Introduction
Un épendymaires lignes de la monocouche de cellules du système ventriculaire du cerveau fournissant des fonctions de barrière et de transport bi-directionnelles entre le fluide spinal cérébral (CSF) et de fluide interstitiel (ISF) 3.1. Ces fonctions aident à garder le cerveau des toxiques gratuitement et en équilibre physiologique 2,3. Chez l'homme la perte de portions de ce revêtement sur blessure ou la maladie ne semble pas résulter en remplacement de régénération que l'on trouve dans d'autres revêtements épithéliaux; plutôt une perte de couverture de la cellule épendymaire semble résulter en astrogliose périventriculaire avec un maillage d'astrocytes couvrant des régions dénudées des cellules épendymaires à la surface du ventricule. Les répercussions graves aux mécanismes CSF / d'échange de l'ISF et de dédouanement importants, pourraient être prévues résulter de la perte de cette couche épithéliale 1,2,4-7.
Une caractéristique commune de vieillissement humain est agrandie ventricules latéraux (ventriculomégalie) et associé œdème périventriculaire comme observed par l'IRM et la récupération d'inversion fluide atténué IRM (IRM / FLAIR) 8-14. Pour étudier la relation entre ventriculomégalie et l'organisation cellulaire de la muqueuse du ventricule, des séquences d'IRM post mortem humains ont été jumelés à des préparations histologiques de ventricule latéral du tissu péri-ventriculaire. En cas de ventriculomégalie, d'importantes zones de gliose avaient remplacé la couverture cellulaire épendymaire le long de la paroi du ventricule latéral. Lorsque l'expansion du ventricule n'a pas été détecté par l'analyse du volume basé sur l'IRM, la doublure de la cellule épendymaire était intact et gliose n'a pas été détectée le long de la paroi du ventricule 6. Cette approche combinatoire représente la première documentation détaillant les changements globaux dans l'intégrité cellulaire de la muqueuse du ventricule latéral en utilisant des préparations wholemount de parties ou la totalité de la paroi du ventricule latéral et la modélisation 3D des volumes du ventricule 6. Plusieurs maladies (maladie d'Alzheimer, la schizophrénie) et les blessures (traumatismes crâniens)montrer ventriculomégalie comme une caractéristique neuropathologique tôt. Dénudation des zones du revêtement de la cellule épendymaire ainsi serait prévu pour interférer avec la fonction de la cellule épendymaire normale et compromettre l'équilibre homéostatique entre CSF / fluide ISF et l'échange de soluté. Ainsi, un examen plus approfondi des modifications apportées au système ventriculaire, sa composition cellulaire, et la conséquence de structures cérébrales sous-jacentes ou voisins sera finalement commencer à révéler plus sur la neuropathologie associée à l'élargissement du ventricule.
Le manque de données d'imagerie multimodaux, et en particulier les séquences de données longitudinales, avec un accès limité à des échantillons de tissus histologiques correspondant fait l'analyse des pathologies du cerveau humain difficile. Phénotypes modélisation trouvés dans le vieillissement ou la maladie humaine peuvent souvent être obtenus avec des modèles de souris et de modèles animaux deviennent l'un de nos meilleurs moyens d'explorer des questions sur l'initiation de la maladie humaine et la progression. Plusieurs études injeunes souris saines ont décrit la cytoarchitecture des parois ventricule latéral et la tige sous-jacente cellule niche 4,7-15. Ces études ont été élargis pour inclure la modélisation 3D et l'analyse cellulaire des parois du ventricule par le vieillissement de 6,15. Ni gliose périventriculaire ni ventriculomégalie sont observés chez les souris âgées, plutôt souris affichent une zone subventicular relativement robuste (SVZ) niche de cellules souches sous-jacente à une cellule intacte épendymaire doublure 6,15. Ainsi, des différences frappantes spécifiques aux espèces existent à la fois l'entretien général et de l'intégrité de la muqueuse du ventricule latéral au cours du processus de vieillissement de 6,15. Par conséquent, pour les meilleures souris d'utilisation pour interroger conditions trouvées chez l'homme, les différences entre les deux espèces doivent être caractérisé et dûment pris en considération dans tout paradigme de modélisation. Ici, nous présentons des procédures pour évaluer les changements longitudinaux aux ventricules latéraux et les tissus péri-ventriculaire associée chez les humains et mouse. Nos procédures comprennent le rendu 3D et la volumétrie de la souris et ventricules humains, et l'utilisation de l'analyse immunohistochimique des préparations toute la montagne de tissus périventriculaire à caractériser à la fois l'organisation cellulaire et de la structure. L'ensemble de ces procédés fournissent un moyen pour caractériser les changements dans le système ventriculaire et le tissu associé périventriculaire.
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Protocol
Nota: Les procédures animaux ont été approuvés par l'Université du Connecticut IACUC et sont conformes aux directives du NIH. Le tissu humain et l'analyse de données et les procédures étaient en conformité avec et approuvés par l'Université du Connecticut CISR et conformes aux directives du NIH.
