Introduction
Bir ependim hücre tekli-tabakası hatları beyin omurilik sıvısı (CSF) ve interstisyel sıvının (ISF) 1-3 arasında iki yönlü engelleyici ve taşıma fonksiyonları sağlayan beyin ventriküler sistemi. Bu işlevler, beyin toxicant-özgür ve fizyolojik dengede 2,3 tutmak için yardımcı olur. Yaralanma ya da hastalık ile bu kaplama bölümlerinin insan kayıpta diğer epitelyal astarları bulunduğu gibi rejeneratif değiştirilmesine neden görünmemektedir; oldukça ependim hücre kapsama kaybı ventrikül yüzeyinde ependimal hücrelerin arındırılır bölgeleri kapsayan astrositlerde bir ağda ile periventriküler astrogliyozun neden görünmektedir. Önemli BOS / ISF değişimi ve temizlik mekanizmalarında ciddi yansımaları bu epitel tabakasının 1,2,4-7 kaybına yol açması tahmin olacaktır.
İnsan yaşlanmanın ortak bir özelliği yanal ventriküller (ventrikülomegali) ve Gözlem olarak ilişkili periventriküler ödem büyütülürMRG ve sıvı-zayıflatılmış inversiyon kurtarma MR (MRG / FLAIR) 8-14 tarafından ed. Ventrikülomegalide ve ventrikül astar hücresel organizasyon arasındaki ilişkiyi araştırmak için, postmortem insan MRG sekansları lateral ventrikül periventriküler dokusunun histolojik preparatları ile eşleştirildi. Ventrikülomegalisi durumlarda, gliozis önemli alanlar lateral ventrikül duvar boyunca ependim hücre kapsama yerini almıştı. Ventrikül genişlemesi MRI tabanlı ses analizi ile tespit edilmedi zaman ependimal hücre astar sağlam ve gliozis ventrikül astar 6 boyunca saptanmadı. Bu kombinasyon yaklaşım bölümlerinin wholemount hazırlıklarını veya tüm lateral ventrikül duvarı ve ventrikül hacimleri 6 3D modelleme kullanılarak lateral ventrikül astar hücresel bütünlük içinde ilk kapsamlı dokümantasyon detaylandırma değişiklikleri temsil eder. Çeşitli hastalıklar (Alzheimer hastalığı, şizofreni), yaralanmalar (travmatik beyin yaralanması)erken nöropatolojik bir özellik olarak ventrikülomegali göstermektedir. Böylece ependim hücre zarının alanlarının denüdasyon, normal ependim hücre fonksiyonu ile müdahale ve BOS / ISF sıvısı ve çözünen değişimi arasındaki homeostatik dengeyi tehlikeye tahmin olacaktır. Böylece, altta yatan ya da komşu beyin yapıları ventriküler sistemi, hücresel kompozisyonu ve sonuç değişiklikler daha kapsamlı bir inceleme sonunda ventrikül genişlemesi ile ilişkili nöropatolojisi hakkında daha fazla ortaya çıkarmak için başlayacak.
Birlikte histolojik doku örnekleri karşılık gelen sınırlı erişime sahip multimodal görüntüleme veri eksikliği ve özellikle boyuna veri dizileri, insan beyni patolojilerin analizi zorlaştırır. İnsan yaşlanması veya hastalığa bulunan Modelleme fenotipleri genellikle fare modelleri ile elde edilebilir ve hayvan modelleri, insan hastalık başlangıcında ve ilerlemesinde ilgili soruları keşfetmek için bizim en iyi araçlardan biri haline gelmiştir. Çeşitli çalışmalarSağlıklı genç fareler lateral ventrikül duvarlarının hücre mimarisini ve temel kök hücre niş 4,7-15 tarif var. Bu çalışmalar 6.15 yaşlanma yoluyla ventrikül duvarlarının 3D modelleme ve hücresel analiz içerecek şekilde genişletilmiştir. Farenin nispeten sağlam bir subventicular bölgesi (SVZ) 6,15 astar dokunulmamış ependim hücreden hücreye niş bitişiktir kök göstermek yerine periventriküler gliozis de ventrikülomegali ne, yaşlı farelerde görülür. Böylece, çarpıcı türe özgü farklılıklar 6.15 yaşlanma sürecinde genel bakım ve lateral ventrikül astar bütünlüğü hem de mevcuttur. Bu nedenle, insanlarda bulunan koşullarını sorgulamak için en iyi kullanım farelere, iki türün arasındaki farklar karakterize ve uygun herhangi bir modelleme paradigmasında dikkate alınması gerekir. Burada, her iki insan ve m lateral ventriküllerin uzunlamasına değişiklikler ve ilgili periventriküler doku değerlendirmek için prosedürler sunuyoruzouse. Bizim prosedürler hücresel organizasyon yapısı ve hem de karakterize etmek 3D render ve fare ve insan ventriküllerin hem volumetriye ve periventriküler dokusunun bütün montaj hazırlıkları immünohistokimyasal analizi kullanımını içerir. Birlikte bu işlemler ventriküler sistemindeki değişiklikleri ve ilgili periventriküler doku karakterize bir yol sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: Hayvan prosedürleri Connecticut IACUC Üniversitesi tarafından onaylanan ve NIH kurallara uygun bulundu. İnsan doku ve veri analizi ve prosedürleri ile uyumlu ve Connecticut IRB Üniversitesi tarafından onaylanan ve NIH kurallarına uygundur.
1. Fare: Yanal Ventrikül Periventriküler Hücresel Dürüstlük ve 3D Modelleme Analizi
Fare Yanal Ventrikül Duvar Tüm Mounts 1.1) hazırlanması
- Immünhistokimyasal (İHK) için fare lateral ventrikül bütün bağlar hazırlayın önceden 16,17 nitelendirdi.
Yanal Ventrikül Analizi 1.2) İmmünohistokimya
- Daha önce 18,19 açıklandığı gibi Fix ve bölüm fare beyin dokusu.
