytende vevssnitt i en 24-brønns plate og utføre alle inkubasjoner av seksjonene på en gynge plate.
- Aspirer blokkeringsløsning og inkuber seksjoner med primære antistoffer i PBS-TX natten over (minst 12 timer) ved 4 ° C. For ventrikkel volum spor ved hjelp koronalsnitt, bruke anti-S100β antistoff å merke ependymal celler.
- Aspirer primær antistoffløsning, og vaskes tre ganger seksjoner i 10 minutter hver med PBS-TX.
- Inkuber seksjoner i mørket for en time på rommet temperature med fluorescerende sekundære antistoffer, ved konsentrasjoner på 1: 1000 i 10% serum, PBS-TX. Hold seksjonene i mørket for alle gjenværende ruge trinn.
- Aspirer sekundære antistoff-løsning og inkuberes seksjoner med 4 ', 6-diamidino-2-fenylindol i PBS (DAPI, 10 ug / ml) i 5 minutter for å counterstain cellekjerner. Aspirer DAPI og skyll §§ 3 ganger for 10 min hver med PBS.
- Mount seksjoner i serie bort på lysbilder ved hjelp av kortikale mark for å bevare venstre versus høyre hjernehalvdelen orientering. Lufttørke delene i mørket og deretter dekkglass ved å påføre et tynt lag med monterings media til lysbildet og forsiktig plassere et glass dekkglass på toppen. Tillat coverslipped lysbilder å tørke over natten ved værelsestemperatur.
1.3) Lateral ventrikkel Segmentering for 3D rekonstruksjoner
MERK: Utfør sporing av sideventriklene bruker kartprogramvare på en oppreist epifluorescence mikroskop,pe med en automatisert scene og et digitalt CCD-kamera for fluorescensdeteksjon.
- Slå på fluorescens mikroskop utstyr og starte kartlegging programvare i fluorescens modus. Åpne "Visningsalternativer" for å laste riktig verktøylinjer og docking verktøypaneler som trengs for å spore. Valg> Visningsvalg> Tilbehør og velg "Main" og "Marker" verktøylinjer. I den samme menyen, velg "Camera Histogram ',' Multichannel Kontroll ',' Kamerainnstillinger" og "image oppkjøpet" under "Docking Verktøy paneler.
- Observere begynnelsen av ventriklene basert på sterke S-100β fluorescens som merker ependymal cellene på lateral ventrikkel. Bestemme første stykke vev som inneholder de laterale ventrikler.
- Opprett en ny datafil og utpeke et referansepunkt for scenen bevegelse ved å klikke i bildevinduet ovenfor venstre lateral ventrikkel. Se etter den lilleSnittet for å orientere venstre fra høyre hjernehalvdelen. Hold referansepunktet på en konsekvent plassering i forhold til sideventriklene over tracing filer for å hjelpe når du importerer konturer for serie gjenoppbygging.
- Velg riktig innstilt kontur type fra konturen nedtrekksmenyen, f.eks 'Venstre Lateral ventrikkel. Bruk en unik farge for hver av de venstre og høyre side ventrikkel tracings. Dersom endringer i konturen navn og farge er nødvendig, gå til Valg> Skjerminnstillinger> Contours, deretter endre navnene på kote farger eller velg 'Legg Contour Type'.
- Med "Venstre Lateral ventrikkel 'contour valgt, klikker langs den apikale overflaten av ependymal fôr for å starte kurven kontur. Spore ventrikkelen ved å fortsette å klikke suksessivt langs apikale overflaten.
- For uregelmessige områder som krever mer finesse, klikk og hold venstre museknapp for å spore frie hender. Trykk Ctrl + Z, eller gå to Valg> Angre for å angre den forrige kontur punktet. Flytt tracing vinduet ved hjelp av piltastene eller ved å lage en kontur peke av skjermen og lar vinduet for å automatisk sentrere seg selv. For å fullføre ventrikkel tracing høyreklikk og velg "Close Contour '.
- Velg en ny kontur farge (kontur type) for høyre laterale ventrikkel ved hjelp av rullegardinmenyen. Trace høyre ventrikkel som i trinn 1.3.4 for venstre.
- Dersom endringer i konturen navn og farge er nødvendig, høyreklikk på kontur og velg Endre Contour Type for å velge riktig farge.