1. Souris: Analyse des périventriculaire Cellular intégrité et la modélisation 3D du ventricule latéral
1.1) Préparation de la souris ventricule latéral mur entier Mounts
- Préparer souris ventricule latéral montures entières pour l'immunohistochimie (IHC) comme décrit précédemment 16,17.
1.2) immunohistochimie pour l'analyse de ventricule latéral
- Fix et le tissu cérébral section de la souris comme décrit précédemment 18,19.
- Brièvement, rincer souris transcardiaque avec normale, une solution saline de la température ambiante, jusqu'à ce que les organes ont éclairci (indiqué par une coloration pâle), suivis par la température ambiante paraformaldéhyde 4%(PFA) dans 0,1 M de tampon phosphate salin (PBS) jusqu'à ce que le tissu a durci.
- Retirer le cerveau du crâne. Utilisez des ciseaux de dissection iris pour couper de la base du crâne le long de la suture sagittale.
- Exposer le crâne et le cerveau retirer avec une pince. Plongez le cerveau dans 4% PFA fixateur nuit à 4 ° C. Puis laver 3 fois pendant 20 minutes avec du PBS.
- Préparer des coupes en série pour l'immunohistochimie et analyse du volume.
- Avec un scalpel microchirurgicale, faire une petite incision longitudinalement le long du cortex de l'hémisphère gauche pour permettre l'identification de l'hémisphère gauche de l'hémisphère droit lorsque les sections flottantes sont immunocolorées.
- EnCase cerveaux à 3% d'agarose pour le soutien structurel ajouté fixe pendant vibratome sectionnement. Chaud 3% d'agarose dans de l'eau distillée (p / v) jusqu'à ce que soit complètement dissous en utilisant un four micro-ondes ou plaque chauffante.
- Avec une lame de rasoir, retirer la partie caudale du cerveau au cervelet avec uncoupe coronale, laissant une surface plane et uniforme. Appliquez de la colle super à l'étape de tissus et de positionner le cerveau sur la surface fraîchement coupée avec les bulbes olfactifs vers le haut.
- Lorsque la solution d'agarose liquide est refroidi à une température juste chaud au toucher, appliquer uniformément sur le cerveau pour envelopper complètement l'ensemble du cerveau. Laisser la gélose se solidifier.
- Section agarose enfermé cerveaux coronaire sur un vibratome en 50 sections um, avec des sections placées en série dans une plaque de 24 puits contenant du PBS afin de préserver l'ordre séquentiel.
REMARQUE: généralement 12 puits sont utilisés pour un cerveau, avec prélèvement de tissus commençant 5 sections avant de voir l'émergence des ventricules latéraux commençant par le puits A1, déplacer numériquement grâce à B6 et du vélo retour à A1. Cela permet à plusieurs sections distinctes de la même cerveau pour être traitées dans le même puits. Pour latéral analyse du volume du ventricule, collection de tissus a cessé lorsque le ventricule latérals et la troisième fusion du ventricule, résultant en environ 3 sections par puits ou 36 sections au total. - Aspirer le PBS aide d'une pipette de transfert fixé avec une pointe de micropipette 20-200 pi pour que les articles flottants ne sont pas accidentellement aspirés. Block et perméabiliser les sections flottantes dans 10% de sérum, 0,1% de Triton X-100 (TX) dans du PBS (PBS-TX) pendant 1 heure à température ambiante. Utilisez 300 pi de solution par puits pour couvrir des coupes de tissus flottant librement dans une plaque de 24 puits et effectuer toutes les incubations de sections sur une plaque à bascule.
- Aspirer la solution de blocage, et incuber sections avec des anticorps primaires de PBS-TX nuit (au moins 12 heures) à 4 ° C. Pour les traces de volume du ventricule en utilisant des coupes coronales, utiliser anticorps anti-S100β pour marquer les cellules épendymaires.
- Aspirer solution d'anticorps primaire, et laver sections 3 fois pendant 10 min chacun avec PBS-TX.
- Incuber les coupes dans le noir pendant 1 h à la salle temperature avec des anticorps secondaires fluorescents, à des concentrations de 1: 1000 dans 10% de sérum, PBS-TX. Gardez sections dans l'obscurité pour toutes les étapes d'incubation restants.
- Aspirer la solution d'anticorps secondaire et incuber les sections avec 4 ', 6-diamidino-2-phénylindole dans du PBS (DAPI, 10 ug / ml) pendant 5 min à contre-coloration des noyaux cellulaires. Aspirer la solution DAPI et rincer les coupes 3 fois chacune pendant 10 minutes avec du PBS.
- Sections de montage en série sur des lames en utilisant la marque corticale de préserver gauche contre droite orientation de l'hémisphère. Air sections sèches dans la lamelle obscurité, puis en appliquant une fine couche de milieu de montage sur la lame et placer délicatement une lamelle de verre sur le dessus. Autoriser les diapositives sous une lamelle sécher toute la nuit à la température ambiante.