- Organları (açık renk ile belirtilir) ayrılana kadar kısa süreli, transkardiyal Normal ile aynı hizada fareler, oda sıcaklığında tuzlu su, oda sıcaklığı% 4 paraformaldehid, ardındanDoku kadar 0.1 M fosfat tamponlu tuzlu su içinde (PFA) (PBS) sertleştirilmiş bulunmaktadır.
- Kafatası beyin çıkarın. Sagital sütür boyunca kafatası tabanından kesmek için iris diseksiyon makas kullanın.
- Kafatası maruz ve forseps ile beyin kaldırmak. Gece boyunca 4 ° C 'de% 4 PFA sabitleştirici beyin bırakın. Daha sonra PBS ile 20 dakika boyunca 3 kez yıkayın.
- İmmünohistokimyada ve hacim analizi için seri bölümleri hazırlayın.
- Bir mikrocerrahi neşter kullanılarak, yüzer bölümleri immunohistokimyasal zaman sağ hemisfer sol hemisfer kimlik izin uzunlamasına sol hemisfer korteks boyunca küçük bir kesi yapmak.
- Vibratome kesit sırasında ilave yapısal destek için% 3 agaroz beyinleri sabit örten. Damıtılmış su içinde sıcak bir% 3 agaroz (ağ / hac) kadar tamamen bir mikrodalga ya da sıcak plaka kullanılarak çözündürüldü.
- Bir jilet ile, ile beyincik beynin kuyruk kısmını kaldırındüz ve hatta yüzey bırakarak koronal kesim. Doku sahneye süper tutkal sürün ve yukarı bakacak koku ampuller ile yeni kesilmiş yüzeyinde beyin yerleştirin.
- Sıvı agaroz çözüm dokunmak sadece sıcak bir sıcaklığa soğuduğunda, tamamen tüm beyin örten beyin üzerinde eşit uygulanır. Agaroz katılaşmaya izin verin.
- Bölüm agaroz sıralı sırasını korumak amacıyla PBS ihtiva eden bir 24-çukurlu plaka içinde seri yerleştirilmiş bölümlerle, 50 um bölümler halinde bir vibratome üzerinde koronal beyin kaplı.
NOT: Genellikle 12 kuyu, kuyu A1 ile başlayan lateral ventriküllerin çıkmasını görmeye B6 aracılığıyla sayısal hareket ve geri A1 bisiklet öncesinde 5 bölümden başlayarak doku koleksiyonu ile, tek beyinde kullanılmaktadır. Aynı beynin birden fazla ayırt bölümleri aynı kuyunun içinde işleme izin verir. Lateral ventrikül hacmi analizi için doku toplama kesildiği yan ventriküls ve kuyu başına yaklaşık 3 bölümden veya 36 bölümlerde toplamda sonuçlanan üçüncü ventrikül birleştirme. - Yüzen bölümler kazayla aspire emin olmak için bir 20-200 ul mikropipet ucu ile yapıştırılmış bir transfer pipet kullanarak PBS aspire. Blok ve% 10 serum yüzen bölümler geçirgenliği,% 0.1, oda sıcaklığında 1 saat boyunca PBS içinde Triton X-100 (TX) (PBS-TX). 24 oyuklu bir plaka içerisinde serbest yüzen doku bölümleri kapak ve sallanan bir plaka bölümlere tüm inkubasyon yapmak için oyuk başına çözeltisi 300 ul kullanın.
- Bloke çözeltisi aspire ve 4 ° C'de, PBS-TX gece boyunca (en az 12 saat) 'de primer antikor ile bölümleri inkübe edin. Koronal bölümleri kullanarak ventrikül hacmi izleri için, ependimal hücreleri etiketlemek için anti-S100β antikoru kullanın.
- Aspire birincil antikor çözümü ve PBS-TX ile bölümlerinin 10 dakika boyunca 3 kez her yıkayın.
- Oda tempera 1 saat boyunca karanlıkta inkübe bölümler1 konsantrasyonlarda, floresan ikincil antikorlarla Ture: 1000,% 10 serum, PBS-TX. Kalan tüm inkübasyon adımlar için karanlıkta bölümleri tutun.
- Aspire ikincil antikor çözeltisi ve 5 dakika hücre çekirdekleri counterstain için PBS içinde 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI, 10 ug / ml) ile bölümler kuluçkalayın. DAPI çözüm aspire ve PBS ile bölümlerinin 10 dakika boyunca 3 kez her durulayın.
- Kortikal işareti kullanarak slaytlar üzerine seri Dağı bölümleri sağ hemisfer yönelimi karşı sola korumak için. Yavaşça slayt montaj medya ince bir tabaka uygulanması ve karanlık ve daha sonra lamel Hava kuru bölümler üstüne bir cam lamel yerleştirin. Kaplandı Slaytlar, oda sıcaklığında bir gece boyunca kurumaya bırakılır.
3D Rekonstrüksiyonunda 1.3) Yanal Ventrikül segmentasyonu
NOT: dik Epifloresans mikroskobik üzerinde haritalama yazılımı kullanarak lateral ventriküllerin izleme yapınotomatik sahne ve floresan tespiti için dijital CCD kamera ile pe.
- Floresan mikroskop ekipman açın ve floresan modunda haritalama yazılımı başlatmak. Açık 'Görüntü Seçenekleri' izleme için gerekli uygun araç çubukları ve yerleştirme aracı panelleri yüklemek için. Seçenekler> Görüntü Seçenekleri> Aksesuarlar ve 'Main' ve 'Marker' araç çubuklarını seçin. Aynı menüde, 'Kamera Histogram', 'Çok Kanallı Kontrol', 'Kamera Ayarları' altında 'Image Acquisition' seçeneğini 'Yerleştirme Aracı Panelleri.'
- Yanal ventrikül hat ependimal hücreleri etiketler güçlü S-100β floresan dayalı ventriküllerin başlangıçlar gözlemleyin. Yanal ventriküller içeren doku ilk parçası tanımlayın.