- Legg markører langs midtlinjen for å bistå i å samkjøre serie konturer for 3D rekonstruksjon. For å legge til markører, velg riktig markør (bruk "X") fra Markers verktøylinjen til venstre og klikk for å slippe dem på tracing skjermen. Import markører sammen med konturene for hver vev seksjon spor.
- Hvis du vil lagre vev spor, velger du Fil> LagreDatafil As og opprette en ny mappe og filnavn. Nummer de tracings [lysbilde #] - [vev #] for enkel identifisering av spor fra seriesnitt. For eksempel har den tredje vev delen på den andre lysbildet filnavnet '2-3' i katalogen for hver hjerne.
- Gjenta trinn 1.3.4 til 1.3.9 for hvert serie delen av hjernevev å spore ventriklene gjennom hele hjernen, med unntak av regionene i ventrikkel veggen heft.
- Dersom ventrikkel har en region av adhesjon, sub-segment fremre region fra de dorsale og ventrale til adhesjonen området. Opprette to nye høydetyper for hver ventrikkel (f.eks 'Dorsal Venstre ventrikkel »og« Ventral Venstre ventrikkel'). På den første vev skive med heft, spore den laterale ventrikkel med både den opprinnelige laterale ventrikkel kontur og den nye rygg og ventral konturer for å sikre en komplett ventrikkel gjenoppbygging kan opprettes.
- I avsnittene posterior til en ventricle veggen heft, lage et sett med nye kontur farger for den bakre delen av hver ventrikkel (f.eks 'bakre venstre ventrikkel'). Dobbelt spore denne første re-sluttet seksjon med både nåværende vedheft og nye bakre kontur typer.
1.4) Lateral ventrikkel 3D Reconstruction
- Rett og kompilere seriekote tracings av musen laterale ventriklene til å generere 3D rekonstruksjoner og volumetriske data.
- Åpne 3D rekonstruksjon program. Klikk på Fil> Åpne, og velg kontur fil av den første spores serie delen. Importere contour tracings for venstre og høyre ventrikkel samt noen ekstra markører.
- For å velge konturer, klikker du 'Select Objects' knappen (markøren ikonet), og velge de to ventriklene og markører ved å holde "Ctrl". Å etablere Z stilling konturene, høyreklikk og velg 'Endre Z Position ". Sett første vev skive til 0 mikrometer. <li> Hvis du vil lagre gjenoppbygging, velg Fil> Lagre datafil som. Lagre etter hver fil import, så hvis en feil blir gjort utvinning er like enkelt som å re-lasting av forrige fil.
- For å legge til neste vev slice til gjenoppbygging, klikk på Fil> Tilføy til Display. Velg DAT-filen som skal legges, og sjekke den "Merge" -boksen.
- Følg trinn 1.4.3 til igjen justere Z posisjonen til nylig importert sporingsfilen. Velger kun de nylig lagt venstre og høyre konturer i hovedvinduet for å unngå å flytte de andre spor. Sett hver påfølgende spor fil til 50 um fra den Z-posisjonen av den foregående kontur for 50 pm seksjoner. (Første kontur: z = 0, andre konturen: z = 50, tredje kontur: z = 100, etc.)
- For å justere X, Y posisjon av utvalgte konturer og markører, klikker du på "Aktiver Oversettelse med museknappen og dra konturene å justere med tidligere vev konturer. Hold både venstre og høyre konturene av dagens trase velgeså tillate synkron bevegelse.
- Å rotere spor med eller mot klokken for å stille opp midtlinje markører, velg 'Z-akse Rotasjon "-knappen. Å vende konturer over Y-aksen (hvis venstre konturen er på høyre) velge både importerte konturer og markører, høyreklikk, velg "Set Rotation Angle", og skriv inn '180' i 'Y rotasjon ".
- Sørg for at ventriklene og midtlinje markører er best justert før du lagrer gjenoppbygging fil, som i trinn 1.4.4.
- Gjenta trinn 1.4.5 til 1.4.9 for hver påfølgende vev skive før alt er importert og riktig justert.
- For å vise volum data i serie gjenoppbygging, klikk Analyse> 'Markører og Region Analysis "og velg" 3D Contour Sammendrag ". Velg alle konturer i venstre panel og klikk deretter på '3D Visualisering' knappen for å vise den endelige 3D rekonstruksjon.