1.3) La segmentation de ventricule latéral pour les reconstructions 3D
REMARQUE: Effectuer le suivi des ventricules latéraux en utilisant un logiciel de cartographie sur une épifluorescence microsco deboutpe avec un étage automatisé et une caméra numérique CCD pour la détection de fluorescence.
- Allumez l'équipement de microscope à fluorescence et de lancer le logiciel de cartographie en mode de fluorescence. Ouvrez les "Options d'affichage" pour charger les barres d'outils appropriés et des panneaux d'outils d'accueil nécessaires pour le traçage. Options> Options d'affichage> Accessoires, et sélectionnez le «principal» et les barres d'outils «marqueur». Dans le même menu, sélectionnez «Caméra histogramme», «contrôle multicanal», «Réglages de l'appareil», et «l'acquisition d'images» sous «Panneaux accueil de l'outil.
- Respecter les débuts des ventricules basés sur la fluorescence de S-100β fort qui marque les cellules épendymaires qui bordent le ventricule latéral. Identifier le premier morceau de tissu contenant les ventricules latéraux.
- Créer un nouveau fichier de données et désigner un point pour le mouvement de la scène de référence en cliquant dans la fenêtre de l'image au-dessus du ventricule latéral gauche. Cherchez la petiteincision pour orienter gauche de l'hémisphère droit. Gardez le point dans un endroit cohérent par rapport aux ventricules latéraux de référence dans des dossiers de recherches pour aider lors de l'importation des contours pour la reconstruction de série.
- Sélectionnez le type approprié de présélection à partir du contour de contour dans le menu déroulant, par exemple, «Gauche Ventricule latéral. Utiliser une couleur unique pour chacun des tracés latéraux de gauche et ventricule droit. Si des changements dans le nom du contour et la couleur sont nécessaires, allez dans Options> Préférences d'affichage> Contours, puis modifier les noms des couleurs de contour ou sélectionnez «Ajouter un type Contour".
- Avec contour de la 'gauche Ventricule latéral' sélectionné, cliquez sur le long de la surface apicale de la doublure épendymaire pour commencer le contour de trace. Tracez le ventricule en continuant de cliquer successivement le long de la surface apicale.
- Pour les zones irrégulières nécessitant plus de finesse, cliquez et maintenez le bouton gauche de la souris afin de tracer les mains libres. Appuyez sur Ctrl + Z, ou aller to Options> Annuler pour annuler le point de contour précédent. Déplacez la fenêtre de traçage à l'aide des touches fléchées ou en faisant pointer un contour hors de l'écran et la fenêtre permettant de centrer automatiquement. Pour terminer le ventricule traçage clic droit et sélectionnez "Close Contour".
- Sélectionnez une nouvelle couleur de contour (type de contour) pour le ventricule latéral droit en utilisant le menu déroulant. Tracez le ventricule droit comme à l'étape 1.3.4 pour la gauche.
- Si des changements dans le nom du contour et la couleur sont nécessaires, cliquez droit sur le contour et sélectionnez Modifier le type Contour pour sélectionner la couleur appropriée.
- Ajouter marqueurs le long de la ligne médiane pour aider à aligner les contours de série pour la reconstruction 3D. Pour ajouter des marqueurs, sélectionnez le marqueur approprié (utilisez le 'X') à partir de la barre d'outils Marqueurs sur la gauche et cliquez pour les déposer sur l'écran de traçage. marqueurs d'importation ainsi que les contours de chaque section de tissu trace.
- Pour enregistrer la trace de tissus, sélectionnez Fichier> EnregistrerFichier de données Au fur et à créer un nouveau dossier et le nom du fichier. Nombre des tracés [diapo #] - [#] tissus pour faciliter l'identification de traces de coupes en série. Par exemple, la troisième section de tissu sur la deuxième diapositive a le nom de fichier '2-3' dans le répertoire pour chaque cerveau.
- Répéter les étapes 1.3.4 à 1.3.9 pour chaque section de série du tissu cérébral pour tracer les ventricules à travers la totalité du cerveau, à l'exception des régions d'adhérence de la paroi du ventricule.
- Si le ventricule a une région d'adhérence, sous-segment de la région antérieure de celles dorsal et ventral vers le site d'adhérence. Créer deux nouveaux types de contour pour chaque ventricule (par exemple, «Dorsale du ventricule gauche» et «ventrale du ventricule gauche»). Sur la première tranche de tissu à l'adhérence, des oligo le ventricule latéral avec à la fois le contour original du ventricule latéral et le nouveau dorsal et ventral contours pour assurer une reconstruction complète du ventricule peut être créé.
- Dans les sections postérieures à une ventricle mur adhérence, créer un ensemble de nouvelles couleurs de contour de la partie postérieure de chaque ventricule (par exemple, «postérieure du ventricule gauche»). Double-retracer cette première section de re-joint à la fois l'adhésion en cours et de nouveaux types de contour postérieur.
