Abstract
다른 병리 생리 학적 변화 중, 담배 연기 만성 노출은 미생물 감염 및 종양 발생률 흡연자의 감수성 증가로 연결되었다 염증 및 면역 억제를 야기한다. 생체 내 인간 말초 혈 단핵 세포에서 수용체 - 매개 면역 반응의 억제 (한 PBMC) 연기 성분으로 처리하는 메커니즘을 연구 및 담배 제품에 대한 노출 가능성이있는 장기 효과를 평가하는 매력적인 방법이다. 여기서 우리는 박테리아 리포 폴리 사카 라이드, 수신자 같은 수용체 4 리간드에 의해 자극 된 PBMC를 사용하여 생체 분석을 수행하는 방법을 최적화. 전체 연기 된 배지 (WS-CM)의 효과는, 가연성 담배 제품 준비 (TPP), 니코틴은 생체 분석에 PBMC를하여 사이토 카인 분비와 표적 세포 사멸에 조사 하였다. 우리는 그 표시 분비 사이토킨 IFN-γ, TNF, IL-10, IL-6, IL-8, 사이토 카인의 세포 내 IFN-47 ;, TNF-α 및 MIP-1α는 WS-CM-노출 PBMC를 억제했다. K562의 표적 세포 살해 분석으로 산출 된 PBMC의 효과기 세포 용해 기능은 또한 WS-CM에 노출 감소; 니코틴은 이러한 분석에 최소한의 효과적이었다. 요약하면, 우리는 생체 내 분석의 TPP를 효과를 평가하기 위해 개선 된 분석법의 세트를 제공하고,이 방법은 용이하게 다른 관심있는 제품을 테스트하도록 구성 될 수있다.
Introduction
심혈관 질환 (CVD), 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), 암 1,2- 포함한 만성 흡연의 건강에 미치는 악영향에 기술 점의 실질적인 몸체. 만성 흡연은 염증과 면역 억제를 일으키는 것으로 알려져 있으며, 이러한 변화는 흡연자 3 미생물 감염과 암의 위험 증가에 기여할 것으로보고되고있다. 생체 외 및 생체 기술이 유용의 병태 생리 학적 효과의 분자 기초를 해명에 담배 연기 4-9 (표 1)과 각종 담배 제품 (10, 11)의 새로운 규정을 안내하기위한 중요한 도구로 인식된다.
예를 들어, 우리는 전체 연기 된 배지 (WS-CM) 및 총 입자상 물질 (TPM) 등의 가연성 담배 제품 준비 (TPP를)이 훨씬 더 독성과 손상에 있음을 증명하고있다불연성 TPP를 또는 니코틴 (12, 13)보다 DNA. 게시 된 작업과 일치, 그것은 최근에 가연성 TPP를 또는 니코틴 (12, 13)이보고되었다. 게시 된 작업과 일치, 우리는 최근 가연성 TPP를 표시 한 면역 억제의 원인이 보도했다. 이것은 수용체 (TLR) -ligands 같은 톨의 억제에 의해 입증 된, 생체 모델 (14)에 한 PBMC에 의해 살해 (K562) 사이토 카인 분비를 자극, 세포를 대상으로. 흡연 - 유도 된 질병 과정에서 염증의 중요성을 감안하면, 담배 연기의 면역 조절 성 효과를 평가하기위한 분석 조건의 추가적인 최적화는 본 조사된다.
생체 외 분석은 일반적으로 세포 내 사이토 카인을 측정뿐만 아니라 분석 죽이고 14 K562 세포 내에서 세포 독성 T 세포 및 NK 세포 용해 기능을 분비. 분석은 WS-CM 및 니코틴과 PBMC의 후속 자극과 사전 배양을 포함TLR와 S 3 일에 걸쳐 주작 동근; 최종 판독은 효소 면역 분석법 (ELISA를)를 사용하여 및 / 또는 유동 세포 계측법으로 수행된다. 우리는 TLR-4 수용체에 결합하고,이 한 PBMC 세포 내 사이토 카인 및 사이토 카인 분비의 자극의 결과로 생산 세균 지질 다당류 (LPS)를 이용했다. 단리 한 PBMC, 세포 사멸 분석, 및 IL-8을 정량 TPP를 우리 또한 본 방법의 면역 조절 효과를 평가하기위한 각종 분석 단계의 최적화 외에. 이러한 방법은 다른 연구 문제를 해결하기 위해 적용 및 추가 규제 맥락에서 담배 제품을 평가하기 위해 정제 할 수있다.
표 1. 체외의 보고서를 간행하고 생체 방법은 담배 제품의 준비 varilus 병태 생리 학적 효과를 연구하는 데 사용 CS, 담배 연기 매체.; CSC, 담배 연기 응축; CSE, 담배 연기 추출물; ELISA, 면역 분석을 효소는 링크; GADPH, 글리 세르 알데히드 -3- 포스페이트 탈수소 효소; qPCR을 정량적 폴리머 라제 연쇄 반응; RT, 정량적 실시간 중합 효소 연쇄 반응; TS, 담배 연기.