2. Menneskelig: Analyse av periventricular Cellular Integritet og 3D modellering av Lateral ventrikkel
2.1) Menneskelig MR dataanalyse
MERK: Protokoller er oppført for å skape 3D-bilde rekonstruksjoner og volumetrisk kvantifisering av sideventriklene og vurdere volumetriske endringer over tid ved hjelp av lengde overlay-analyse. Det er viktig å merke seg at konsistens i MR datainnsamling (f.eks, maskin og magnet styrke, seksjon tykkelse, orientering og oppløsning) og post-oppkjøpet behandlingen er svært viktige kriterier for inkludering av datasett 20.
- Ventrikkel Segmentering
MERK: ITK / Snap brukes til å segmentere ventriklene fra høyoppløselige T1-vektet MR-bilder. Alternativt kan andre freeware programvare som Freesurfer brukes.- Åpne ITK / Snap, File> Open gråtonebilde. Velg ønsket fil og åpne som en .nii fil (NITFI fil).
- Bla gjennom hver anatomical flyet, og merk deg ventrikkel abnormiteter (forsnevrede regioner, store eller små timelige horn, etc.). I Verktøykassa klikk "Snake ROI Tool". Klikk "Segment 3D". Velg "Intensity Region alternativet.
- Klikk "preprocess Bilde '. Velg "Above", til å omfatte områder under en viss intensitet terskel for å markere ROI i hvitt. Spill maksimal intensitet ved hjelp av glide bar. Sett terskelen til 15% av maksimal intensitet (rekord denne verdien). Still glatthet parameter til 10. Klikk "OK", deretter "Neste".
- Legg 10-12 liten (størrelse 2) "bobler" til hver ventrikkel: to i det fremre frontpartiet horn, syv jevnt fordelt langs den overlegne overflaten av den laterale ventrikkel legeme, en i occipital horn og en i det tidsmessige horn av lateral ventrikkel. 'Velg Parametere "og satt krumning kraft til 0,4. Klikk på Play Symbol å begynne aktivt kontur evolusjon.
- Klikk "Oppdater Mesh" for å visualisere overflaten; sjekk 'Auto-Update ". Stopp segmentering når alle områder av den laterale ventrikkel er inkludert i regionen av interesse (ROI). Unngå inklusjon av den tredje ventrikkel. Klikk "Finish".
- Redigere bildet manuelt hvis det er nødvendig for å fjerne uønskede områder av følgende metoder (vanligvis må slette tredje ventrikkel lekkasje). Manuelt bruke '3D Scalpel "verktøy for å fjerne overflødig regioner eller manuelt bruke" Paintbrush "verktøy med" Clear etikett "som aktiv tegning etiketten for å slette alle inkludering utover avkastning.
- Lagre segmenteringsresultatene som en .nii bilde ('Nifti' file format).
- For å oppnå total ventrikkel volum, velg 'Segmentering> Volum' og statistikk; få det totale volum av ventrikkelen ved hjelp av etiketten set farge.
- Langsgående representasjon av sideventriklene Fra MRIScans
MERK: BrukMango programvare, er langsgående Rois kledde til kvalitativt og kvantitativt viser endringer i ventrikkel volum innenfor fag over tid.- Åpne Mango. Klikk på Fil> Last ROI av første ROI tidspunkt (baseline) som GRØNN. Fil> Last ROI av andre ROI tidspunkt som RØD. Spar lengde overlegg ved å velge Fil> Lagre som; tildele hvert bilde som "file name_ [første tidspunktet alder] - [andre tidspunkt alder] .nii '.
- Åpne ITK-SNAP. Gjenåpne den kombinerte ROI som 'gråskala bilde', ved å velge Segmentering> Load Fra bilde> kombinert ROI-fil. For å få longitudinelle volumdata kjøre følgende: Segmentering> Volum og statistikk> Etikett 1 (rød) = utvidelse volum; Etikett 2 (grønn) = stenose volum; Label 3 (blå) = basisvolum.
2.2) Menneskelig periventricular Vevspreparering og analyse
- Sikkerhetsregler for å jobbe med menneskelig vev
- Skaff hensiktsmessigsikkerhetsopplæring (f.eks., blodbårne patogener selvfølgelig).
- Observere standard (universal) sikkerhetsregler. Bruk hansker. Skift hansker før du berører noen felles utstyr eller flater som ikke er disponibel. Merke noen produkter rutinemessig håndteres når du arbeider med menneskelig vev med 'menneskelig vev bruk' betegnelser.