1.4) Reconstruction Ventricule latéral 3D
- Alignez et compiler des tracés de contour série des ventricules latéraux de la souris pour générer des reconstitutions en 3D et des données volumétriques.
- Ouvrir programme de reconstruction 3D. Cliquez sur Fichier> Ouvrir et sélectionnez le fichier de contour de la section première série tracée. Importez les tracés de contour du ventricule gauche et à droite ainsi que les marqueurs ajoutés.
- Pour sélectionner les contours, cliquez sur le bouton 'Sélectionner les objets de (curseur de l'icône) et sélectionnez les deux ventricules et marqueurs en tenant «Ctrl». Pour établir la position Z des contours, faites un clic droit et sélectionnez «Modifier Position Z '. Réglez la première tranche de tissu à 0 um. <li> Pour enregistrer la reconstruction, sélectionnez Fichier> Enregistrer les données sous. Enregistrer après chaque importation de fichier, donc la récupération si une erreur est faite est aussi facile que de re-charger le fichier précédent.
- Pour ajouter de la prochaine tranche de tissu à la reconstruction, cliquez sur Fichier> Ajouter à afficher. Sélectionnez le fichier .DAT doit être annexée, et cochez la case 'Merge'.
- Suivez l'étape 1.4.3 pour régler à nouveau la position Z du fichier de trace nouvellement importée. Sélectionnez uniquement les contours gauche et droite nouvellement ajoutées dans la fenêtre principale pour éviter de déplacer les autres traces. Réglez chaque fichier de trace successive à 50 um de la position Z du contour précédent pour les 50 sections um. (Première contour: z = 0, deuxième contour: z = 50, troisième contour: z = 100, etc.)
- Pour ajuster la position X, Y de certains contours et des marqueurs, cliquez sur le 'Activer la traduction avec la souris' bouton et faire glisser les contours pour les aligner sur les contours des tissus précédents. Gardez la fois les contours gauche et droite de la trace actuelle sélectionnéspour permettre le mouvement synchrone.
- Pour faire tourner les traces dans le sens horaire ou antihoraire pour aligner les marqueurs de la ligne médiane, sélectionnez le bouton «Z-axe de rotation». Pour retourner contours à travers l'axe Y (si le contour gauche est sur la droite) sélectionnez les deux contours et les marqueurs importés, clic droit, sélectionnez 'Set Angle de rotation », et entrez' 180 'dans la' rotation Y '.
- Veiller à ce que les ventricules et médianes des marqueurs sont mieux alignés avant d'enregistrer le fichier de reconstruction, comme à l'étape 1.4.4.
- Répétez les étapes 1.4.5 à 1.4.9 pour chaque tranche de tissu suite jusqu'à ce que tous ont été importés et bien alignées.
- Pour afficher les données de volume de la reconstruction de série, cliquez sur Analyse> 'Marqueurs et analyse Région »et sélectionnez« Résumé 3D Contour ". Sélectionnez tous les contours dans le panneau de gauche, puis cliquez sur le bouton «Visualisation 3D 'pour afficher la reconstruction 3D finale.
2. humain: Analyse des périventriculaire Cellular intégrité et la modélisation 3D du ventricule latéral
2.1) Analyse des données d'IRM humaines
NOTE: Les protocoles sont répertoriés pour créer des reconstructions d'image 3D et la quantification volumétrique des ventricules latéraux et évaluer les changements volumétriques au fil du temps en utilisant l'analyse de superposition longitudinale. Il est important de noter que la cohérence dans la collecte de données MR (par exemple, la machine et la force de l'aimant, l'épaisseur de coupe, de l'orientation et de la résolution) et le traitement post-acquisition sont des critères extrêmement importants pour l'inclusion des ensembles de données 20.
- Segmentation ventriculaire
NOTE: ITK / à déclic est utilisé pour segmenter les ventricules de haute résolution des images IRM pondérées en T1. En variante, d'autres logiciels freeware comme Freesurfer peut être utilisé.- Ouvrir ITK / Snap, Fichier> Ouvrir une image en niveaux de gris. Sélectionnez le fichier souhaité et ouvert comme un (fichier NITFI) de fichier .nii.
- Faites défiler chaque anatplan mique, notant anomalies ventriculaires (régions sténosées, grandes ou petites cornes temporelles, etc.). Dans la palette d'outils principale cliquez sur 'Snake ROI outil'. Cliquez sur "Segment 3D '. Sélectionnez l'option 'intensité de la région ».
- Cliquez sur 'Preprocess Image'. Sélectionnez 'dessus', pour inclure les régions ci-dessous d'un certain seuil d'intensité afin de souligner le retour sur investissement en blanc. Enregistrez intensité maximale en utilisant la barre coulissante. Définissez le seuil à 15% de l'intensité maximale (record cette valeur). Réglez le paramètre de la douceur à 10. Cliquez sur 'OK', puis 'Next'.