| 저자 (연구 년) | Laan의 등 알. (2004) | 무디 등 알. (2004) | Oltmanns 등 알. (2005) | Vayssier (1998) | Witherden 등 알. (2004) | Birrell 등 알. (2008) |
| 세포는 사용 | 인간 기관지 내피 세포 (BEAS-2B), 인간 호중구 | 인간의 폐포 상피 세포 (A549) | 인간기도 평활근 세포 (HASMC) | premonocytic 인간 U937 세포, 인간 단핵 | 폐포 유형 II 상피 세포 (ATII) | 인간 단핵구세포주 (THP-1), 인간 폐 식세포 |
| TPP 사용 | CSE | CSC | CSE | TS | CSE | CS |
| 방법 사용 | ELISA, qPCR에, 마이그레이션, 전기차 이동 | Immunohisto - 화학, 전기, Arrayscan 키트, RT-PCR, ELISA | ELISA, RT-PCR, qPCR에, 전기 영동 | 젤 이동성 변화 | 광학 현미경, 전자 현미경, 전기, ELISA | qPCR에, ELISA, E-toxate 키트 (시그마), P65 플레이트 분석 (TransAM), 전기 영동, 다양한 면역 키트 |
| 측정 | IL-8, GM-CF, AP-1, NF-κB, 마이그레이션 | 히스톤 아세틸 트랜스퍼, 히스톤 아세틸 라제, NF-κB, IL-8, PI κB-α, GADPH | HO-1, GADPH, RANTES, IL-8, 에오 | 열 충격 / 스트레스 단백질 (HSP / 인 Hsp70), HF 전사 인자, NF-κB,TNF-α | 계면 활성제 단백질 (SP-A, SP-C), IL-8, MCP-1, GRO-α, TNF-α, IL-1β, IFN-γ | IL-8, IL-1β, IL-6, TNF-α, MIP1-α, GRO-α, MAPK / JNK / ERK 인산화 cJUN : DNA 결합, 글루타티온, P65 : DNA 결합 |
| 최종 결과 | CSE는 AP-1 활성의 억제를 통해 사이토 카인 생성을 하향 조절한다. | H 2 O 2와 CSC는 차별적으로, 히스톤 탈 아세틸 화 효소의 활성을 감소, 히스톤 단백질의 아세틸 화를 강화 염증성 사이토 카인의 방출을 조절한다. | 담배 연기는 담배 연기에 의해 TNF-α, 20 % CSE 이하 IL-8 릴리스, 에오 탁신의 억제 및 RANTES에 의해 강화 HASMC에서 IL-8의 출시를 일으킬 수 있습니다. | TS는 인 Hsp70 과발현 및 활동과 TNF-α 자료를 결합 NFkB의 억제와 관련이 HF 전사 인자를 활성화. | 감소 ATII 세포 유래 케모카인 수준의 타협 alveoLAR 수리, 담배 연기에 의한 폐포 손상과 폐기종에 기여. | 데이터는 왜 흡연자가 증가 호흡기 감염에 대한 기계적인 설명을 제공합니다. 선천성 반응 억제는 IL-8의 증가를 수반한다. |
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Protocol
참고 : 동의서 본 연구를 수행 할 수는 좋은 임상 사례 당, IRB 승인에 따라 지역 임상 연구 단위에서 얻었다. 피 처리는 다른 PBMC를 세포 배양 실험의 분리 미생물 살균 용품 및 시약을 사용하여, 멸균 조건 하에서 수행된다.
1. WS-CM 준비
- 이전 12 설명 된대로 WS-CM을 생성합니다.
- 35-60-2, 용액에 퍼프 볼륨 초에 퍼프 간격, 퍼프 기간 로즈웰 파크 기념 연구소 (RPMI) 다음과 같은 금연 요법을 사용하여 페놀 레드없이 1640 매체를 통해 네 3R4F 참조 담배에서 연기를 전달하여 WS-CM을 준비 각각 초에. 각각의 혼합물은 20 ml의 샘플을 생성합니다.
- 날짜, 완료 시간, 담배 이름과 번호와 레이블 튜브 (들). -80 °에서 500 ㎕를 분주 즉시 흡연이 완료된 후에 C 보관하십시오.
- 냉동 WS의 분취 량을 분석앞서 설명한 바와 같이 12-㎝ 니코틴, 담배 특이 니트로사민, 다환 방향족 탄화수소의 농도를 결정한다.
PBMC를 2. 분리
- (담배 제품이 아닌 소비자 있습니다) 건강한 기증자로부터 신선한 혈액을 수집 웨이크 포레스트 침례 건강 IRB (15)는 별도의 승인에 따라 아래와 같이 신선한 혈액에서 PBMC를을 분리합니다.
- 혈액 가방의 도착 이전에, 500ml의 병, 가위, 분리 버퍼, 그리고 둘 베코 인산염 완충 생리 식염수 (DPBS) (RT) 바이오 안전성 레벨 2 (BSL-2) 세포 배양 후드에서 준비를해야합니다. 격리 버퍼 빛으로부터 보호되어야한다.
- 거꾸로 혈액 가방을 잡고 그냥이 튜브의 최소 3cm를 떠나 고정 된 경우 아래의 튜브를 잘라.
- 500㎖의 병 뚜껑을 제거하고 병 구멍 위의 튜브를 개최합니다. 혈액 가방을 들고 피가 t에 가방에서 자유롭게 흐를 수 있도록하는 데 반전가방이 비어있을 때까지 그는 병입니다. 피가 거품을 만들지 않도록 똑바로 아래로 대 병의 내부 벽에 흐르게.
- 혈액에 격리 버퍼의 5 비율 : 1의 병에 격리 버퍼를 따르십시오. 엔드 오버 엔드, 10 배, 단단히 병을 씌우고 조심스럽게 반전. 실온에서 1 시간 동안, 조명 오프 배양 세포 배양 후드에서 병을 둡니다.
- 라이트, 밀짚 색의 층은 혈액 위에 구축됩니다. 50 ML 원뿔 튜브에 25 ml의 혈청 학적 피펫을 사용하여이 레이어를 제거합니다. 혈액을 기증 피사체에 따라, 300 ml의 - 수집 된 금액은 50 다를 수 있습니다.
- RT에서 10 분 동안 200 XG에서 튜브를 원심 분리기.
- 어두운 혈액 색의 펠렛을 떠나, 반투명 뜨는을 대기음. 펠렛이 느슨하지만 점성이 될 것입니다.
- 피펫 15ml의 원뿔형 튜브에 차단 완충액 3 ㎖.
- 재현 탁 펠렛까지의 수집 담황색 액체의 모든 50 ㎖에 대한 DPBS 20 ㎖를 추가2.1.5 TEP. 소용돌이는 철저하게 혼합, 여러 관에서 재현 탁 액체를 통합합니다. 이 액체는 혈액 세포를 일시 중지 포함되어 있습니다.