- Følg dekontaminering praksis for alle elementer i kontakt menneskelig vev. Bleach alle forurensede væsker i minst 24 timer før avhending, behandle forurensede overflater med et blekemiddel fuktet håndkle (f.eks benk øverst) eller ved å plassere objektet direkte i blekemiddel (f.eks tang).
- Forbered beredskapsplan for kontakt med menneskelig vev direkte på huden, som kan inkludere soaking et papirhåndkle i blekemiddel og holder på det berørte området (5-10 min).
- Bruk egnet avfalls for alle elementer som kommer i kontakt med menneskelig vev.
- Lateral ventrikkel Whole Mount Forberedelse
- Beginning med en intakt halvkule (fast i 10% formalin og skylles grundig med 0,1 M PBS), skjære 1,5 cm tykke koronalsnitt gjennom hele halvkule bruker stor kniv.
MERK: Alle feste protokoller krever forutgående antistoff verifisering. - Merk seksjoner foran til bak starter med første delen inneholder den laterale ventrikkel. Bruk en alfanumerisk merkeordning, merking skivene med bokstaver (anterior til posterior) og ledd med tall (ovenfra og ned). Unngå å forstyrre ependymal overflaten.
- Ved hjelp av mikro skalpell, dissekere ventrikkel veggen 1 cm dypt, opprettholde en kontinuerlig seksjon for hele sideveggen. Dele veggen som trengs for å skape riktig størrelse seksjoner for farging godt. § hakk på motsatt side av ventrikkel veggen for å identifisere overlegen / dårligere orientering.
- Utføre antigen gjenfinning ved inkubering av vevssnittene i 10 mM natriumsitratbuffer (pH 6,0) ved 100 ° C i 10-20 min ved hjelp av en dobbel kjelerR (optimal inkubasjonstiden bestemt empirisk). Skyll 3 ganger i PBS / 0,1% Triton X-100 (PBS-TX).
- Block i 10% hesteserum ved hjelp av PBS / PBS-TX i 1 time ved romtemperatur.
- Inkuber med primære antistoffer i 48 timer ved 4 ° C. For å visualisere ventrikkel veggkledning, immunfarging av hele mounts med følgende antistoffkombinasjoner: mus anti-β-catenin (1: 250); geit-anti-GFAP (1: 250); kanin anti-AQP4 (1: 400).
- Utføre alle etterfølgende trinn i mørket. Skyll vev tre ganger i PBS, inkuberes med sekundære antistoffer (1: 500) i 24 timer ved 4 ° C eller 2 timer ved romtemperatur, og skylles ytterligere tre ganger i PBS. Inkuber vev i DAPI i 7 minutter ved romtemperatur, etterfulgt med en annen 3 skyllinger i PBS.
- Forberede vev for endelig disseksjon ved å dekke en voks bunn fatet med Parafilm. Fyll fatet med PBS, plasser vev i fatet bruker fine tang, unngå å ta kontakt med ependymal veggen.
- Under dissekere mikroskop, fast secure vev på sin side med nåler. Med en 22,5 ° mikro stikke kniven, skape ensartede tynne snitt (ca 300 mikrometer tykke) av laterale ventrikkel vegg. For store deler eller seksjoner med vanskelig kurvatur, kuttet i mindre kuber før du skjærer i siste avsnitt for montering og note plassering.
- Plasser forsiktig dissekert delen ependyma side opp på lysbildet bruker fin pinsett, ta av regional plassering og orientering på lysbildet. Dekk vev med tynt lag med aquapolymount, ta vare å unngå bobler. Plasser dekk løpet vev, legge til ekstra aquapolymount som er nødvendig for å fylle eventuelle hull etter dekkglass.
- Plasser monterte delene i mørkt og tørt i 2-3 dager ved romtemperatur. Oppbevares i slidebox ved 4 ° C.
- Beginning med en intakt halvkule (fast i 10% formalin og skylles grundig med 0,1 M PBS), skjære 1,5 cm tykke koronalsnitt gjennom hele halvkule bruker stor kniv.