- Ajouter 10-12 petit (taille 2) «bulles» pour chaque ventricule: deux dans la corne frontale antérieure, sept régulièrement espacées le long de la surface supérieure du corps de ventricule latéral, l'un dans la corne occipitale et un dans la corne temporale du ventricule latéral. 'Sélectionnez Paramètres' et réglez la force de courbure à 0,4. Cliquez sur l'icône Lecture pour commencer l'évolution de contour actif.
- Cliquez sur "Mise à jour Mesh 'pour visualiser la surface; vérifier "Auto-Update '. Arrêtez la segmentation lorsque toutes les zones du ventricule latéral sont inclus dans la région d'intérêt (ROI). Éviter l'inclusion du troisième ventricule. Cliquez sur «Terminer».
- Modifier manuellement l'image si nécessaire pour éliminer les régions non désirés par les méthodes suivantes (généralement besoin d'effacer les fuites troisième ventricule). Utiliser l'outil manuellement '3D Scalpel' supprimer des régions excédentaires ou manuellement utiliser l'outil «Pinceau» par «Clear Label» comme l'étiquette de dessin actif pour effacer toute inclusion au-delà de ROI.
- Enregistrer les résultats de segmentation comme une image .nii (de format de fichier 'nifti').
- Pour obtenir le volume du ventricule totale, sélectionnez «Segmentation> Volume» et de la statistique; obtenir le volume total du ventricule utilisant set étiquette de couleur.
- Représentation longitudinale de ventricules latéraux De MRIScans
REMARQUE: L'utilisationLogiciel Mango, ROI longitudinales sont superposées à démontrer qualitativement et quantitativement les variations de volume du ventricule dans les sujets de plus de temps.- Ouvrir Mango. Cliquez sur Fichier> Charger ROI du point de premier temps de retour sur investissement (de base) en VERT. File> Load ROI du deuxième point de temps de retour sur investissement RED. Enregistrer superposition longitudinale en sélectionnant Fichier> Enregistrer sous; attribuer à chaque image sous "name_ de fichier [premier point de l'âge de temps] - [Point âge seconde fois] .nii '.
- Ouvrez ITK-SNAP. Rouvrez le ROI combinée comme «l'image en niveaux de gris», en sélectionnant Segmentation> Load From Image> fichier combiné de ROI. Pour obtenir des données de volume longitudinales courent le suivant: Segmentation> Volume et statistiques> Étiquette 1 (rouge) = volume d'expansion; Etiquette 2 (vert) = volume de la sténose; Label du volume 3 (bleu) = base.
2.2) périventriculaire Human Tissue Préparation et analyse
- Consignes de sécurité pour travailler avec les tissus humains
- Obtenir appropformation à la sécurité riée (par ex., cours pathogènes à diffusion hématogène).
- Observer (universels) les précautions de sécurité standard. Porter des gants. Changer de gants avant de toucher tout équipement ou surfaces commune qui ne sont pas à usage unique. Étiqueter les articles traités systématiquement lorsque l'on travaille avec les tissus humains avec des désignations "d'utilisation des tissus humains».
- Suivez les pratiques de décontamination de tous les éléments en contact avec le tissu humain. Bleach tous les liquides contaminés pendant un minimum de 24 heures avant leur élimination, traiter les surfaces contaminées avec une serviette imbibée eau de Javel (par exemple, de paillasse) ou en plaçant objet directement dans l'eau de Javel (par exemple des pinces).
- Préparer un plan d'urgence pour le contact avec les tissus humains directement sur la peau, ce qui peut inclure tremper une serviette en papier dans l'eau de Javel et la tenue sur la zone touchée (5-10 min).
- Utilisez élimination des déchets approprié pour tous les éléments qui entrent en contact avec les tissus humains.
- Ventricule latéral Préparation Mont entiers
- Beginning avec un hémisphère intact (fixe formol à 10% et rincées avec de 0,1 M PBS), tranche de 1,5 cm d'épaisseur grâce à des coupes coronales en utilisant tout l'hémisphère grand couteau.
NOTE: Tous les protocoles de fixation nécessitent une vérification d'anticorps avant. - sections d'étiquetage avant vers l'arrière à partir de la première section contenant le ventricule latéral. Utilisez un système d'étiquetage alpha-numérique, marquage des tranches avec des lettres (avant vers l'arrière) et du paragraphe avec des numéros (de haut en bas). Éviter de perturber la surface épendymaire.
- Utilisation de scalpel microchirurgical, disséquer paroi du ventricule 1 cm de profondeur, maintenir une section continue pour l'ensemble de paroi latérale. Subdiviser mur comme nécessaire pour créer des sections de taille appropriée pour la coloration bien. section de Notch sur le côté opposé de la paroi du ventricule afin d'identifier l'orientation supérieure / inférieure.
- Effectuer l'extraction de l'antigène par incubation des coupes de tissus dans 10 mM de tampon citrate de sodium (pH 6,0) à 100 ° C pendant 10 à 20 min à l'aide d'une double boiler (temps d'incubation optimale est déterminée empiriquement). Rincer trois fois dans du PBS / 0,1% de Triton X-100 (TX-PBS).