- 전달 피펫, 단계 2.1.8에서 분리 완충액 3ml를 상 전사 현탁 혈구 5 mL를 가진. 두 개의 레이어를 만들 천천히 조심스럽게 세포 현탁액을 포함하는 15 ML 원뿔 튜브를 기울입니다. 최소한의 가속 및 브레이크없이 실온에서 40 분 동안 400 XG에 튜브를 원심 분리기.
- 50 ML 원뿔 튜브로 된 PBMC를 포함하는 결과 흐린 중간 계층 (버피 코트)를 제거하기 위해 전송 피펫을 사용합니다. 그 아래에 다른 명확한 그리기 계층 마십시오. 각 50 ML 원뿔 관에 25 개 미만 mL로 전송합니다.
- 세포를 씻어 (50 ML 원뿔 튜브의 전체 잔량을 채우기 위해 또는 그 이상)의 차가운 버퍼의 25 ML을 추가합니다. 4 ℃에서 10 분 동안 400 XG에서 세포를 원심 분리기.
- 유동 완충액 10 ml로 펠렛을 재현 탁. 이 PBMC를 포함되어 있습니다. 세포를 세어 메신저를 사용당하지 나 장소를 동결 얼음에.
3. 냉동과 PBMC를 녹고
- 원심 분리기 400 x g에서 10 분 동안 단계 2.1.13에서 수집 한 PBMC는.
- 제조업체의 지침에 따라 이소 프로필 알코올 냉동 컨테이너를 입력합니다. 주의 : 이소 프로필 알코올은 가연성 및 급성 독성.
- 20 % 소 태아 혈청 (FBS) 및 10 % 디메틸 설폭 사이드 (DMSO)를 함유하는 RPMI 1640 배지 (39 °의 C)와 펠렛을 재현 탁. 이 동결 RPMI 1640 배지이다. 약 5 × 107 세포 / ㎖를 갖는 현탁액을 초래할 것이다 매체 동결 양 펠렛을 재현 탁. 동결 가능한 세포의 수는 달라진다.
- 2 ML의 cryotubes에 세포 현탁액 1 ml의 분량을 분배하고 냉동 컨테이너 cryotubes를 배치합니다. O / N를 저장하고 cryotubes를 제거하고에 저장 전송 -80 ° C에서 냉동실에 cryotubes와 냉동 컨테이너를 배치-190 ° C -150 ° C 사이의 극저온 냉동기.
- 극저온 저장 부로부터 cryotube을 제거하고 37 ℃ 수조에서 교반과 함께 급속 해동.
- 즉시 10 % FBS, 1 % 펜 / 연쇄상 구균과 1 % L- 글루타민을 함유하는 10 ml의 RPMI 1640 완전 배지 (4 ° C)와 15 ML 원뿔 튜브에 cryotube에서 해동 한 PBMC를 전송합니다. 해동 cryotube의 내용은 최대 세포 생존 (15)을 얻기 위해 가능한 한 빨리 전송 될 것이다.
- 10 분 동안 400 XG에서 PBMC를 원심 분리기.
- 5 ㎖의 RPMI 1640 배지로 완전한 펠렛을 재현 탁하고 세포를 카운트.
- 이러한 트리 판 블루 배제 방법으로 확립 된 방법으로 세포 생존 능력을 측정합니다. 95 % - 일반적으로이 방법으로 세포 생존율은 약 90이다. PBMC를 이제 실험에 사용 준비가 된 것입니다.
4. 세포 사멸 결정
참고 : 여기에 나열된 희석이 스투의 목적을 위해입니다DY. 희석 따라 변경 될 수 있습니다.
- 100 ㎕의 총 부피로 RPMI 완전 배지를 사용하여 96- 웰 플레이트에서 WS-CM 또는 니코틴 희석 / 웰, 이하 나타낸 바와 같이.
- 다음 농도에 WS-CM 희석 : 0.1, 0.5, 1, 1.5, 2, (WS-CM에서 니코틴 함량을 기준으로) 등차 니코틴 단위의 2.5, 3, 4, 및 5 ㎍ / ㎖의 12.
- 다음 농도로 RPMI 배지에서 니코틴 희석 : 100, 200, 500, 750, 1000, 2000 및 3000 ㎍ / mL로. 주의 : 니코틴은 급성 독성 및 환경 위험합니다.
- 웰 1 × 106 세포의 농도로 / 각 웰에 RPMI 완전 배지에 현탁 한 PBMC 100 ㎕를 추가한다. 셀 플러스 WS-CM 또는 니코틴의 총 부피는 200 μL / 잘 될 것입니다.
- 이 연구의 목적으로, 전술 한 바와 같이 두 세트의 플레이트를 준비한다. 판을 덮고 24 시간, 37 ℃에서 3 시간, 5 % CO 2에 대한 하나의 판에 대해 하나의 판을 배양한다. 필요에 따라 시점을 조정합니다. 얼음 차가운 버퍼 200 μL와 세포를 재 부유 마지막 3 분 동안 300 XG에서 원심 분리 상층 액을 흡입, 커버 플레이트와 함께 접시의 바닥을로 소용돌이 실온에서 세포를 씻고 세척 단계를 한 번 더 반복한다.
- / 잘 100 μL의 총 부피에 대한 각 웰에 7 aminoactinomycin의 D (7AAD)의 5 μL 다음 버퍼를 실행하는 95 μl를 추가합니다. 실온에서 15 분 동안 어두운 데에서 인큐베이션 플레이트.
- 클러스터 튜브에 버퍼를 실행 100 μl를 추가합니다. 클러스터 튜브 플레이트의 각 웰로부터 세포 현탁액의 전체 볼륨을 전송하고 유동 세포 계측기에 샘플을 획득.
- 분석 소프트웨어를 이용하여 유세포 7AAD 양성 세포의 비율을 결정한다.
5. EC 50 결정
- WS-CM과 니코틴의 EC (50) 값은 한 PBMC의 7AAD 양성 염색에 의해 결정됩니다.