- Immunhistokjemi og Histologisk analyse
- Bruke konfokalmikroskopi å vise fluorescerende immunhistokjemi, sett bildefokusplanet på ventrikkelen overflaten, som bestemmes av bruken of β-catenin (markør for apikale adherens koblings proteiner av ependymal celler). Avgrense regioner ependymal Mobildekning og overflate astrogliosis (GFAP farging på ventrikkel overflate).
- Å dokumentere og montage hele ventrikkelen overflaten, bruke overlappende bilder for å dekke hele overflaten. Å lage montasje av seriebilder, åpner Adobe Photoshop. Bruk Fil> Automatiser> Photomerge> Interaktiv layout å velge bilder å overlappe, noe som gjør manuelle justeringer om nødvendig.
- Opprett nytt lag å spore montasjen å generere tegneserie representasjon av intakt ependyma Mobildekning eller ventrikkel overflaten gliose. Gjenta for hvert bilde eller avkastning. Samle alle delene til å rekonstruere kartet ventrikkel veggen og link til tilsvarende region på MR gjenoppbygging.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Contour sporing av muse sideventriklene basert på immunostained 50 mikrometer koronalsnitt og 3D rekonstruksjoner (figur 3) gjør volumdata skal samles i ulike eksperimentelle paradigmer bruker mus som modellsystem for sykdom eller skade. Kritisk for denne prosedyren er utelukkelse av områder der de laterale ventrikkel veggene holder seg til hverandre. Ved subsegmenting regioner i ventriklene og utpeke en annen farge for hver region (Figur 3C), kan sammenhengende seksjoner holdes og regionale og totalt volum kan beregnes ut fra samlet subsegmenter.
Lignende studier kan utføres ved hjelp MR av hjernen sammen med semi-automatisert segmentering (ITK-SNAP) av sideventriklene for 3D-gjengivelser. For direkte sammenkobling av ventrikkel volumer og periventricular vev analyse, pre- eller post-mortem MR er segmentert og innrettet for å skape 3D-rekonstruksjoner (
Figur 1: Utføre lateral ventrikkel segmentering bruker ITK / Snap Snake ROI Tool (A) 'Bubbles' er lagt til laterale ventriklene. (B) 'Bubbles' ekspandere under aktiv kontur evolusjon. (C) Segmentering er ferdig når hele den laterale ventrikkel fylles. (Care er tatt for å unngå 3. ventrikkel.)
Figur 2: Humant lateral ventrikkel vegg disseksjon (
Figur 3: Sporing og 3D rekonstruksjon av mus sideventriklene (A koronal mus hjernen seksjonen inklusive sideventriklene, skissert av S100β-immunreaktive ependymal celler (*, sideventriklene, brakett, regionen adhe. sion; skala bar, 500 mikrometer). (B) Muse sideventriklene spores som "konturer" og arrangeres som sub-segmentert seksjoner, med unntak av områder av intraventrikulær vedheft forstyrrer volumetrisk analyse. (C) 3D rekonstruksjon av laterale ventrikkel konturer. Gul, konturen av hele hjernen volum som strekker seg over området av interesse inneholder de laterale ventrikler.
Figur 4: MRI-baserte lateral ventrikkel segmentering (A) MR-bilder er montert. (B) Lateral ventrikkel er definert som ROI (rød). (C) 3D-bilde gjør det mulig for rekonstruksjon volumetrisk kvantifisering og visualisering av kvalitativ lateral ventrikkel.
ad / 52328 / 52328fig5highres.jpg "/>
Figur 5: Vurdering av lengde ventrikkel ekspansjon Langsgående MRI fra flere punkter kan justeres og kledde å visualisere og kvantifisere ventrikkel volum ekspansjon innenfor fag over tid.
