3D-Modellierung der Seitenventrikel und histologische Charakterisierung Periventrikuläre Tissue in Mensch und Maus
Summary
Using MRI scans (human), 3D imaging software, and immunohistological analysis, we document changes to the brain’s lateral ventricles. Longitudinal 3D mapping of lateral ventricle volume changes and characterization of periventricular cellular changes that occur in the human brain due to aging or disease are then modeled in mice.
Abstract
The ventricular system carries and circulates cerebral spinal fluid (CSF) and facilitates clearance of solutes and toxins from the brain. The functional units of the ventricles are ciliated epithelial cells termed ependymal cells, which line the ventricles and through ciliary action are capable of generating laminar flow of CSF at the ventricle surface. This monolayer of ependymal cells also provides barrier and filtration functions that promote exchange between brain interstitial fluids (ISF) and circulating CSF. Biochemical changes in the brain are thereby reflected in the composition of the CSF and destruction of the ependyma can disrupt the delicate balance of CSF and ISF exchange. In humans there is a strong correlation between lateral ventricle expansion and aging. Age-associated ventriculomegaly can occur even in the absence of dementia or obstruction of CSF flow. The exact cause and progression of ventriculomegaly is often unknown; however, enlarged ventricles can show regional and, often, extensive loss of ependymal cell coverage with ventricle surface astrogliosis and associated periventricular edema replacing the functional ependymal cell monolayer. Using MRI scans together with postmortem human brain tissue, we describe how to prepare, image and compile 3D renderings of lateral ventricle volumes, calculate lateral ventricle volumes, and characterize periventricular tissue through immunohistochemical analysis of en face lateral ventricle wall tissue preparations. Corresponding analyses of mouse brain tissue are also presented supporting the use of mouse models as a means to evaluate changes to the lateral ventricles and periventricular tissue found in human aging and disease. Together, these protocols allow investigations into the cause and effect of ventriculomegaly and highlight techniques to study ventricular system health and its important barrier and filtration functions within the brain.
Introduction
Ein ependymalen Zellschicht Leitungen Ventrikelsystem des Gehirns welche bidirektionalen Barriere und Transportfunktionen zwischen der Rückenmarksflüssigkeit (CSF) und interstitieller Flüssigkeit (ISF) 1-3. Diese Funktionen helfen, das Gehirn Giftstoff-frei und in physiologische Gleichgewicht 2,3 zu halten. Beim Menschen Verlust von Teilen dieses Futter durch Verletzung oder Krankheit scheint nicht in regenerative Ersatz Ergebnis als in anderen epithelialen Auskleidungen gefunden; eher Verlust ependymaler Zellenabdeckung scheint in periventrikuläre Astrogliose mit einem Geflecht von Astrozyten abdeckt Regionen Ependymzellen entblößt an der Herzkammer Oberfläche führen. Schwerwiegende Auswirkungen auf wichtige CSF Tausch / ISF und Clearance-Mechanismen würde vorhergesagt werden, um den Verlust dieser Epithelschicht 1,2,4-7 führen.
Ein gemeinsames Merkmal der menschlichen Alterung Seitenventrikel (Ventrikulomegalie) und die damit verbundenen periventrikuläre Ödem als observ vergrößertvon MRI und flüssigkeits abgeschwächten Inversion-Recovery-MRI (MRI / FLAIR) 8-14 ed. Um die Beziehung zwischen Ventrikulomegalie und der zellulären Organisation des Ventrikels Futter zu untersuchen, wurden postmortalen humanen MR-Sequenzen mit histologischen Präparationen Seitenventrikel periventricular Gewebe abgestimmt. In Fällen von Ventrikulomegalie hatte wesentliche Bereiche Gliose ependymaler Zellenabdeckung entlang der lateralen Ventrikelwand ersetzt. Wenn Ventrikel Expansion wurde nicht von MRI-basierte Volumen-Analyse nachgewiesen, die ependymaler Zellauskleidung war intakt und Gliose nicht entlang der Ventrikel Futter 6 erkannt. Diese kombinatorischen Ansatz stellt die erste umfassende Dokumentation Detaillierung Veränderungen im zellulären Integrität des Seitenventrikels Futter mit wholemount Zubereitungen von Teilen oder der gesamten seitlichen Ventrikelwand und 3D-Modellierung der Herzkammer 6 Bände. Mehrere Krankheiten (Alzheimer-Krankheit, Schizophrenie) und Verletzungen (Schädel-Hirn-Verletzung)zeigen Ventrikulomegalie als frühe neuropathologischen Merkmal. Denudation Bereiche der ependymalen Zellauskleidung dadurch würde vorhergesagt werden, die den normalen ependymalen Zellfunktion stören und beeinträchtigen die homöostatische Gleichgewicht zwischen CSF / ISF Fluid und Stoffaustausch. So wird eine gründlichere Untersuchung der Änderungen der ventrikulären System, seine zelluläre Zusammensetzung und der Folge, um die darunterliegende oder benachbarte Hirnstrukturen schließlich beginnen, mehr über die Neuropathologie mit Ventrikel Erweiterung assoziiert zu offenbaren.