- EC (50) 값은 진한로 정의된다entration되는 세포의 50 %는 24 시간 분석에서 더 이상 없었다 가능한 한 값은 등차 니코틴 단위 / ㎖ μg의로서 표현된다.
- 이 연구의 목적으로, EC (50)의 값은 각각, WS-CM 및 니코틴 1.56 ㎍ / ml 내지 1650 ㎍ / ㎖의 것으로 결정되었다.
6. 분비 된 사이토 카인
참고 : 여기에 나열된 희석이 연구의 목적이다. 희석액은 그에 따라 조정될 수있다.
- / 웰의 농도에서 100 ㎕의 총 부피를 RPMI 완전 배지를 사용하여 96- 웰 플레이트에서 WS-CM을 희석시키고, 0.3, 1.56, 등차 니코틴 유닛 (3), 5 ㎍ / ml의.
- 다음 니코틴 농도를 희석 : 100, 200, 500, 750, 1000, 2000 및 3000 ㎍ / ㎖의. 주의 : 니코틴은 급성 독성 및 환경 위험합니다.
- 웰 1 × 106 세포의 농도로 / 각 웰에 RPMI 완전 배지에 현탁 한 PBMC 100 ㎕를 추가한다.셀 플러스 WS-CM 또는 니코틴의 총 부피는 200 μL / 잘 될 것입니다.
- 판을 덮고 37 ° C에서 3 시간, 5 % CO 2 동안 품어.
- 3 분 300 XG에 원심 분리 상층 액을 흡입, 커버 플레이트와 함께 접시의 바닥을로 소용돌이 마지막으로 얼음 차가운 200 μL 버퍼를 실행하고 세척 단계를 한 번 더 반복과 세포를 일시 중단하여 실온에서 세포를 씻으십시오.
- RPMI 전체 매체의 200 μl를 추가하고, 세척 단계를 한 번 더 반복한다.
- 각 웰에 10 ㎍ / ml의 LPS 매체의 200 μl를 추가합니다.
- 커버 플레이트 및 4 시간, 24 시간, 48 시간, 또는 37 ° C에서 72 시간 5 % CO 2 동안 품어. 필요에 따라 배양 시간을 조정합니다.
- 3 분 동안 300 × g에서 접시를 원심 분리기.
- 7 단계와 8 단계의 분석을 수행하기 위해 -80 ° C에서 냉동실에 잘 각각의 저장소에서 상층 액 175 μl를 가져 가라.
7. 세포 측정 비드 어레이 분석
<OL>8. IL-8 ELISA
- IL-8 ELISA 단계 6.10 및 사용으로부터 세포 상층 액을 녹여. 제조업체의 지침에 따라 ELISA 분석을 수행합니다.
9. 세포 내 염색 및 유동 세포 계측법
참고 : 여기에 나열된 희석이 연구의 목적이다. 희석액은 그에 따라 조정될 수있다.
- / 웰의 농도에서 100 ㎕의 총 부피를 RPMI 완전 배지를 사용하여 96- 웰 플레이트에서 WS-CM을 희석시키고, 0.3, 1.56, 등차 니코틴 유닛 (3), 5 ㎍ / ml의.
- 동일한 플레이트에서 다음 니코틴 농도를 희석 : 2, 10, 50, 100, 500, 2000 및 4000 ㎍ / mL로. 주의 : 니코틴은 급성 독성 및 환경 해저드입니다DOUS.
- / 잘 1 × 10 6 세포의 농도로 RPMI 완전 배지에 현탁 PBMC를 100 μl를 추가합니다. 셀 플러스 WS-CM 또는 니코틴의 총 부피는 200 μL / 잘 될 것입니다.
- 판을 덮고 37 ° C에서 3 시간, 5 % CO 2 동안 품어.
- 얼음 차가운 버퍼 200 μL와 세포를 재 부유 마지막 3 분 동안 300 × g에서 원심 분리 한 상층 액을 흡입, 커버 플레이트와 함께 접시의 바닥을로 소용돌이 실온에서 세포를 세척하고, 세척 단계를 한 번 더 반복한다.
- 판에 RPMI 완료 매체의 200 μl를 추가하고, 세척 단계를 한 번 더 반복한다.
- RPMI 전체 매체를 사용하여 2 μL / ㎖ GolgiPlug의 작업 농도가 10 ㎍ / ml의 LPS를 준비하고 각 웰에 200 μl를 추가합니다.
- 37 ° C에서 6 시간, 5 % CO 2 판을 품어.
- 단계 9.8의 끝에서, 버퍼 (39 °의 C)를 실행하고 (300)에서 회전하여 세포를 씻어4 ℃에서 3 분 XG.
- 각 웰에 Cytofix 100 μl를 추가하고 4 ℃에서 20 분 동안 품어.
- 4 ℃에서 3 분 동안 300 XG에서 1 배 Permwash (4 ° C에서)와 단계 9.9에 설명 된대로 세포를 제거하는 과정을 3 회 반복한다.
- 에 다음 항체의 하나의 각 5 μL 각 아니라 다음에 45 μL 1X Cytoperm의 추가 각 웰 : TNF-α-알렉사 형석 488, IFN-γ V500, MIP-1α PE. 30 분 동안 4 ° C에서 품어.
- 1 배 Permwash (4 ° C에서)과 4 ℃에서 3 분 동안 300 XG에서 버퍼 (4 ° C)를 실행 한 시간 단계 9.9에 설명 된대로 세포 두 번 씻으십시오.
- 2 % 파라 포름 알데히드 (39 °의 C) 200 μL로 세포를 재현 탁. 12 × 75mm 튜브에 세포를 전송하고, 사이토 흐름에 샘플을 분석 할 수 있습니다. 주의 : 파라 포름 알데히드는 급성 독성 및 건강 위험, 부식성.
(10) K562 죽이는 분석
참고 : K562 세포는 성장한다RPMI 완료 매체와 37 ° C, 5 % CO 2의 문화에서 그들은 분석하기 전에 80 %의 합류에 도달 할 때까지.