- Bloquer dans du sérum de cheval à 10% en utilisant du PBS / PBS-TX pendant 1 heure à température ambiante.
- Incuber avec des anticorps primaires pendant 48 heures à 4 ° C. Pour visualiser la doublure de paroi du ventricule, immunocoloration montures entières avec les combinaisons d'anticorps suivantes: souris anti-β-caténine (1: 250); chèvre anti-GFAP (1: 250); de lapin anti-AQP4 (1: 400).
- Effectuez toutes les étapes ultérieures dans l'obscurité. Rincer le tissu trois fois dans du PBS, incuber avec des anticorps secondaires (1: 500) pendant 24 heures à 4 ° C ou 2 heures à la température ambiante, un autre rinçage et trois fois dans du PBS. Incuber tissu en DAPI pendant 7 min à température ambiante, puis avec un autre 3 rinçages dans du PBS.
- Préparer le tissu pour la dissection finale en couvrant un plat en bas de cire avec du parafilm. Remplissez plat avec du PBS, placer le tissu dans un plat à l'aide de pinces fines, éviter de faire contact avec la paroi épendymaire.
- Sous le microscope de dissection, fermement sécure tissu sur ses broches latérales aide. Avec un couteau de couteau microchirurgicale 22,5 °, créer des sections minces uniformes (environ 300 um d'épaisseur) de la paroi du ventricule latéral. Pour les grandes sections ou des sections à courbure difficile, coupé en petits cubes avant de couper en sections finales pour le montage et l'emplacement de la note.
- Placez délicatement côté ependyma section disséqué monter sur diapositive à l'aide de pinces fines, prenant note de l'emplacement et l'orientation régionale sur la diapositive. Couvrir avec le tissu mince couche de aquapolymount, en prenant soin d'éviter les bulles. Placez lamelle sur un tissu, ajouter aquapolymount supplémentaires nécessaires pour combler les lacunes dans lamelle.
- Placez sections montés dans sombre et sec pendant 2-3 jours à température ambiante. Conserver dans Slidebox à 4 ° C.
- Beginning avec un hémisphère intact (fixe formol à 10% et rincées avec de 0,1 M PBS), tranche de 1,5 cm d'épaisseur grâce à des coupes coronales en utilisant tout l'hémisphère grand couteau.
- Immunohistochimie et analyse histologique
- En utilisant la microscopie confocale pour voir immunohistochimie fluorescente, définir le plan focal d'imagerie à la surface du ventricule, tel que déterminé par l'utilisation of β-caténine (marqueur pour adhérentes apical jonction protéines de cellules épendymaires). Délimiter régions de couverture de la cellule épendymaire et astrogliose de surface (GFAP de coloration à la surface du ventricule).
- Pour le document et le montage de la surface du ventricule ensemble, utiliser des images qui se chevauchent pour couvrir toute la surface. Pour créer montage d'images de série, ouvrir Adobe Photoshop. Utilisez la commande Fichier> Automatisation> Photomerge de mise en page> interactif pour sélectionner les images à superposer, faisant des ajustements manuels si nécessaire.
- Créez un nouveau calque pour tracer montage pour générer la représentation caricaturale de la couverture cellulaire de ependyma intacte ou gliose de surface du ventricule. Répétez l'opération pour chaque diapositive ou ROI. Compiler toutes les sections pour reconstruire carte de paroi du ventricule et un lien vers la région correspondante sur la reconstruction IRM.
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Representative Results
traçage du contour des ventricules latéraux de souris à base de immunocolorées 50 um coupes coronales et reconstructions 3D (Figure 3) permet aux données de volume pour être recueillies dans différents paradigmes expérimentaux à l'aide de la souris en tant que système modèle pour une maladie ou une blessure. Critical de cette procédure est l'exclusion des régions dans lesquelles les parois latérales du ventricule adhèrent les uns aux autres. Par subsegmenting régions des ventricules et désignant une couleur différente pour chaque région (figure 3C), sections contiguës peuvent être respectées et le volume régionale et totale peuvent être calculées à partir de sous-segments compilés.
Des études similaires peuvent être effectuées en utilisant l'IRM du cerveau associées à la segmentation semi-automatique (ITK-SNAP) des ventricules latéraux pour des rendus 3D. Pour appariement direct des volumes du ventricule et de l'analyse des tissus péri-ventriculaire, pré- ou post-mortem IRM sont segmentés et alignés pour créer des reconstitutions en 3D (
Figure 1: Exécution segmentation du ventricule latéral en utilisant l'outil de ROI Serpent ITK / Aligner (A) «Bubbles» sont ajoutés à ventricules latéraux. (B) 'Bubbles' élargir cours de l'évolution de contour actif. (C) Segmentation est terminée lorsque tout le ventricule latéral est rempli. (Il est pris soin d'éviter la 3 e ventricule.)