Figur 6: Immunhistokjemisk evaluering og regional kartlegging av human lateral ventrikkel overflate (A) Områder i intakte ependyma celler, beskrevet av β-catenin flekker, viser en brostein utseende (stjerne) og er avgrenset av en stiplet linje fra regioner i astrogliosis på ventrikkelen overflaten (GFAP + farging). (B) Serial konfokale bilder er kledde å generere en regional montasje og spores ved hjelp av Adobe Photoshop for en tegneserie representasjon av cellulær organisasjon på ventrikkelen overflaten. (C) Cartoon avbilde montage er adressert til ventrikkel overflaten på tilsvarende MR basert 3D ventrikkel gjenoppbygging. (Scale bar (A), 40 mikrometer; Scale bar (B), 1 mm)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi presenterer verktøy og protokoller som kan brukes til å evaluere integriteten av hjernens ventrikulære system i mus og i mennesker. Disse verktøyene kan imidlertid også anvendes på andre strukturer i hjernen eller organsystemer som gjennomgår endringer som skyldes skade, sykdom eller under aldringsprosessen 14,21,22. Strategiene presenteres dra nytte av programvare som gjør justeringen av tverrsnitt og langsgående MR sekvenser for å generere 3D volum representasjoner av spesifikke regioner eller strukturer av interesse. Lengde MR sekvenser tillate samling av 3D volumendringer som oppstår over tid, og kan utvides til å omfatte totalt hjernevolum, for lateral ventrikkel til total hjernevolumforhold, og / eller andre strukturer i hjernen (f.eks subthalamic nucleus 23 eller corpus callosum hvit substans traktater ved hjelp av diffusjon vektet tensor imaging). Sammen kan en omfattende analyse av hjerne strukturelle endringer skal utføres. Til syvende og sist,å vurdere aldersrelaterte og sykdomsrelaterte endringer i hjernens strukturer en samling av multimodale bildeteknikker for å gi mest mulig korrekt bilde av hjernen helse status 24. Dokumentasjon og sammenstilling av kritiske konstruksjonsdata, sammen med forbehold Individuell variasjon og utvalg av variasjon på tvers av fag, kunne ideelt sett brukes til å generere ultrahøy felt MR atlas til beste guiden klinisk diagnose av vev i helse eller sykdom.
Flere kritiske trinnene er viktig å merke seg for å redusere kjøp og behandling variasjon mellom og innen fag datasett. Ideelt for å oppnå tilpassede datasekvenser, bør den samme MR-skanner og sekvenstype anvendes gjennom hele studien. Postmortem hjernevev er ofte av varierende kvalitet; kritiske faktorer som årsak til død, postmortem intervall, kvalitet av perfusjonen, og lengden av tid i fiksativ alle kan påvirke flekker effekten og behovet for enantigen gjenfinning protokollen. I tillegg er størrelsen av den menneskelige hjerne krever flere stykkeseksjoner med hver skive som krever ytterligere manipulering for å oppnå vev inneholdende områdene av interesse. Derfor er det viktig at plasseringen og orienteringen av hver seksjon er tydelig merket og registrert. Til syvende og sist er det primære problemet med post mortem vev analyse nettopp det - det er post mortem - og gir derfor bare et øyeblikksbilde av vevet på slutten av livet. Forbedret multimodale imaging teknikker er nødvendig for sanntidsanalyse av endringer i hjernestrukturer og morpho-funksjonell informasjon med mobilnettet oppløsning.
Musestudier tillate avhør av den menneskelige tilstand variabel ved variabel og ikke presentere mange av de vanskelighetene som finnes når du arbeider med menneskelig vev. Musestudier som brukes til å modellere menneskelig sykdom eller skade gjennom analyse av årsaks strukturelle dynamikk kan tilby forbedringer for sykdomsmodell validation. Imidlertid bør artsspesifikke forskjeller noteres. I vår analyse av de laterale ventrikler, er det viktig å merke seg at mus beholde en aktiv stamcelle nisje langs sideveggen av de laterale ventrikler og stamcelle-mediert regenererende reparasjon av ventrikkelen foring opptrer i tilfeller med beskjedne ependymal celletap, så funnet i eldre mus, eller ved begrenset ependymal celle denudasjon skjer gjennom påvirkning av ependyma til neuraminidase 19. I motsetning til dette, har mennesket ikke opprettholde en robust stamcelle nisje langs de laterale ventrikkel vegger 25-27 og liten, om noen, regenerering er sannsynlig. I motsetning til eldre mus, alderen mennesker, viser omfattende astrogliosis på ventrikkelen overflaten forbundet med ventrikkel utvidelse 6. Dette nivået av denudasjon og "arr" av ventrikkel slimhinnen kan modelleres i musen med neuraminidase å denude ventrikkelen slimhinnen ependymal celler 6,28. I tillegg er det viktig å erkjenne thpå Vivarium vedlikeholdt mus ikke opplever infeksjoner, sykdom eller traume, presentere en helt annen medisinsk historie fra de fleste mennesker. Videre mus vanligvis ikke vise alder-assosiert nevrodegenerativ sykdom, ventriculomegaly eller periventricular gliose. Derfor, for å observere disse fenotyper de må modelleres. Til slutt, kan ingen dyremodell fullt rekapitulere ontogeny, patofysiologi, og symptomatisk kompleksiteten av menneskelig sykdom og disse begrensningene må bli anerkjent og godt kommunisert.