- Yeni bir veri dosyası oluşturun ve sol lateral ventrikül yukarıdaki resim penceresinde tıklayarak sahne hareketi için bir referans noktası belirlemek. Küçük arayınKesi sağ hemisfer sol yönlendirmek. Seri yeniden inşası için hatlarını alırken yardım dosyaları izleme genelinde lateral ventriküllerin tutarlı konum nispetle referans noktasını tutun.
- Örneğin, açılan menüden kontur uygun ön ayarlı kontur türü seçin 'sol lateral ventrikül.' Sol ve sağ lateral ventrikül trasların her biri için benzersiz bir renk kullanın. Kontur adı ve renk değişiklikleri gerekiyorsa, 'Kontur Tipi Ekle' sonra kontur renkleri adlarını değiştirmek veya seçin, Seçenekler> Ekran Tercihler> Konturlar gidin.
- 'Sol lateral ventrikül' konturu seçilen sayesinde, iz kontur başlamak için ependim astar apikal yüzeyi boyunca tıklayınız. Apikal yüzeyi boyunca art arda tıklayın devam ederek ventrikül Trace.
- Daha fazla incelik gerektiren düzensiz alanlar için, tıklayın ve serbest el izlemek için sol fare tuşunu basılı tutun. Ctrl + Z, ya da gitmek to Seçenek> Önceki kontur noktası geri almak için Geri Al. Ok tuşlarını kullanarak izleme penceresi taşıyın veya kontur ekran kapalı gelin yapma ve pencere otomatik olarak ortalamak için izin vererek. Sağ klik izleme ventrikül bitirmek ve 'Close Contour' seçeneğini seçin.
- Açılır menüyü kullanarak sağ lateral ventrikül için yeni bir kontur rengi (kontur türü) seçin. Sol için adım 1.3.4 deki gibi sağ ventrikül Trace.
- Kontur adı ve renk değişiklikleri gerekiyorsa, sağ kontur tıklayın ve uygun bir renk seçmek için Change Contour Türünü seçin.
- 3D rekonstrüksiyon için seri hatlarını uyum konusunda yardımcı olmak için orta hat boyunca işaretçileri ekleyin. Işaretçileri eklemek için, soldaki Marker araç çubuğundan uygun marker ('X' kullanın) seçin ve izleme bunları ekranda bırakmak için tıklayın. Her doku bölüm iz için kontür ile birlikte İthalat işaretleri.
- > Kaydet doku izleri, dosyayı seçin kaydetmek içinAs Veri Dosyası ve yeni bir klasör ve dosya adını oluşturun. Sayı iz [slayt #] - [doku #] seri kesimlerinden izleri kolay tanımlama için. Örneğin, ikinci slaytta üçüncü doku bölüm her beyin için dizin içinde dosya adı '2-3' vardır.
- Tekrarlayın ventrikül duvar yapışma bölgeleri hariç, tüm beyin aracılığıyla ventriküller izlemek için beyin dokusu, her seri bölüm için 1.3.9 için 1.3.4 adımları.
- Ventrikül yapışma sitesine olanlar dorsal ve ventral gelen yapışma, alt kademeli bir ön bölümünün bir bölüme sahip olması halinde. Her ventrikül (örneğin 'Dorsal Sol Ventrikül' ve 'Ventral Sol Ventrikül') için iki yeni kontur türlerini oluşturun. Yapışma ilk doku dilim tam bir ventrikül yeniden oluşturulabilir sağlamak için orijinal lateral ventrikül kontur ve yeni dorsal ve ventral konturlu hem yanal ventrikül iz.
- Bölümlerde bir ventricl için posteriore duvar yapışma, her ventrikül (örn 'Posterior Sol Ventrikül'), posterior bölümünün yeni kontur renk kümesi oluşturmak. Geçerli yapışması ve yeni arka kontur tipleri hem bu ilk yeniden katıldı bölümü çift iz.
1.4) Yanal Ventrikül 3D İmar
- Hizalayın ve 3D rekonstrüksiyon ve hacimsel verileri oluşturmak için fare lateral ventriküllerin seri kontur trase derlemek.
- Açık 3D rekonstrüksiyon programı. Dosya> Aç tıklayın ve ilk takip seri bölümün kontur dosyasını seçin. Sol ve sağ ventrikül kontur trase yanı sıra herhangi bir katma işaretçileri alma.
- Konturları seçmek için, 'Select Nesneler' düğmesine (imleç simgesi) tıklayın ve 'Ctrl' tutarak iki ventriküller ve işaretçileri seçin. Sağ tıklayın ve seçin kontür Z pozisyonunu kurmak için 'Z Konumunu Değiştir'. 0 um ilk doku dilim ayarlayın. <li> yeniden olarak, Dosya> Kaydet Veri Dosyası kaydetmek için. Bir hata yapılırsa kurtarma yeniden yükleme önceki dosyayı kadar kolaydır, böylece her dosya aldıktan sonra kaydedin.
- Yeniden yanındaki doku dilim eklemek için, Display Append Dosya> tıklayın. Eklenecek DAT dosyasını seçin ve 'Birleştirme' kutusunu işaretleyin.
- Yine yeni ithal izleme dosyası Z konumunu ayarlamak için Adım 1.4.3 izleyin. Diğer izleri hareketli önlemek için ana penceresinde yalnızca yeni eklenen sol ve sağ hatlarını seçin. 50 mikron bölümler için önceki kontur Z konumundan 50 um birbirini izleyen izleme dosyasını ayarlayın. (İlk kontur: z = 0, ikinci kontur: z = 50, üçüncü kontur: vb z = 100)
- , X, seçilen kontür ve belirteçlerin Y konumunu ayarlamak için tıklayın butonu 'Fare ile yapıldı Enable' ve önceki doku konturları ile uyum sağlamak hatlarını sürükleyin. Keep hem mevcut izinin sağ ve sol kontür seçilmişSenkron hareketine izin vermek üzere.