- 유리 병에 DMSO의 18 μl를 추가하여 숙신 에스테르 (CFSE) 원액 카복시 5 mM의를 준비합니다.
- / 웰로 각각의 웰에 대해 원하는 등차 니코틴 단위 또는 니코틴 농도를 달성하기 위해 100 ㎕의 총 부피로 RPMI 완전 배지를 사용하여 96- 웰 플레이트에서 WS-CM 또는 니코틴 희석. 주의 : 니코틴은 급성 독성 및 환경 위험합니다.
- / 웰 1.5 × 10 6 세포의 농도로 RPMI 완료 매체에 PBMC를 100 μl를 추가합니다. WS-CM 또는 니코틴 세포의 총 부피는 200 μL / 잘 될 것입니다.
- 판을 덮고 37 ° C에서 3 시간, 5 % CO 2 동안 품어.
- 실온에서 8 분 동안 400 XG에 10 DPBS ㎖의 원심 분리기를 추가하여 K562 세포를 씻으십시오.
- DPBS 10 mL로 재현 탁하고 세포를 K562 세포를 카운트.
- CFSE 가공용 준비1 ML의 DPBS에 CFSE 주식 솔루션 1 μl를 추가하여 NG 솔루션입니다.
- 2 × 107 세포 - 함유 한 K562 세포 현탁액 1 ㎖에 CFSE 작동 액 1ml를 추가한다. 소용돌이와 실온에서 2 분 동안 정확하게 품어.
- 즉시 FBS 200 μl를 추가합니다. 소용돌이와 실온에서 2 분 동안 정확하게 품어.
- RPMI 전체 매체의 10 ML을 추가하고 실온에서 8 분 동안 400 XG에 튜브를 원심 분리기.
- RPMI 상청액을 제거하고 펠렛을 끊고 RPMI 완전 배지 10 mL로 세포를 재현 탁하고 CFSE로 표지 된 K562 세포를 카운트.
- 실온에서 3 분 동안 300 XG에 접시를 원심 분리하여 PBMC를 씻으십시오. 액체를 경사 분리하여 상층 액을 기음. 덮개를 장착하고 접시의 바닥을 소용돌이. RPMI 전체 매체의 200 μl를 추가하고 세척 단계를 한 번 더 반복한다.
- (1.5 × 106 PBMC를 K562s 100,000) PBMC 플레이트와 상기 각 I 샘플 웰에 1:15 비로 CFSE 표지 된 K562 세포를 추가37 ° C에서 5 시간 5 % CO 2 ncubate.
- 실온에서 3 분 동안 300 XG에서 원심 분리하여 세포 믹스를 씻으십시오. 액체를 제거하여 상층 액을 기음. 덮개를 놓고 판의 바닥을 소용돌이.
- 유동 완충액 200 μl를 첨가하고, 10.14 단계를 한 번 더에 기재된 세정 공정을 반복한다.
- / 잘 100 μL의 총 부피에 대한 각 웰에 7AAD의 5 μL 다음 실행 버퍼의 95 μl를 추가합니다. 실온에서 15 분 동안 어두운 데에서 인큐베이션 플레이트.
- 각 웰에 유동 완충액 100 ㎕를 첨가하고, 클러스터 튜브 플레이트의 각 웰로부터 세포 현탁액의 전체 볼륨을 전송하고 유동 세포 측정기에 샘플을 획득.
- 분석 소프트웨어를 이용하여 유세포 7AAD 양성 및 CFSE 양성 세포의 비율을 결정한다.
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Representative Results
결과는 평균 (네 기증자 샘플)의 평균 ± 표준 오차로 표시 하였다. 치료 및 치료를받지 않은 샘플 사이의 학생의 t- 테스트는 해당 컨트롤이 모든 치료 용 Excel 소프트웨어뿐만 아니라 t-test를 비교를 사용하여 수행 하였다. 통계적 유의성에 의해 표시되었습니다 * P <0.05; **, P <0.005; ***, P <0.0005.
WS-CM 및 니코틴에 대한 노출의 효과를 측정하기 위해, PBMC를 3 시간 또는 24 시간 동안 다른 WS-CM 및 니코틴의 농도로 처리 하였다. 세포 사멸은 이중 가닥 핵산에 인터 칼 7AAD의 같은 견고하고 안정적인 7AAD 염색법에 의해 측정하고, 죽거나 사균 (16)의 세포막을 관통 할 수있다. 세포 사멸의 용량 의존적 증가 등차 니코틴 단위 (도 1A)의 4 ㎍ / ml의 검출 가까운 80 % 세포 사멸과 함께 24 시간에서 WS-CM 관찰되었다. 세포 죽음의 비교 정도였다만 3,000 ㎍ / ㎖의 니코틴 (그림 1B)에 주목했다. 우리는 WS-CM 및 사이토 카인 유도 및 표적 세포를 죽일 수있는 능력에 대한 영향을 평가하기 니코틴 3 시간 동안 PBMC를 노출하기 때문에, WS-CM 3 시간 처리 다음 상당한 독성을 유발 여부를 확인하는 것이 필요했다. PBMC를 상당한 독성을 경험하지 않았다 WS-CM의 동등 니코틴 단위의 5 ㎍ / ㎖로 처리 (<5 %; 그림 1A). 3 시간 동안 니코틴 치료 만 2,000 ㎍ / ㎖ (그림 1B)에서 측정 (8 %) 세포 사멸을 일으키는 원인이되었다. 따라서, 지시 된 투여 량 및 치료 기간에 WS-CM 또는 니코틴에 노출 실험 조건 하에서 현저한 세포 독성을 유발하지 않았다.