I sammendraget presenterer vi teknikker og protokoller for å vurdere laterale ventrikkel volumer i mus og menneske. Ventriklene kan gjengis i 3D og lengde analyse tillater samling av tid og rom volumendringer. I tillegg bruker paret hjernevev vi demonstrere hvordan cellulære funksjoner kan knyttes til endringer i ventrikkel volumer. Nyere resultater demonstrerer økte nivåer av aquaporin-4 uttrykk i områder med periventricuLar gliose foreslår ødem langs ventrikkel overflaten. Derfor fremtidige undersøkelser sammenkobling FLAIR-MR med vev histologi vil forbedre vår forståelse av CSF og interstitiell væske veksling og gi viktig informasjon om ventrikkel system helse og hvordan dens forverring påvirker ulike hjernefunksjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Life Technologies | 21600-069 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 19210 | Use at 4% in PBS, 4 °C |
| Normal Horse Serum | Life Technologies | 16050 | 10% in PBS-TX (v/v) |
| Normal Goat Serum | Life Technologies | 16210 | 10% in PBS-TX (v/v) |
| Triton X-100 (TX) | Sigma-Aldrich | T8787 | 0.1% in PBS (v/v) |
| Vibratome | Leica | VT1000S | |
| Fluorescence Microscope | Zeiss | Imager.M2 | |
| Camera | Hamamatsu | ORCA R2 | |
| Microscope Stage Controller | Ludl Electronic Products | MAC 6000 | |
| Stereology software | MBF Bioscience | Stereo Investigator 11 | |
| Stereology software | ImageJ/NIH | NIH freeware | |
| 3D Reconstruction software | MBF Bioscience | Neurolucida Explorer | |
| Confocal Microscope | Leica | TCS SP2 | |
| MRI Software | |||
| Freesurfer | https://surfer.nmr.mgh.harvard.edu/fswiki/DownloadAndInstall | Segmentation and Volume | |
| ITK-Snap | http://www.itksnap.org/pmwiki/pmwiki.php | Segmentation and Volume | |
| Multi-image Analysis GUI (Mango) | http://ric.uthscsa.edu/mango/ | Longitudinal overlay | |
| Whole Mount Equipment | |||
| 22.5° microsurgical straight stab knife | Fisher Scientific | NC9854830 | |
| parafilm | |||
| wax bottom dissecting dish | |||
| pins | |||
| fine forceps | |||
| aquapolymount | |||
| Dissecting Microscope | Leica | MZ95 | |
| Whole Mount Antibodies | |||
| mouse anti-b-catenin | BD Bioschiences, San Jose, CA, USA | 1:250 | |
| goat anti-GFAP | Santa Cruz Biotechnology | 1:250 | |
| rabbit anti-AQP4 (aquaporin-4) | Sigma-Aldrich | 1:400 | |
| Coronal Antibodies | |||
| Anti-S100β antibody | Sigma-Aldrich | 1:500 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Life Technologies | D-1306 | 10 µg/ml in PBS |
References
- Del Bigio, M. R. Ependymal cells: biology and pathology. Acta Neuropathol. 119, 55-73 (2010).
- Johanson, C., et al. The distributional nexus of choroid plexus to cerebrospinal fluid, ependyma and brain: toxicologic/pathologic phenomena, periventricular destabilization, and lesion spread. Toxicol Pathol. 39, 186-212 (2011).
- Roales-Bujan, R., et al. Astrocytes acquire morphological and functional characteristics of ependymal cells following disruption of ependyma in hydrocephalus. Acta Neuropathologica. 124, 531-546 (2012).
- Cserr, H. F. Physiology of the choroid plexus. Physiol Rev. 51, 273-311 (1971).
- Iliff, J. J., et al. A paravascular pathway facilitates CSF flow through the brain parenchyma and the clearance of interstitial solutes, including amyloid beta. Science Translational Medicine. 4, 147ra111 (2012).
- Shook, B. A., et al. Ventriculomegaly associated with ependymal gliosis and declines in barrier integrity in the aging human and mouse brain. Aging Cell. , (2013).