- Izleri orta hat belirteçlerinin sıraya saat yönünde ya da saat yönünün tersine döndürmek için, 'Z ekseni Rotation' düğmesini seçin. , Sağ tıklayın, ithal konturları ve işaretçileri ikisini de seçin 'Set Dönme Açısı' seçin ve 'Y rotasyon' içine '180' girin (sol kontur sağda ise) Y ekseni boyunca konturları çevirmek için.
- Karıncık ve orta hat belirteçleri iyi Adım 1.4.4 olarak, imar dosyayı kaydetmeden önce hizalanmış emin olun.
- Tekrarlayın Adımlar sonraki her doku dilim için 1.4.9 için 1.4.5 tüm ithal ve düzgün hizalanmış edilene kadar.
- Seri yeniden hacmi verilerini görüntülemek için, Analiz> 'İşaretleyiciler ve Bölge Analizi' tıklayın ve '3D Kontur Özeti' seçeneğini seçin. Sol panelde tüm kontür seçin ve son 3 boyutlu rekonstrüksiyon görüntülemek için '3D Görselleştirme' düğmesini tıklatın.
2. İnsan: Yanal Ventrikül Periventriküler Hücresel Dürüstlük ve 3D Modelleme Analizi
2.1) İnsan MRI Veri Analizi
NOT: Protokoller 3D görüntü rekonstrüksiyon ve lateral ventriküllerin hacimsel ölçümü oluşturmak ve boyuna bindirme analizi kullanılarak zamanla hacimsel değişikliklerin değerlendirilmesi için listelenmiştir. Bu verilerin eklenmesi ile 20 setleri için son derece önemli kriterlerdir MR veri toplama (örneğin, makine ve mıknatıs gücü, kesit kalınlığı, yönlendirme ve çözünürlük) ve alım sonrası işleme o tutarlılık dikkat etmek önemlidir.
- Ventriküler Bölümleme
NOT: ITK / Ek Bileşen yüksek çözünürlüklü T1 ağırlıklı MR görüntüleri segmente ventriküller kullanılır. Seçenek olarak ise, örneğin Freesurfer gibi diğer ücretsiz yazılım kullanılabilir.- Açık ITK / Yapış, Dosya> Aç Grayscale Görüntü. Bir .nii dosyası (NITFI dosyası) istediğiniz dosyayı ve açık seçin.
- Her anat ilerleyinomical düzlem belirterek ventriküler anormallikler (daralmış bölgeler, büyük ya da küçük zamansal boynuzları, vb.) Ana Araç Kutusu'nda 'Yılan ROI Aracı'nı tıklayın. 'Segment 3D tıklayın. 'Şiddet Bölge' seçeneğini seçin.
- 'Preprocess Resmi tıklayın. Beyaz yatırım getirisini vurgulamak amacıyla belli bir yoğunluk eşiğin altında bölgeleri kapsayacak şekilde, 'Above' seçeneğini seçin. Sürgülü çubuğunu kullanarak maksimum yoğunluğu kaydedin. Maksimum yoğunluk (kayıt bu değeri)% 15 eşiğini ayarlayın. 'Tamam' 10. tıklayın, ardından "Next" ile düzgünlük parametresini ayarlayın.
- Her ventrikül 10-12 küçük (boyut 2) 'kabarcıklar' Ekle: iki ön frontal boynuz, yedi lateral ventrikül gövdesi oksipital boynuz biri ve temporal boynuz birinin üstün yüzeyi boyunca eşit aralıklı lateral ventrikül. Ve set eğrilik kuvveti 0,4 'Parametreler Seç'. Aktif kontur evrimi başlamak için Çal Klibi tıklayın.
- Yüzeyi görselleştirmek için 'Güncelle Mesh tıklayın; 'Auto-Update' kontrol edin. Lateral ventrikül tüm alanlarda ilgi (ROI) bölgesinde dahil edildiğinde segmentasyon durdurun. Üçüncü ventrikül dahil kaçının. 'Son'u tıklayın.
- Aşağıdaki yöntemlerle istenmeyen bölgeleri kaldırmak için gerekirse el ile görüntüyü düzenlemek (genellikle üçüncü ventrikül kaçağı silmek gerekir). El ile aşırı bölgeleri kaldırmak veya manuel ROI ötesinde herhangi dahil silmek için aktif çizim etiket olarak 'Clear Etiket' ile 'Boya Fırçası' aracı kullanmak için '3D Neşter' aracını kullanın.
- Bir .nii görüntü olarak segmentasyon sonuçları ('Nifti' dosya biçimi) kaydedin.
- Toplam ventrikül hacmi elde etmek için, 'Segmentasyon> Sesi' ve İstatistikleri seçin; set renk etiketi kullanarak ventrikülün toplam hacmi edinin.
- MRIScans itibaren lateral ventriküllerin Boyuna Temsil
NOT: KullanımıMango yazılım, boyuna ROI nitelik ve nicelik zamanla konular dahilinde ventrikül hacmindeki değişiklikleri göstermek için üst üste.- Açık Mango. YEŞİL ilk ROI zaman noktasında (başlangıç) Dosya> Load yatırım getirisini tıklayın. Dosya> KIRMIZI olarak ikinci ROI zaman noktasında yükleyin ROI. Dosya seçerek boyuna bindirme kaydet> Farklı kaydet; '- [ikinci kez nokta yaşı] .nii dosya name_ [ilk zaman noktası yaşı]' her görüntü atamak.
- ITK-SNAP açın. Görüntü> Kombine ROI dosyasından Segmentasyon> Load seçerek, 'gri tonlama imajı' olarak kombine yatırım getirisini yeniden açın. Boyuna hacimli veri takip çalıştırın edinmek için: Segmentasyon> Ses ve İstatistik> Etiket 1 (kırmızı) genişleme hacmi =; Etiket 2 (yeşil) darlık hacmini =; Etiket 3 (mavi) = taban hacmi.
