आनुवंशिक रूप से संशोधित कोशिका प्रत्यारोपण के लिए micropatterned संस्कृति प्लेटों पर उपगोल प्रकोष्ठों की ओर जीन अभिकर्मक
Summary
This protocol describes a cell transplantation system using genetically modified, injectable spheroids. Cell spheroids are cultured on micropatterned culture plates and recovered after gene introduction using polyplex nanomicelles. This system facilitates prolonged transgene expression from the transplanted cells in host animals while maintaining the innate function of the cells.
Abstract
सेल प्रत्यारोपण के उपचारात्मक प्रभाव में सुधार करने के लिए, आनुवंशिक रूप से संशोधित, इंजेक्शन spheroids के प्रत्यारोपण प्रणाली विकसित की गई थी। सेल spheroids एक thermosensitive बहुलक के साथ लेपित micropatterned प्लेटों पर एक संस्कृति प्रणाली में तैयार कर रहे हैं। Spheroids की संख्या एक पॉलीथीन ग्लाइकोल (खूंटी) मैट्रिक्स द्वारा लेपित हैं कि गैर चिपकने वाला क्षेत्रों से घिरा नियमित रूप से एक दो आयामी तरीके से तैनात कर रहे हैं कि 100 माइक्रोन व्यास की कोशिका आसंजन क्षेत्रों के लिए इसी प्लेटों पर बनते हैं। spheroids आसानी से प्लेटों के तापमान को कम करके एक तरल निलंबन के रूप में ठीक किया जा सकता है, और उनकी संरचना अच्छी तरह से (27 जी) के ऊपर एक पर्याप्त बड़ी क्षमता के साथ इंजेक्शन सुई के माध्यम से उन्हें गुजर द्वारा बनाए रखा है। आनुवंशिक संशोधन अंडाकार आकृति संरचना में बाधा पहुँचा के बिना कोशिकाओं में जीन को शुरू करने में सक्षम है, जो मूल गैर वायरल जीन वाहक, पॉलीप्लेक्स nanomicelle, का उपयोग करते हुए जीन अभिकर्मक द्वारा हासिल की है। रस्मी के लिएएल्बुमिन अभिव्यक्ति द्वारा संकेत के रूप में एक luciferase व्यक्त जीन के साथ ट्रांसफ़ेक्ट आरे hepatocyte spheroids, luciferase लिए sustainably, संरक्षित hepatocyte समारोह के साथ साथ, प्रतिरोपित पशुओं में प्राप्त किया जाता है। इस प्रणाली के mesenchymal स्टेम सेल सहित सेल प्रकार की एक किस्म के लिए लागू किया जा सकता है।
Introduction
कोशिका प्रत्यारोपण चिकित्सा विभिन्न असभ्य रोगों के इलाज के लिए व्यापक ध्यान आकर्षित किया है। प्रतिरोपित कोशिकाओं द्वारा स्रावित होते हैं कि गतिविधि और bioactive कारकों में से आधा जीवन एक कोशिका प्रत्यारोपण प्रणाली के बेहतर चिकित्सीय प्रभावशीलता के लिए आवश्यक हैं। प्रत्यारोपण के लिए पहले कोशिकाओं के आनुवंशिक संशोधन को विनियमित और bioactive कारकों का स्राव सहित सेलुलर कार्यों, हेरफेर करने के लिए एक लाभकारी तकनीक है। यह कोशिका मृत्यु या सेल गतिविधि के नुकसान से बचने के लिए कोशिकाओं के लिए एक अनुकूल माइक्रोएन्वायरमेंट बनाए रखने के लिए भी महत्वपूर्ण है। सेल करने वाली सेल बातचीत अच्छी तरह से संरक्षित कर रहे हैं, जिसमें तीन आयामी (3 डी) अंडाकार आकृति सेल संस्कृति, (प्राथमिक hepatocytes से एल्बुमिन स्राव में सुधार और mesenchymal स्टेम कोशिकाओं से बहु-वंश भेदभाव को बढ़ावा देने के लिए, उदाहरण के लिए, इस उद्देश्य के लिए MSCs का वादा किया है ) 1-7।
Spheroi के इस अध्ययन में, एक उपन्यास संयोजन प्रणालीडी संस्कृति और जीन अभिकर्मक आनुवंशिक रूप से संशोधित सेल प्रत्यारोपण के लिए एक मंच के रूप में सेवा करने के लिए प्रयोग किया जाता है। अंडाकार आकृति कोशिकाओं को बनाने के लिए, micropatterned संस्कृति प्लेटों पर एक अंडाकार आकृति संस्कृति प्रणाली का इस्तेमाल किया जाता है। इन प्लेटों पर, 100 माइक्रोन व्यास की कोशिका आसंजन क्षेत्रों में नियमित रूप से एक दो आयामी तरीके से तैनात कर रहे हैं और एक खूंटी मैट्रिक्स 3 से लेपित गैर चिपकने वाला क्षेत्रों से घिरे हैं। कोशिकाओं की एक पर्याप्त संख्या बोने करके, व्यास में 100 माइक्रोन के 3 डी spheroids की सरणियों micropatterned संस्कृति बिस्तर करने के लिए इसी का गठन कर रहे हैं।
spheroids एक thermosensitive बहुलक, पाली (आईएसओ-propylacrylamide) के साथ लेपित रहे थे कि thermosensitive सेल संस्कृति प्लेटों का उपयोग करके अपने 3 डी संरचना, (PIPAAm) 8-10 बाधा पहुँचा के बिना बरामद कर रहे हैं। micropatterned वास्तुकला thermosensitive प्लेटों पर निर्माण किया है (कस्टम निर्मित)। बस प्लेटों के तापमान को कम करके, spheroids संस्कृति बिस्तर से अलग और फैलाने कर रहे हैंफॉस्फेट में डी खारा (पीबीएस) बफर। इस प्रकार, 100 माइक्रोन की एक समान आकार के साथ spheroids की एक बड़ी संख्या एक इंजेक्शन के निलंबन के रूप में प्राप्त किया जा सकता है।