면역 조절 효과를 측정하기 위해, PBMC를 서로 다른 시간 기간들에 대한 LPS로 자극하고, 분비 된 사이토 카인은 CBA 분석으로 측정 하였다. LPS 자극 시간을 최적화하기 위해, 우리는 4 시간, 2 LPS로 자극 된 PBMC를 노출4 시간, 48 시간, 72 시간, 및 사이토 카인 분비를 측정 하였다. 예를 들어, 24 시간 동안 LPS 자극은 사이토 카인 IL-6 및 IL-8 (도 2)의 최대 분비를 수득하고, 연장 된 시간주기는 사이토킨에 더욱 증가 (IL-6) 또는 감소 (IL-8)을 초래하지 않았다 분비. 유사한 결과가 이러한 IL-10, IL-1β 및 TNF-α와 같은 다른 시토 킨 분비 얻었다 (데이타 미기재).
파일럿 시간 코스 실험은 LPS에 의한 TLR-4 자극에 대한 반응에서 사이토 카인의 최대 생산량은 24 시간에 의해 발생하는 것을 제안하고, 따라서, 분비되는 사이토 카인은 이후의 모든 실험에서 24 시간에 측정 하였다. LPS와 TLR-4 수용체의 자극에 의해 다음 WS-CM 및 니코틴과 치료, 분비되는 사이토 카인 (그림 3)의 용량 의존적으로 감소 귀착되었다. WS-CM과 치료는 IFN-γ의 깊은 감소 (그림 3A), TNF (그림 3B), IL-10 (그림 3C <결과낮은 동등 니코틴 단위 (1.56 ㎍ / ㎖)에서> / 강해)와 IL-6 (그림 3D). 사이토 카인의 억제 또한 니코틴 분명했다. 그러나, 니코틴과 사이토 카인의 억제는 상당히 높은 투여 량에서 발생하고, 억제도가 개별 사이토 카인 변화. IL-6가 실험 높은 농도 (4 ㎎ / ㎖) (Figurie 3D)에서 억제되고, 반면 예를 들어, IFN-γ는 50 μg의 대폭 / ㎖에서 니코틴 억제 것으로 나타났다. 다음에는 ELISA 분석을 사용하여 동일한 샘플에서 IL-8 농도를 측정 하였다. IL-8 분비를 효과적으로 WS-CM-PBMC를 노출 억제 하였다; 니코틴의 억제 효과는 2 ㎎ / ㎖ (그림 4)에서 상당한 동안.
세포 내 사이토 카인의 수준은 LPS로 자극에 WS-CM- 및 니코틴 처리 한 세포에서 정량화 하였다. 이전에 우리는 3 일 동안 PBMC를 자극하고 측정하기 위해 배양의 마지막 6 시간 동안 Golgiplug 추가세포 내 사이토 카인 (14). 우리는 이제 크게 6 시간의 총 LPS 및 골지체 플러그 자극을 조합함으로써 인큐베이션 기간을 감소시키고 세포 내 사이토 카인 양성 세포를 (도 5)를 측정 하였다. (5 IFN-γ 양성 세포의 투여 량 - 의존성 퍼센트 감소를 도시한다 도 5a), TNF-α 양성 nicotine- 및 WS-CM- 모두에서 세포 (도 5b)은 MIP-1α 양성 세포에서 농도 의존적 % 감소 (도 5C) 반면-CM WS에서 관찰되었고, PBMC를 노출 -exposed PBMC를. 이 분석에서는 하부 등차 니코틴 단위 (1.56 ㎍ / ㎖)에 WS-CM에 노출 된 후 세포 내 사이토킨 양성 세포의 수의 감소를 관찰 하였다. 두 사이토 카인 분비 및 세포 내 사이토킨 분석법 IFN-γ 수준 또는 IFN-γ 양성 세포의면에서 유사한 결과를 보였다.
기능 측정, WS-CM- 및 nicotine-의 능력으로대상 K562 세포를 죽이는 치료 PBMC를 결정 하였다. 그림 6a는 제어에 의한 (CFSE 표지 K562) 세포 사멸이, WS-CM에 노출 된 대상의 7AAD 양성 염색을 대표하는 유세포 원시 데이터를 묘사하고, 니코틴 처리 한 PBMC. 상자에 숫자는 %의 7AAD 양성 CFSE 표지 K562 세포를 나타냅니다. 1.56 ㎍ / ㎖의 노출은 WS-CM 크게 제어 및 낮은 투여 량과 비교 한 PBMC에서 이펙터 세포의 살상 능력을 감소시켰다. 낮은 투여 량 및 높은 니코틴 처리는 세포 사멸을 방해하지 않았다.도 6B는 여러 번의 실험에 공여자 죽이고 퍼센트 K562 세포의 투여 량 - 의존적 감소를 나타낸다.
WS-CM (㎍ / ml) 및 니코틴 (㎍ / ㎖)의 등차 니코틴 단위의 증가하는 농도에 노출 된 후 PBMCs를 그림 1. 세포 사멸. (A) 및 3 시간 및 24 시간 (B)에 대한 니코틴에 대한 WS-CM 처리 하였다. 세포사 7AAD 염색에 의해 측정 하였다. 각 점은 대표적인 실험에서 4 기증자의 평균 ± SD 오차 막대를 나타냅니다. 통계적 유의성은으로 표시됩니다 * P <0.05; ** P <0.005, *** P <0.0005.
상이한 시점에서 LPS로 자극 된 PBMC에 의한 IL-6 및 IL-8의 분비도 2. PBMC를하여 4 시간, 24 시간, 48 시간, 72 시간 동안 LPS로 자극 하였다. 세포 배양 상청액에서 IL-6와 IL-8의 사이토 카인의 수준은 인간 염증성 사이토킨 키트 (키트 CBA)를 이용하고 유동 세포 계측법 측정 하였다. 이러한 데이터는 세 개의 다른 기증자로부터 한 PBMC를 사용하여 두 개의 독립적 실험 중 하나로부터 평균 ± SD 오차 막대를 나타낸다. 통계시gnificance가로 표시됩니다 : * P <0.05; ** P <0.005.