2.2) İnsan periventriküler Doku Hazırlama ve Analiz
- İnsan dokusu ile çalışmak için güvenlik talimatları
- Approp edininyaklaşımlarına yön güvenlik eğitimi (örn., Kan yoluyla bulaşan patojenler kurs).
- Standart (Evrensel) güvenlik önlemlerine uyunuz. Eldiven giyin. Tek kullanımlık değildir herhangi bir ortak teçhizat veya yüzeylerine dokunmadan önce eldiven değiştirin. 'Insan dokusu kullanımı' belirtme insan dokusu ile çalışırken rutin ele bir ürün etiketleyin.
- Insan dokusu ile temas tüm öğeler için dekontaminasyon uygulamaları takip edin. , Tasfiye etmeden önce 24 saat en az Kirlenmiş sıvı ağartma çamaşır suyu batırılmış havlu (örneğin, tezgah üstü) ya da (örneğin forseps) çamaşır suyu doğrudan nesne yerleştirerek kontamine yüzeyler davranın.
- Çamaşır suyu bir kağıt havlu ıslatma ve etkilenen alan (5-10 dk) tutarak içerebilir doğrudan cilt üzerinde insan dokusu ile temas için bir acil durum planı hazırlayın.
- İnsan doku ile temas eden tüm öğeleri için uygun atık bertarafı kullanın.
- Yanal Ventrikül Tüm Dağı Hazırlık
- Bsağlam bir yarımkürede ile eginning büyük bir bıçak kullanarak tüm yarımkürede boyunca 1,5 cm kalınlığında koronal kesitler dilim, (% 10 formalin içinde sabit ve 0.1 M PBS ile iyice durulanır).
NOT: Tüm sabitleme protokolleri önce antikor doğrulama gerektirir. - Etiket bölümleri ön yan ventrikül içeren ilk bölümü ile başlayarak arkaya. Sayılar (yukarıdan aşağıya) ile harfler (anterior posterior) ve alt bölümü ile dilimleri etiketleme, bir alfa-sayısal etiketleme sistemini kullanın. Ependim yüzeyini bozmamak.
- Mikrocerrahi neşter kullanılarak, tüm yanal duvar sürekli bir bölümü koruyarak 1 cm derinliğinde ventrikül duvar incelemek. Iyi boyama için uygun boyutta bölümler oluşturmak için gerektiği gibi duvara bölmek. Ventrikül duvarının karşı tarafında çentik bölümü üstün / aşağı yönünü belirlemek için.
- Çift kazanlar ile 10-20 dakika boyunca 100 ° C'de, 10 mM sodyum sitrat tamponu (pH 6.0) doku bölümleri inkübe edilerek antijen alımı gerçekleştirmekr (optimum inkübasyon süresi ampirik olarak belirlenir). PBS /% 0.1 Triton X-100 (PBS-TX) 3 kez yıkayın.
- Oda sıcaklığında 1 saat boyunca PBS / PBS-TX kullanarak,% 10 at serumu içinde Blok.
- 4 ° C 'de 48 saat süre ile primer antikorlar ile inkübe edin. Aşağıdaki antikor kombinasyonları ile tüm bağlar immunostain, ventrikül duvar astarı görselleştirmek için: fare anti-β-katenin (1: 250); keçi anti-GFAP (1: 250); tavşan anti-AQP4 (1: 400).
- Karanlıkta sonraki tüm adımları uygulayın. İkincil antikor (1: 500) ile birlikte inkübe edilir, PBS doku 3 kez yıkayın 4 ° C sıcaklıkta 24 saat ya da oda sıcaklığında 2 saat süre ile, PBS içinde bir 3 kez yıkayın. Oda sıcaklığında, 7 dakika için DAPI doku inkübe PBS içinde bir 3 durulama izledi.
- Parafilm bir mum alt çanak kapsayan nihai diseksiyon için doku hazırlayın. Ince forseps kullanarak çanak doku yerleştirmek ependim duvarla temas kaçınarak, PBS ile çanak doldurun.
- Mikroskop altında, sıkı bir şekilde secuyan kullanarak pimleri üzerinde dokuya yeniden. 22,5 ° mikrocerrahi bıçak bıçak ile, lateral ventrikül duvar (yaklaşık 300 mikron kalınlığında) üniforma ince kesitler oluşturun. Büyük bölümler veya zor eğrilik ile bölümler için, montaj ve not konumu için son bölümlere kesmeden önce küçük küpler halinde doğrayın.
- Dikkatle, ince forseps kullanarak slayt bölgesel konumu ve yönelimi not alarak slayt üzerine disseke bölüm ependima tarafını yerleştirin. Kabarcıklarını önlemek için özen, aquapolymount ince bir tabaka ile doku örtün. , Doku üzerinde lamel yerleştirin lamel altında herhangi bir boşlukları doldurmak için gerekli ek aquapolymount ekleyin.
- Oda sıcaklığında 2-3 gün boyunca, karanlık ve kuru monte bölümleri yerleştirin. 4 ° C 'de slidebox saklayın.
- Bsağlam bir yarımkürede ile eginning büyük bir bıçak kullanarak tüm yarımkürede boyunca 1,5 cm kalınlığında koronal kesitler dilim, (% 10 formalin içinde sabit ve 0.1 M PBS ile iyice durulanır).
- İmmünohistokimya ve Histolojik Analiz
- Kullanım o tarafından belirlenen floresan immünohistokimya görüntülemek için konfokal mikroskopi kullanılarak, ventrikül yüzeyindeki görüntüleme odak düzlemi ayarlamakf β-katenin (ependimal hücrelerinin apikal adherens kavşak proteinler için işaretleyici). Ependim hücre kapsama ve yüzey astrogliyozun (ventrikül yüzeyinde GFAP boyama) bölgeleri tasvir.
- Tüm ventrikül yüzeyi belgeye ve sıkıca bağlanıp, tüm yüzeyini kapsayacak şekilde örtüşen görüntüler kullanın. Seri görüntülerin montaj oluşturmak için, Adobe Photoshop açın. , Bindirmek için görüntüleri seçmek için Dosya> Otomatikleştir> Photomerge> Etkileşimli düzeni kullanın, gerekirse manuel ayarlamaları yapmak.