- Xie, L., et al. Sleep drives metabolite clearance from the adult brain. Science. 342, 373-377 (2013).
- Fazekas, F., et al. Pathologic correlates of incidental MRI white matter signal hyperintensities. Neurology. 43, 1683-1689 (1993).
- Meier-Ruge, W., Ulrich, J., Bruhlmann, M., Meier, E. Age-related white matter atrophy in the human brain. Ann N Y Acad Sci. 673, 260-269 (1992).
- Resnick, S. M., Pham, D. L., Kraut, M. A., Zonderman, A. B., Davatzikos, C. Longitudinal magnetic resonance imaging studies of older adults: a shrinking brain. The Journal Of Neuroscience : The Official Journal Of The Society For Neuroscience. 23, 3295-3301 (2003).
- Sener, R. N. Callosal changes in obstructive hydrocephalus: observations with FLAIR imaging, and diffusion MRI. Comput Med Imaging Graph. 26, 333-337 (2002).
- Sze, G., et al. Foci of MRI signal (pseudo lesions) anterior to the frontal horns: histologic correlations of a normal finding. AJR Am J Roentgenol. 147, 331-337 (1986).
- Tisell, M., et al. Shunt surgery in patients with hydrocephalus and white matter changes. Journal of Neurosurgery. 114, 1432-1438 (2011).
- Valdes Hernandez Mdel, C., et al. Automatic segmentation of brain white matter and white matter lesions in normal aging: comparison of five multispectral techniques. Magn Reson Imaging. 30, 222-229 (2012).
- Shook, B. A., Manz, D. H., Peters, J. J., Kang, S., Conover, J. C. Spatiotemporal changes to the subventricular zone stem cell pool through aging. The Journal of Neuroscience : The Official Journal Of The Society For Neuroscience. 32, 6947-6956 (2012).
- Mirzadeh, Z., Merkle, F. T., Soriano-Navarro, M., Garcia-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. Neural stem cells confer unique pinwheel architecture to the ventricular surface in neurogenic regions of the adult brain. Cell Stem Cell. 3, 265-278 (2008).
- Mirzadeh, Z., Doetsch, F., Sawamoto, K., Wichterle, H., Alvarez-Buylla, A. The subventricular zone en-face: wholemount staining and ependymal flow. J Vis Exp. , (2010).
- Luo, J., Daniels, S. B., Lennington, J. B., Notti, R. Q., Conover, J. C. The aging neurogenic subventricular zone. Aging Cell. 5, 139-152 (2006).
- Luo, J., Shook, B. A., Daniels, S. B., Conover, J. C. Subventricular zone-mediated ependyma repair in the adult mammalian brain. J Neurosci. 28, 3804-3813 (2008).
- Marcus, D. S., Fotenos, A. F., Csernansky, J. G., Morris, J. C., Buckner, R. L. Open access series of imaging studies: longitudinal MRI data in nondemented and demented older adults. J Cogn Neurosci. 22, 2677-2684 (2010).
- Giorgio, A., De Stefano, N. Clinical use of brain volumetry. J Magn Reson Imaging. 37, 1-14 (2013).
- Caspers, S., et al. Studying variability in human brain aging in a population-based German cohort-rationale and design of 1000BRAINS. Front Aging Neurosci. 6, 149 (2014).
- Keuken, M. C., et al. Ultra-high 7T MRI of structural age-related changes of the subthalamic nucleus. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33, 4896-4900 (2013).
- Marti-Bonmati, L., Sopena, R., Bartumeus, P., Sopena, P. Multimodality imaging techniques. Contrast Media Mol Imaging. 5, 180-189 (2010).
- Bergmann, O., et al. The age of olfactory bulb neurons in humans. Neuron. 74, 634-639 (2012).
- Sanai, N., et al. Corridors of migrating neurons in the human brain and their decline during infancy. Nature. 478, 382-386 (2011).
- Wang, C., et al. Identification and characterization of neuroblasts in the subventricular zone and rostral migratory stream of the adult human brain. Cell Res. 21, 1534-1550 (2011).
- Carmen Gomez-Roldan, D. el, M,, et al. Neuroblast proliferation on the surface of the adult rat striatal wall after focal ependymal loss by intracerebroventricular injection of neuraminidase. The Journal of Comparative Neurology. 507, 1571-1587 (2008).