LPS 자극 다음 WS-CM (㎍ / ml) 및 니코틴 (㎍ / ㎖)의 등차 니코틴 단위 증가하는 농도로 처리 한 PBMC에 의한 사이토 카인의 분비도 3. 감소. PBMC를는 WS-CM 및 니코틴의 다양한 농도에 노출시켰다 3 시간 동안 24 시간 동안 LPS로 자극. IFN-γ (A)의 수준은, 세포 배양 상청액의 TNF (B), IL-10 (C) 및 IL-6 (D) 사이토킨 TH1 /은 Th2 CBA의 분석을 이용하여 유세포 분석기를 측정 하였다. 이 데이터는 네 가지 다른 기증자로부터 한 PBMC를 사용하여 3 개의 독립적 인 실험 중 하나에서 평균 ± SD 오차 막대를 나타냅니다. 통계적 유의성은으로 표시됩니다 * P <0.05; ** P <0.005; *** P <0.0005. 높은 사기 WS-CM의 centrations는 *** P <0.0005와 통계 학적으로 유의 한 차이를 보였다.
LPS 자극 다음 WS-CM (㎍ / ml) 및 니코틴 (㎍ / ㎖)의 등차 니코틴 단위 증가하는 농도로 처리 한 PBMC에 의한 IL-8 분비의도 4 감쇠. 한 PBMC는 WS-CM 및 니코틴 노출시켰다 24 시간 동안 LPS로 자극하고, IL-8 ELISA로 측정 하였다 분비. 이러한 데이터는 네 가지 다른 기증자로부터 한 PBMC를 사용하여 세 개의 독립적 실험 중 하나로부터 평균 ± SD 오차 막대를 나타낸다. 통계적 유의성은으로 표시됩니다 * P <0.05; ** P <0.005; *** P <0.0005. WS-CM의 높은 농도는 *** P <0.0005와 통계 학적으로 유의 한 차이를 보였다.
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WS-CM (㎍ / ml) 및 니코틴 (㎍ / ㎖)의 등차 니코틴 단위 증가하는 농도로 처리 한 PBMC 세포 내 사이토 카인 양성 세포도 5 감소. 한 PBMC는 WS-CM 및 니코틴의 농도 변화에 노출 된 3 시간과 6 시간 동안 LPS와 Golgiplug 자극. WS-CM 및 니코틴 차량 제어는 RPMI 완전 배지이었다. 세포 내 IFN-γ 양성 (A), TNF-α 양성 (B), MIP-1α 및 양성 (C) 세포를 유세포 분석기로 정량 하였다. 이러한 데이터는 네 가지 다른 기증자로부터 한 PBMC를 사용하여 네 개의 독립적 실험 중 하나로부터 평균 ± SD 오차 막대를 나타낸다. 통계적 유의성은으로 표시됩니다 * P <0.05; ** P <0.005; *** P <0.0005. WS-CM의 높은 농도는 *** P <0.0005와 통계 학적으로 유의 한 차이를 보였다.
PBMC를 표적을도 6 저감 WS-CM (㎍ / ml) 및 니코틴 (㎍ / ㎖)의 등차 니코틴 단위의 증가하는 농도에 노출되는 능력을 죽이고. PBMC를 3 적응증 WS-CM 농도의 니코틴으로 처리하여 hr이고, CFSE 표지 된 K562 세포는 표적 세포로서 첨가하고 추가 5 시간 동안 인큐베이션 하였다. 세포 7AAD로 염색하고 세포 계측법 죽이는 능력을 측정하는 데 사용 된 흐름. 그림 6A 게이트 된 상자에 표시된 %의 살인과 결과 세포 계측법을 대표하는 흐름을 보여줍니다. 화살표가 노출 1.56 ㎍ / ml의 %의 살인을 감소 나타냅니다 WS-CM. 그림 6b는 네 가지 다른 기증자로부터 한 PBMC를 사용하여 네 개의 독립적 인 실험에서 대표 평균 ± SD 오차 막대를 보여줍니다. 통계적 유의성은으로 표시됩니다 ** P <0.005; *** P <0.0005. WS-CM의 높은 농도도 유의 하였다 재치시간 *** P <0.0005.
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Discussion
우리와 다른 사람은 이전에 TPP를 함께 한 PBMC의 치료는 표현과 사이토 카인 및 대상 셀 (14)을 죽이는 기능 측정의 분비 등 여러 반응을 억제하는 것이 증명하고있다. 이전의 연구에서 설명하는 실험 방법은 더 이상 배양 기간을 필요로 크기 14에서 겸손했다. 기본이 매력적인 생체 모델의 응용 가능성을 감안할 및 응용 연구, 우리는 이러한 여러 단계의 생물학적 분석에서 분석 매개 변수의 최적화 할 수 있는지를 조사 하였다. 여기서는 TPP 처리 생체 PBMC 모델을 사용 TLR 매개 면역 반응을 측정하는 방법을 단순화 제시한다.
가능한 한 PBMC의 분리 이러한 생체 분석을위한 핵심 요구 사항이다. 잠재적 기증자의 개별 변동과 생리 학적 상태를 감안할 때, 그것은 반응하는 한 PBMC를 얻을 이상적입니다. 본 연구의 목적을 위해, 우리는 격리이전에 출판 된 방법 (15)를 사용하여 일반적으로 건강한 성인 피험자에서 D PBMC를. 또한, 기증자 간의 변동성을 최소화하기 위해 본 연구에서, 우리는 알레르기, 감염있는 사람을 제외, 또는 누가 어떤 처방전을 복용하거나 아스피린 같은 카운터 약물 이상했다. 이 최적의 생존 및 후속 실험에서 세포의 기능을 보장하므로 또한 갓 채취 혈액으로부터 단리 한 PBMC는 바람직하다.