- Sağlam ependima hücre kapsama ya da ventrikül yüzey gliozis karikatür temsilini oluşturmak için montaj izlemek için yeni bir katman oluşturun. Her slayt veya YG için tekrarlayın. MR yeniden bölgeyi karşılık gelen ventrikül duvar ve bağlantı haritayı yeniden tüm bölümleri derleyin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Immunohistokimyasal 50 mikron koronal kesitler ve 3D rekonstrüksiyon (Şekil 3) dayalı fare lateral ventriküllerin Kontur takibi hacmi verileri hastalık ya da yaralanma için bir model sistem olarak fareyi kullanarak farklı deneysel paradigmalar toplanan sağlar. Bu prosedüre Kritik lateral ventrikül duvarları birbirine yapışır bölgelerin dışlama olduğunu. Ventriküllerin bölgeleri subsegmenting ve her bir bölgede (Şekil 3C) için farklı bir renk tayin, bitişik bölümler uyulması ve bölgesel ve toplam hacim derlenmiş subsegmentli hesaplanabilir.
Benzer çalışmalar 3D render için lateral ventriküllerin yarı otomatik segmentasyon (ITK-SNAP) ile birlikte beyin MR taramaları kullanılarak yapılabilir. Ventrikül hacimleri doğrudan eşleştirme ve periventriküler doku analizi, öncesi veya otopsi için MRG parçalı ve (3D rekonstrüksiyon oluşturmak için hizalanır
Şekil 1: ITK / Yapış Yılan ROI Aracı (A) kullanarak lateral ventrikül segmentasyonu Sahne 'Kabarcıklar' lateral ventriküller eklenir. (B) 'Kabarcıklar' aktif kontur evrim sırasında genişletin. Tüm yanal ventrikül dolduğunda (C) Bölütleme tamamlanır. (Care 3. ventrikül önlemek için alınır.)
Şekil 2: İnsan lateral ventrikül duvar diseksiyonu (
Şekil 3: İzleme ve S100β-immunoreaktif ependimal hücreleri tarafından özetlenen fare lateral ventriküller (lateral ventriküller içeren Koronal fare beyin bölümünün, 3D rekonstrüksiyon (*, Yanal Ventriküller; dirsek, Adhe bölgesi. sion; ölçek çubuğu, 500 mikron). (B) Fare Lateral ventriküller hacimsel analiz ile müdahale intraventriküler yapışma bölgeleri hariç, 'kontür' olarak takip ve alt segmente bölümler olarak düzenlenmiştir. Lateral ventrikül konturları (C) 3 boyutlu rekonstrüksiyon. Yanal ventriküller içeren ilgi bölgeyi kapsayan tüm beyin hacminin Sarı, kontur.
Şekil 4: MR tabanlı lateral ventrikül segmentasyonu (A) MR görüntüleri monte edilir. (B) Yanal ventrikül ROI (kırmızı) olarak tanımlanır. (C) 3D görüntü rekonstrüksiyonu hacimsel ölçümü ve lateral ventrikül niteliksel görünüm için izin verir.
reklam / 52328 / 52328fig5highres.jpg "/>
Şekil 5: boyuna ventrikül genişlemesi Boyuna MRI Değerlendirilmesi çok noktadan hizalanmış ve görselleştirmek ve zamanla konular içinde ventrikül hacmi genişlemesini ölçmek için üstüne eklenebilir.
Şekil 6: İmmünohistokimyasal değerlendirme ve β-katenin boyama ile özetlenen insan lateral ventrikül yüzeyi (A) bozulmamış ependima hücrelerinin Alanları, bölgesel haritalama, bir Arnavut kaldırımı görünümü (yıldız) göstermek ve ventrikül yüzeyinde astrogliyozun bölgelerinden bir noktalı çizgi ile ayrılır (GFAP + boyama). (B) Seri konfokal görüntüleri bölgesel montaj oluşturmak için üst üste ve ventrikül yüzeyinde hücresel organizasyonun bir karikatür temsili için Adobe Photoshop kullanarak izlenmektedir. (C) ÇizgiGörüntü montaj MR tabanlı 3D ventrikül rekonstrüksiyon karşılık ventrikül yüzeyine eşleştirilir. (Ölçek çubuğu (A), 40 mikron, Ölçek çubuğu (B), 1 mm)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu araçlar ve farelerde ve insanlarda beyin ventriküler sisteminin bütünlüğünü değerlendirmek için kullanılabilecek protokoller sunuyoruz. Bu araçlar, ancak, aynı zamanda ya da 14,21,22 yaşlanma sürecinde yaralanma, hastalık nedeniyle değişiklik geçiren diğer beyin yapıları veya organ sistemlerine uygulanabilir. stratejiler kesitsel ve uzunlamasına MRG dizilerinin uyum belirli bölgelerde veya ilgi yapıların 3 boyutlu hacim temsillerini oluşturmasına olanak sağlar yazılım almak avantaj sundu. Boyuna MR sekansları izin zamanla meydana gelen ve toplam beyin hacmi oranları lateral ventrikül için toplam beyin hacmi, ve / veya diğer beyin yapıları (örneğin, subtalamik nükleus 23 veya korpus kallosum beyaz cevher yollarını kapsayacak şekilde genişletilebilir 3D hacim değişikliklerinin derleme ) difüzyon ağırlıklı tensör görüntüleme kullanılarak. Birlikte, beyin yapısal değişiklikler kapsamlı bir analiz gerçekleştirilebilir. Sonuç olarak,multimodal görüntüleme teknikleri bir koleksiyon beyin yapılarına yaşa bağlı ve hastalığa bağlı değişiklikleri değerlendirmek için beyin sağlık durumu 24 en doğru görüntü elde etmek için gereklidir. Birlikte özne-özne değişkenliği ve konular arasında değişkenlik aralığı ile Dokümantasyon ve kritik yapısal verilerin derlenmesi, ideal olarak sağlık veya hastalık doku en iyi rehber klinik tanı ultra-yüksek alan MR atlasları üretmek için kullanılan olabilir.