Figure 2: Human dissection de la paroi du ventricule latéral (
Figure 3: Tracing et la reconstruction 3D des ventricules latéraux de souris (Une section de cerveau de souris coronale y compris ventricules latéraux, décrites par les cellules épendymaires S100β immunoréactives (*, ventricules latéraux; support, région du adhé. sion; barre d'échelle, 500 um). (B) Souris ventricules latéraux sont tracées comme des «contours» et disposées comme des sections de sous-segmenté, à l'exclusion des régions d'adhérence intraventriculaire d'interférer avec l'analyse volumétrique. (C) la reconstruction 3D des contours de ventricule latéral. Jaune, contour du volume du cerveau entier couvrant la région d'intérêt contenant des ventricules latéraux.
Figure 4: base-IRM segmentation du ventricule latéral (A) images IRM sont assemblés. (B) ventricule latéral est défini comme ROI (rouge). (C) reconstruction 3D permet pour la quantification et la visualisation volumétrique qualitative du ventricule latéral.
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Figure 5: évaluation de l'expansion du ventricule longitudinale longitudinale IRM à partir de plusieurs points peuvent être aligné et le couvrit de visualiser et de quantifier l'expansion du volume du ventricule dans les sujets au fil du temps.
Figure 6: évaluation immunohistochimique et la cartographie régionale de la surface humaine du ventricule latéral (A) des zones de cellules ependyma intactes, décrit par β-caténine coloration, montrent un aspect de pavés (astérisque) et sont délimitées par une ligne pointillée des régions de astrogliose sur la surface du ventricule (GFAP + coloration). (B) images confocale série sont superposées pour générer un montage régionale et tracées en utilisant Adobe Photoshop pour une représentation de bande dessinée d'organisation cellulaire à la surface du ventricule. (C) de la bande dessinéel'image montage est mappé à la surface du ventricule sur l'IRM à base reconstruction du ventricule 3D correspondant. (Barre d'échelle (A), 40 um; barre d'échelle (B), 1 mm)
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Discussion
Nous présentons des outils et des protocoles qui peuvent être utilisés pour évaluer l'intégrité du système ventriculaire du cerveau chez les souris et chez l'homme. Ces outils, cependant, peuvent également être appliqués à d'autres structures du cerveau ou des systèmes d'organes qui subissent des changements dus à une lésion, une maladie, ou au cours du processus de vieillissement 14,21,22. Les stratégies présentées profitent d'un logiciel qui permet l'alignement des séquences d'IRM transversales et longitudinales de générer des volumes 3D représentations de régions ou de structures d'intérêt spécifiques. Séquences longitudinale IRM permettent compilation des changements de volume 3D qui se produisent au fil du temps et peut être étendue pour inclure volume total du cerveau, pour ventricule latéral au total des rapports de volume du cerveau, et / ou d'autres structures du cerveau (par exemple, noyau sous-thalamique 23 ou corps calleux faisceaux de matière blanche en utilisant l'imagerie du tenseur de diffusion pondérée). Ensemble, une analyse complète des changements structurels du cerveau peut être effectuée. En fin de compte,pour évaluer les changements liés à l'âge et à la maladie à-structures cérébrales une collection de techniques d'imagerie multimodaux sont nécessaires pour fournir une image plus précise de l'état de santé du cerveau 24. Documentation et de la compilation des données critiques de la structure, ainsi que la variabilité du sujet-objet et la gamme de variabilité entre sujets, pourraient idéalement être utilisés pour générer des ultra-haut champ IRM atlas à meilleur diagnostic clinique de guidage de tissu dans la santé ou la maladie.
Plusieurs étapes critiques sont important de noter afin de diminuer acquisition et de traitement de la variabilité entre et au sein des ensembles de données en question. Idéalement pour obtenir des séquences de données appariées, le même scanner IRM et la séquence de type doit être utilisé pendant toute l'étude. Tissu cérébral post-mortem est souvent de qualité variable; facteurs essentiels tels que la cause du décès, l'intervalle post-mortem, la qualité de la perfusion, et la longueur de temps dans un fixateur tous peuvent affecter la coloration efficacité et la nécessité d'uneantigène protocole de récupération. En outre, la taille du cerveau humain nécessite plusieurs sections de tranches, chaque tranche nécessiter une manipulation supplémentaire pour obtenir un tissu contenant les régions d'intérêt. Par conséquent, il est essentiel que l'emplacement et l'orientation de chaque section est clairement indiqué et enregistré. En fin de compte, le principal problème avec l'analyse de tissus post-mortem est précisément ce que - il est post-mortem - et donc ne fournit une vue instantanée du tissu à la fin de la vie. Techniques d'imagerie multimodaux améliorées sont nécessaires pour l'analyse en temps réel des modifications apportées aux structures du cerveau et des informations morpho-fonctionnelle avec une résolution cellulaire.