67-72 시간 동안 TLR 효능과 자극을 활용 한 이전 방법은 세포 내 사이토 카인 분비 사이토 카인 (14)을 측정합니다. (아무 WS-CM 또는 니코틴 제어 조건에서) TLR 자극 된 세포에서 사이토 카인 분비의 시간 코스는 최대한의 분비가 24 시간에서 발생하는 것이 좋습니다. 더욱이, 우리는 TLR Golgiplug 작용제와 함께 인큐베이션 합하고 세포 내 사이토 카인의 측정도 6 (H)의 총 인큐베이션 시간을 감소시켰다. 이것은 측정하는 별도의 분석을 요구하지만사이토킨 양성 세포는, 데이터가 이전의 방법 (14)와 비교하여 더 강하다. 이전의 결과와 일치, WS-CM 강하게 분비 및 세포 내 사이토 카인의 유도를 억제 하였다. 따라서, 이들 변형은 실질적으로 분석 시간을 감소하도록 인도 및 문헌에 기술 된 것과 매우 유사한 결과를 수득 하였다. 우리는 사이토 카인 수준을 평가하는 유동 세포 계측법 및 ELISA 방법을 이용했지만, 예컨대 정량적 실시간 중합 효소 연쇄 반응 (RT-qPCR에)와 같은 다른 기술들은 보완 기술로서 이용 될 수있다.
역사적으로, 방사성 동위 원소 표지 방법 (예를 들어, 51 CR-자료 분석)를 활용 이펙터 된 PBMC에 의한 세포 사멸을 대상으로. 이 보고서에 기재 한 방법은 방사능의 사용을 제거하고, 그 존재를 유동 세포 계측법에 의해 모니터링 될 수있는 형광 염료와로드 셀을 사용한다. 상술 한 방법의 또 다른 장점은 본원에 비교적 신속하고 adapte 수 있다는 것이다높은 처리량 분석에 D. 타겟 및 이펙터 세포의 배양 기간은 5 시간이기 때문에,이 분석은 8 시간에 완료 될 수있다. 이것은 그들이 며칠의 기간에 걸쳐 한 PBMC 및 활성화 / 자극 아형의 단리를 필요로 더 복잡한 다른 게시 된 방법과 대조에, 또는 NK 세포 및 K562 세포 접합체의 분석은 세포 독성 (17, 18)를 모니터링한다. 현재의 방법의 또 다른 장점은 더 큰 유연성을 수득 이펙터 세포로 직접 동결 보존 한 PBMC를 사용한다는 것이다.
요약하면, 우리는 쉽게 상이한 화합물을 테스트하기 위해 적용될 수있는 가연성 TPP 처리 한 PBMC에서 TLR - 매개 면역 반응의 효과를 확인할 수있는 몇 가지 분석법을 설명했다. 동결 보존 성분의 사용은 세포 계측법, CBA의 분석법, ELISA를 견고하고, 일관된 결과가 다른 실험실에 걸쳐 신속하게 얻을 수 있었다 흐름 확립 된 기술과 함께 상당한 유연성을 허용하고,oratories.
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Acknowledgments
이 작품은 의학의 웨이크 포레스트 대학과 공동 연구 계약에 따라 RJ 레이놀즈 담배 회사 (RJRT)에 의해 자금을 지원한다. GL 프라 사드는 RJRT의 풀 타임 직원입니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 x 75 mm tubes | BD Falcon | 352058 | |
| 15 ml conical tubes | Corning | 430790 | |
| 2 ml microtubes | Axygen | MCT-150-C-S | |
| 3R4F reference cigarettes | Univ. of Kentucky, College of Agriculture | 3R4F | |
| 50 ml conical tubes | Corning | 430828 | |
| 500 ml bottle | Corning | 430282 | |
| 7AAD | BD Pharmingen | 559925 | |
| 96-well flat bottom plate | Termo Nunc | 439454 | |
| 96-well round bottom plates | BD Falcon | 353077 | |
| Cell culture hood | Thermo Scientific | 1300 Series A2 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 58110R | |
| CFSE | Molecular Probes Life Technologies | C34554 | |
| Cluster tubes | Corning | 4401 | Harmful if swallowed, carcinogen |
| Cytofix/Cytoperm (Permwash) | BD Biosciences | 555028 | Flammable |
| DMSO (dimethyl sulfoxide ) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| DPBS | Lonza | 17-512F | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| FCAP Array | BD Biosciences | 652099 | Software analyzes CBA data |
| Filter unit | Nalgene | 156-4020 | |
| Flow cytometer | BD Biosciences | FACS Canto II | 8 colors, at Ex 405 and Em 785. |
| Flow cytometer | BD Biosciences | FACS Calibur | 4 colors at Ex 495 and Em 785. |
| Flow cytometry analysis software | Tree Star | FlowJo | |
| Freezing container | Nalgene | 5100-0001 | Contains DMSO, irritant |
| GogliPlug | BD Biosciences | 555029 | Carcinogen, irritant, corrosive |
| H2SO4 | Sigma-Aldrich | 339741 | |
| Human Inflammatory Cytokine Kit | BD Biosciences | 551811 | |
| IFN-γ V-500 Antibody | BD Horizon | 561980 | skin sensitizer |
| IL-8 ELISA Kit | R and D Systems | DY208 | |
| Isolation buffer | Isolymph, CTL Scientific Corp. | 1114868 | Flammable liquid, irritant |
| Isopropyl alcohol | Sigma-Aldrich | W292907 | |
| L-Glutamine | Gibco Life Technologies | 25030-081 | |
| LPS | Sigma-Aldrich | L2630 | |
| MIP1-α PE Antibody | BD Pharmingen | 554730 | Acute toxicity, oral |
| Monensin | Sigma-Aldrich | M5273 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Nicotine | Sigma-Aldrich | N3876 | Acute toxicity, environmental hazard |
| Parafilm | Bemis | “M” | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Flammable, skin irritation |
| Pen/strep | Gibco Life Technologies | 15140-122 | |
| RPMI 1640 | Gibco Life Technologies | 11875-093 | |
| Running buffer | MACS Running Buffer, Miltenyi Biotech | 130-091-221 | |
| Th1/Th2 CBA Kit | BD Biosciences | 551809 | |
| TNF-α Alexa Fluor 488 Antibody | BioLegend | 502915 | |
| Transfer pipette | Fisher Scientific | 13-711-20 | |
| Tris Base | Sigma-Aldrich | T1503 |
References
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