Das Fehlen von multimodalen Bilddaten, insbesondere Längsschnittdaten-Sequenzen zusammen mit begrenzten Zugang zu entsprechenden histologischen Gewebeproben ermöglicht Analyse der menschlichen Hirnerkrankungen schwierig. Modellierung Phänotypen in den menschlichen Alterungsprozess oder Krankheit gefunden werden oft mit Mausmodellen erreicht werden und Tiermodellen zu einem unserer besten Mittel, um Fragen über die menschliche Krankheit Initiierung und Progression zu erkunden. Mehrere Studien ingesunden jungen Mäusen haben die Zellarchitektur der Seitenventrikel Wänden und dem darunterliegenden Stammzellnische 4,7-15 beschrieben. Diese Studien wurden erweitert, um die 3D-Modellierung und zelluläre Analyse der Herzkammer Wände durch Alterung 6,15 umfassen. Weder periventrikuläre Gliose noch Ventrikulomegalie sind in alten Mäusen beobachtet, statt Mäuse zeigen eine relativ robust subventicular Zone (SVZ) Stammzellnische darunterliegenden zu einer intakten Zelle ependymaler Futter 6,15. Somit ergeben sich markante speziesspezifische Unterschiede sowohl in der allgemeinen Wartung und Integrität der Seitenventrikel Auskleidung während des Prozesses der Alterung 6,15. Daher eine optimale Nutzung Mäusen, die Bedingungen in Menschen gefunden abzufragen, Unterschiede zwischen den zwei Arten müssen gekennzeichnet werden und in geeigneter Weise in jeder Modellierungsparadigma betrachtet. Hier präsentieren wir Verfahren, die Längs Änderungen an den lateralen Ventrikel und zugehörige periventrikuläre Gewebe in Mensch und m bewertenOuse. Unsere Verfahren sind 3D-Rendering und Volumetrie von Maus und menschlichen Herzkammern, und die Verwendung von immunhistochemischen Analyse der ganze Berg Zubereitungen periventrikuläre Gewebe sowohl zelluläre Organisation und Struktur zu charakterisieren. Zusammen stellen diese Verfahren liefern ein Mittel, um Änderungen in der Herzkammersystem und die zugehörige periventricular Gewebe zu charakterisieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wir präsentieren Werkzeuge und Protokolle, die verwendet werden können, um die Integrität der Ventrikelsystem des Gehirns bei Mäusen als auch bei Menschen zu bewerten. Diese Werkzeuge können jedoch auch auf andere Hirnstrukturen oder Organsysteme, die Änderungen aufgrund einer Verletzung, Krankheit oder während des Vorgangs der Alterung 14,21,22 zogen angewendet werden. Die Strategien vorgestellt Profitieren Sie von Software, die die Ausrichtung der Querschnitts- und Längs MRI-Sequenzen zu 3D-Volumend…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
An NINDS Grant NS05033 (JCC) supported this work. The University of Connecticut RAC, SURF and OUR programs provided additional support.
Materials
| Name of the Materal/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Life Technologies | 21600-069 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 19210 | Use at 4% in PBS, 4 °C |
| Normal Horse Serum | Life Technologies | 16050 | 10% in PBS-TX (v/v) |
| Normal Goat Serum | Life Technologies | 16210 | 10% in PBS-TX (v/v) |
| Triton X-100 (TX) | Sigma-Aldrich | T8787 | 0.1% in PBS (v/v) |
| Vibratome | Leica | VT1000S | |
| Fluorescence Microscope | Zeiss | Imager.M2 | |
| Camera | Hamamatsu | ORCA R2 | |
| Microscope Stage Controller | Ludl Electronic Products | MAC 6000 | |
| Stereology software | MBF Bioscience | Stereo Investigator 11 | |
| Stereology software | ImageJ/NIH | NIH freeware | |
| 3D Reconstruction software | MBF Bioscience | Neurolucida Explorer | |
| Confocal Microscope | Leica | TCS SP2 | |
| MRI Software | |||
| Freesurfer | https://surfer.nmr.mgh.harvard.edu/fswiki/DownloadAndInstall | Segmentation and Volume | |
| ITK-Snap | http://www.itksnap.org/pmwiki/pmwiki.php | Segmentation and Volume | |
| Multi-image Analysis GUI (Mango) | http://ric.uthscsa.edu/mango/ | Longitudinal overlay | |
| Whole Mount Equipment | |||
| 22.5° microsurgical straight stab knife | Fisher Scientific | NC9854830 | |
| parafilm | |||
| wax bottom dissecting dish | |||
| pins | |||
| fine forceps | |||
| aquapolymount | |||
| Dissecting Microscope | Leica | MZ95 | |
| Whole Mount Antibodies | |||
| mouse anti-b-catenin | BD Bioschiences, San Jose, CA, USA | 1:250 | |
| goat anti-GFAP | Santa Cruz Biotechnology | 1:250 | |
| rabbit anti-AQP4 (aquaporin-4) | Sigma-Aldrich | 1:400 | |
| Coronal Antibodies | |||
| Anti-S100β antibody | Sigma-Aldrich | 1:500 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Life Technologies | D-1306 | 10 µg/mL in PBS |
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