Birkaç kritik adımlar arasında ve söz konusu veri setleri içinde toplama ve işleme değişkenliği azaltmak amacıyla nota önemlidir. İdeal olarak uyumlu veri dizileri elde etmek için, aynı MRI tarayıcı ve dizi tipi çalışma boyunca kullanılmalıdır. Postmortem beyin dokusu genellikle farklı kalitede olduğu; Böyle fiksatif ölüm nedeni, otopsi aralığı, perfüzyon kalitesi ve sürenin uzunluğu gibi kritik faktörlerin hepsi boyama etkinliğini ve bir ihtiyacını etkileyebilirantijen alma protokolü. Buna ek olarak, insan beyninin boyutu ilgi alanları ihtiva eden doku elde etmek için daha fazla manipülasyon gerektiren her dilim ile birden fazla kesit bölümleri gerektirir. Bu nedenle, her bir bölümün konumu ve yönelimi açıkça işaretlenmiş ve kaydedilir önemlidir. Sonuçta, postmortem doku analizi ile birincil sorun tam da - bu postmortem - ve dolayısıyla ömrü sonunda doku sadece bir anlık bir görünüm sağlar. Geliştirilmiş modelli görüntüleme teknikleri beyin yapıları ve hücresel çözünürlükte morfo-fonksiyonel bilgilere değişikliklerin gerçek zamanlı analiz için gereklidir.
Fare çalışmaları değişken insan koşul değişkeni sorgulama izin ve insan dokusu ile çalışırken bulundu zorluklar birçok sunmazlar. Nedensel yapı dinamiklerinin analizi ile insan hastalık ya da yaralanma modellemek için kullanılan fare çalışmalar hastalık modeli val için iyileştirmeler sunabiliridation. Bununla birlikte, türe özgü farklılıklar dikkat edilmelidir. Lateral ventriküllerin Bizim analizde, fareler olarak, lateral ventrikül lateral duvar boyunca aktif bir kök hücre niş korumak ve astar mütevazı ependim hücre kaybı durumlarında meydana ventrikül hücre aracılı rejeneratif onarım kök dikkat etmek önemlidir yaşlı farelerde bulunan veya sınırlı ependim hücre denüdasyon ependima maruz kalma yoluyla meydana geldiğinde 19 Nöraminidaz. Herhangi bir rejenerasyon olasılığı ise, aksine, insan, yan ventrikülün 25-27 ve küçük bir birlikte güçlü bir kök hücre niş muhafaza yoktur. Yaşlı farelerde aksine, yaşlı insanlarda ventrikül genişleme 6 ile bağlantılı ventrikül yüzeyinde geniş bir astrogliyozun göstermektedir. Soyulma ve ventrikül astar 'skar' Bu düzeyde ependimal hücrelerin 6,28 arasında ventrikül astar denude için nöraminidaz kullanarak fare modellenebilir. Buna ek olarak, bu th tanımak önemlidirvivarium bakımlı farelere en insani konulardan çok farklı bir tıbbi öykü sunan, enfeksiyonlar, hastalık veya travma deneyimi yok. Bundan başka, fare, tipik olarak yaşla ilişkili nörodejeneratif hastalık, ventrikülomegalisi ya periventriküler gliozis göstermezler. Bu nedenle, modellenmiş gereken bu fenotipleri gözlemlemek. Sonunda, hiçbir hayvan modeli tam ontogenezini, patofizyolojisi ve insan hastalığının semptomatik karmaşıklığı özetlemek ve bu sınırlamalar kabul ve düzgün bildirilmesi gerekmektedir.
Özetle, biz teknikleri ve protokoller fare ve insanda lateral ventrikül hacimleri değerlendirmek için sunuyoruz. Ventriküller 3D kılınabilir ve boyuna analiz Spatiotemporal hacim değişiklikleri derleme izin verir. Buna ek olarak, eşleştirilmiş beyin dokusu ile biz ventrikül hacim değişiklikleri ile bağlantılı olabilir kadar hücresel özellikleri göstermektedir. En son sonuçlar periventricu alanlarında Aquaporin-4 ifade seviyeleri artmış ortaya konuldular gliozis ventrikül yüzeyi boyunca ödem öneririz. Doku histoloji ile FLAIR-MRI eşleştirme nedenle gelecekteki araştırmalar CSF ve interstisyel sıvı alışverişi anlayışımızı geliştirmek ve ventrikül sistemi sağlığı ve nasıl onun bozulma çeşitli beyin fonksiyonlarını etkilediği hakkında kritik bilgiler sunacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Life Technologies | 21600-069 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 19210 | Use at 4% in PBS, 4 °C |
| Normal Horse Serum | Life Technologies | 16050 | 10% in PBS-TX (v/v) |
| Normal Goat Serum | Life Technologies | 16210 | 10% in PBS-TX (v/v) |
| Triton X-100 (TX) | Sigma-Aldrich | T8787 | 0.1% in PBS (v/v) |
| Vibratome | Leica | VT1000S | |
| Fluorescence Microscope | Zeiss | Imager.M2 | |
| Camera | Hamamatsu | ORCA R2 | |
| Microscope Stage Controller | Ludl Electronic Products | MAC 6000 | |
| Stereology software | MBF Bioscience | Stereo Investigator 11 | |
| Stereology software | ImageJ/NIH | NIH freeware | |
| 3D Reconstruction software | MBF Bioscience | Neurolucida Explorer | |
| Confocal Microscope | Leica | TCS SP2 | |
| MRI Software | |||
| Freesurfer | https://surfer.nmr.mgh.harvard.edu/fswiki/DownloadAndInstall | Segmentation and Volume | |
| ITK-Snap | http://www.itksnap.org/pmwiki/pmwiki.php | Segmentation and Volume | |
| Multi-image Analysis GUI (Mango) | http://ric.uthscsa.edu/mango/ | Longitudinal overlay | |
| Whole Mount Equipment | |||
| 22.5° microsurgical straight stab knife | Fisher Scientific | NC9854830 | |
| parafilm | |||
| wax bottom dissecting dish | |||
| pins | |||
| fine forceps | |||
| aquapolymount | |||
| Dissecting Microscope | Leica | MZ95 | |
| Whole Mount Antibodies | |||
| mouse anti-b-catenin | BD Bioschiences, San Jose, CA, USA | 1:250 | |
| goat anti-GFAP | Santa Cruz Biotechnology | 1:250 | |
| rabbit anti-AQP4 (aquaporin-4) | Sigma-Aldrich | 1:400 | |
| Coronal Antibodies | |||
| Anti-S100β antibody | Sigma-Aldrich | 1:500 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Life Technologies | D-1306 | 10 µg/ml in PBS |
References
- Del Bigio, M. R. Ependymal cells: biology and pathology. Acta Neuropathol. 119, 55-73 (2010).