Des études sur souris permettent interrogation de la variable de condition humaine par variable et ne présentent pas un grand nombre des difficultés rencontrées lorsque l'on travaille avec les tissus humains. Des études sur souris utilisées pour modéliser les maladies humaines ou des blessures grâce à l'analyse de la dynamique des structures causales peuvent offrir des améliorations pour la maladie-modèle validation. Toutefois, des différences spécifiques aux espèces doivent être notés. Dans notre analyse des ventricules latéraux, il est important de noter que les souris conservent une niche de cellules souches actif le long de la paroi latérale des ventricules latéraux et de la tige à médiation cellulaire réparation de régénération du ventricule doublure se produit en cas de légère perte de cellule épendymaire, comme trouvé chez les souris âgées ou lorsque la dénudation de la cellule épendymaire limité produit par l'exposition de l'épendyme à la neuraminidase 19. En revanche, les humains ne maintiennent pas une niche de cellules souches robuste le long des parois des ventricules latéraux 25-27 et petits, le cas échéant, la régénération est probable. Contrairement aux souris âgées, les humains âgés montrent astrogliose étendue à la surface du ventricule associée à l'expansion du ventricule 6. Ce niveau de dénudation et «cicatrisation» de la paroi du ventricule peut être modélisée à l'aide de neuraminidase souris à dénuder le revêtement de ventricule de cellules épendymaires 6,28. En outre, il est important de reconnaître èmeà souris vivarium entretenu ne éprouver des infections, la maladie ou un traumatisme, présentant des antécédents médicaux très différent de la plupart des sujets humains. En outre, les souris ne montrent généralement pas de maladie neurodégénérative liée à l'âge, ou ventriculomégalie gliose périventriculaire. Par conséquent, pour observer ces phénotypes, ils doivent être modélisé. En fin de compte, pas de modèle animal peut récapituler pleinement l'ontogenèse, la physiopathologie, et la complexité des symptômes de la maladie humaine et ces limites doivent être reconnues et dûment communiqué.
En résumé, nous présentons des techniques et des protocoles pour évaluer les volumes latéraux ventricule dans souris et l'humain. Ventricules peuvent être rendus en 3D et l'analyse longitudinale permet compilation des changements de volume spatio-temporelles. En outre, en utilisant des tissus du cerveau jumelé nous démontrons comment les caractéristiques cellulaire peut être liée à des changements dans les volumes du ventricule. Les récents résultats démontrant des niveaux de Aquaporin-4 expression accrue dans les zones de periventricular gliose suggèrent œdème long de la surface du ventricule. Par conséquent enquêtes futures appariement FLAIR-IRM avec l'histologie des tissus permettra d'améliorer notre compréhension de la CSF et de l'échange de liquide interstitiel, et de fournir des informations essentielles sur la santé du système de ventricule et comment sa détérioration affecte diverses fonctions du cerveau.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Life Technologies | 21600-069 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 19210 | Use at 4% in PBS, 4 °C |
| Normal Horse Serum | Life Technologies | 16050 | 10% in PBS-TX (v/v) |
| Normal Goat Serum | Life Technologies | 16210 | 10% in PBS-TX (v/v) |
| Triton X-100 (TX) | Sigma-Aldrich | T8787 | 0.1% in PBS (v/v) |
| Vibratome | Leica | VT1000S | |
| Fluorescence Microscope | Zeiss | Imager.M2 | |
| Camera | Hamamatsu | ORCA R2 | |
| Microscope Stage Controller | Ludl Electronic Products | MAC 6000 | |
| Stereology software | MBF Bioscience | Stereo Investigator 11 | |
| Stereology software | ImageJ/NIH | NIH freeware | |
| 3D Reconstruction software | MBF Bioscience | Neurolucida Explorer | |
| Confocal Microscope | Leica | TCS SP2 | |
| MRI Software | |||
| Freesurfer | https://surfer.nmr.mgh.harvard.edu/fswiki/DownloadAndInstall | Segmentation and Volume | |
| ITK-Snap | http://www.itksnap.org/pmwiki/pmwiki.php | Segmentation and Volume | |
| Multi-image Analysis GUI (Mango) | http://ric.uthscsa.edu/mango/ | Longitudinal overlay | |
| Whole Mount Equipment | |||
| 22.5° microsurgical straight stab knife | Fisher Scientific | NC9854830 | |
| parafilm | |||
| wax bottom dissecting dish | |||
| pins | |||
| fine forceps | |||
| aquapolymount | |||
| Dissecting Microscope | Leica | MZ95 | |
| Whole Mount Antibodies | |||
| mouse anti-b-catenin | BD Bioschiences, San Jose, CA, USA | 1:250 | |
| goat anti-GFAP | Santa Cruz Biotechnology | 1:250 | |
| rabbit anti-AQP4 (aquaporin-4) | Sigma-Aldrich | 1:400 | |
| Coronal Antibodies | |||
| Anti-S100β antibody | Sigma-Aldrich | 1:500 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Life Technologies | D-1306 | 10 µg/ml in PBS |
References
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