- Johanson, C., et al. The distributional nexus of choroid plexus to cerebrospinal fluid, ependyma and brain: toxicologic/pathologic phenomena, periventricular destabilization, and lesion spread. Toxicol Pathol. 39, 186-212 (2011).
- Roales-Bujan, R., et al. Astrocytes acquire morphological and functional characteristics of ependymal cells following disruption of ependyma in hydrocephalus. Acta Neuropathologica. 124, 531-546 (2012).
- Cserr, H. F.
- Iliff, J. J., et al. A paravascular pathway facilitates CSF flow through the brain parenchyma and the clearance of interstitial solutes, including amyloid beta. Science Translational Medicine. 4, 147ra111 (2012).
- Shook, B. A., et al. Ventriculomegaly associated with ependymal gliosis and declines in barrier integrity in the aging human and mouse brain. Aging Cell. , (2013).
- Xie, L., et al. Sleep drives metabolite clearance from the adult brain. Science. 342, 373-377 (2013).
- Fazekas, F., et al. Pathologic correlates of incidental MRI white matter signal hyperintensities. Neurology. 43, 1683-1689 (1993).
- Meier-Ruge, W., Ulrich, J., Bruhlmann, M., Meier, E. Age-related white matter atrophy in the human brain. Ann N Y Acad Sci. 673, 260-269 (1992).
- Resnick, S. M., Pham, D. L., Kraut, M. A., Zonderman, A. B., Davatzikos, C. Longitudinal magnetic resonance imaging studies of older adults: a shrinking brain. The Journal Of Neuroscience : The Official Journal Of The Society For Neuroscience. 23, 3295-3301 (2003).
- Sener, R. N. Callosal changes in obstructive hydrocephalus: observations with FLAIR imaging, and diffusion MRI. Comput Med Imaging Graph. 26, 333-337 (2002).
- Sze, G., et al. Foci of MRI signal (pseudo lesions) anterior to the frontal horns: histologic correlations of a normal finding. AJR Am J Roentgenol. 147, 331-337 (1986).
- Tisell, M., et al. Shunt surgery in patients with hydrocephalus and white matter changes. Journal of Neurosurgery. 114, 1432-1438 (2011).
- Valdes Hernandez Mdel, C., et al. Automatic segmentation of brain white matter and white matter lesions in normal aging: comparison of five multispectral techniques. Magn Reson Imaging. 30, 222-229 (2012).
- Shook, B. A., Manz, D. H., Peters, J. J., Kang, S., Conover, J. C. Spatiotemporal changes to the subventricular zone stem cell pool through aging. The Journal of Neuroscience : The Official Journal Of The Society For Neuroscience. 32, 6947-6956 (2012).
- Mirzadeh, Z., Merkle, F. T., Soriano-Navarro, M., Garcia-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. Neural stem cells confer unique pinwheel architecture to the ventricular surface in neurogenic regions of the adult brain. Cell Stem Cell. 3, 265-278 (2008).
- Mirzadeh, Z., Doetsch, F., Sawamoto, K., Wichterle, H., Alvarez-Buylla, A. The subventricular zone en-face: wholemount staining and ependymal flow. J Vis Exp. , (2010).
- Luo, J., Daniels, S. B., Lennington, J. B., Notti, R. Q., Conover, J. C. The aging neurogenic subventricular zone. Aging Cell. 5, 139-152 (2006).
- Luo, J., Shook, B. A., Daniels, S. B., Conover, J. C. Subventricular zone-mediated ependyma repair in the adult mammalian brain. J Neurosci. 28, 3804-3813 (2008).
- Marcus, D. S., Fotenos, A. F., Csernansky, J. G., Morris, J. C., Buckner, R. L. Open access series of imaging studies: longitudinal MRI data in nondemented and demented older adults. J Cogn Neurosci. 22, 2677-2684 (2010).
- Giorgio, A., De Stefano, N.
- Caspers, S., et al. Studying variability in human brain aging in a population-based German cohort-rationale and design of 1000BRAINS. Front Aging Neurosci. 6, 149 (2014).
- Keuken, M. C., et al. Ultra-high 7T MRI of structural age-related changes of the subthalamic nucleus. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33, 4896-4900 (2013).
- Marti-Bonmati, L., Sopena, R., Bartumeus, P., Sopena, P.
- Bergmann, O., et al. The age of olfactory bulb neurons in humans. Neuron. 74, 634-639 (2012).
- Sanai, N., et al. Corridors of migrating neurons in the human brain and their decline during infancy. Nature. 478, 382-386 (2011).
- Wang, C., et al. Identification and characterization of neuroblasts in the subventricular zone and rostral migratory stream of the adult human brain. Cell Res. 21, 1534-1550 (2011).
- Carmen Gomez-Roldan, D. el, M,, et al. Neuroblast proliferation on the surface of the adult rat striatal wall after focal ependymal loss by intracerebroventricular injection of neuraminidase. The Journal of Comparative Neurology. 507, 1571-1587 (2008).