चित्रा 1. एक micropatterned प्लेट पर अंडाकार आकृति संस्कृति प्रणाली की योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। जेनेटिक संशोधन मूल गैर वायरल जीन वाहक, पॉलीप्लेक्स nanomicelle का उपयोग कर जीन अभिकर्मक द्वारा हासिल की है। यह प्लास्मिड डीएनए (pDNA) और पॉलीथीन ग्लाइकोल (खूंटी) -polycation copolymers ब्लॉक 11 से बना है। ये एक विशेषता कोर-खोल संरचना, एक पेग खोल और गाढ़ा pDNA के एक भीतरी कोर से मिलकर उपचारात्मक उद्देश्यों के 11 के लिए कोशिकाओं में सुरक्षित और प्रभावी जीन शुरूआत की इजाजत दी है। थी का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करेंएस आंकड़ा।
चित्रा न्यूक्लिक एसिड और खूंटी-ब्लॉक-polycation copolymers ब्लॉक के जटिल द्वारा गठित पॉलीप्लेक्स nanomicelle 2. संरचना। इस अध्ययन में, इस तकनीक का प्राथमिक लाभ अंडाकार आकृति संरचना nanomicelles द्वारा जीन अभिकर्मक के दौरान बाधित नहीं है। चूहे प्राथमिक hepatocyte spheroids की nanomicelle की मध्यस्थता transfections के बाद, लंबे समय तक transgene अभिव्यक्ति untransfected spheroids 12 के बराबर एक स्तर पर hepatocytes से निरंतर एल्बुमिन स्राव के साथ अधिक से अधिक एक महीने के लिए प्राप्त की है। spheroids से transgene अभिव्यक्ति और एल्बुमिन स्राव भी thermosensitive प्लेटों से वसूली के बाद रखा जाता है। यह nanomicelles सुरक्षित रूप से एचईपी की जन्मजात कार्यों आई बिना जीन शुरूआत की सुविधा कर सकते हैं कि स्पष्ट हैatocytes। इस प्रकार, जीन परिचय nanomicelles का उपयोग कर आनुवंशिक रूप से संशोधित कोशिका प्रत्यारोपण के लिए एक आशाजनक मंच है साथ thermosensitive micropatterned प्लेटों पर सुसंस्कृत अंडाकार आकृति कोशिकाओं के संयोजन। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल में, यह जीन परिचय और अंडाकार आकृति वसूली के चरणों के दौरान spheroids के 3 डी संरचना को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है। कोशिकाओं कोशिका मृत्यु या सेल गतिविधि के नुकसान से बचने के लिए एक अनुकूल microenviron…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम गहराई से thermosensitive micropatterned संस्कृति प्लेटों के साथ ही वैज्ञानिक सलाह प्रदान करने के लिए Toyo Gosei, टोक्यो, जापान में डॉ ताकेशी Ikeya और तकनीकी कर्मचारियों की सराहना करते हैं। हम भी पशु प्रयोगों के साथ तकनीकी सहायता के लिए सुश्री सतोमी ओगुरा, सुश्री एस ए इ सुजुकी, सुश्री असुका Miyoshi और सुश्री Katsue Morii धन्यवाद। इस काम के लिए आर्थिक रूप से JSPS KAKENHI सहायता अनुदान में वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए द्वारा समर्थित किया गया था, अभिनव (COI) प्रोग्राम के केंद्र और जापान विज्ञान और प्रौद्योगिकी एजेंसी (JST) से एस नवाचार कार्यक्रम, और JSPS Core- टू-कोर प्रोग्राम, ए एडवांस्ड रिसर्च नेटवर्क।
Materials
| Pen-Strep-Glut | GIBCO | ||
| Dexamethasone | Wako Pure Chemical Industries | 041-18861 | |
| Nicotinamide | Wako Pure Chemical Industries | 141-01202 | |
| Hank’s buffered salt and L-ascorbic acid 2-phosphate (Asc-2P) | Sigma-Aldrich | A8960 | |
| Human epidermal growth factor (hEGF) | Toyobo | PT10015 | |
| Cell-able multi-well plates | Toyo Gosei | PP-12 | |
| Thermosensitive cell culture plates (Upcell) | CellSeed Inc | The micropatterned architecture is constructed on the thermosensitive plates (custom-built by Toyo Gosei) | |
| Lipid-based transfection reagent (FuGENE HD) | Promega | E2311 | |
| Renilla Luciferase Assay System | Promega | E2810 | |
| pGL4 Luciferase Reporter Vector | Promega | E6651 | |
| pDNA expressing Gaussia luciferase | New England BioLabs | N8082S | |
| Mouse erhthropoietin-expressing vector | Origene | MC208445 | |
| pCAG-GS | Kindly provided by Laboratory for Pluripotent Cell Studies, Center for Developmental Biology, RIKEN | ||
| Escherichia coli DH5α competent cells | Takara | 9057 | |
| Endotoxin-free plasmid DNA purification system | Nippon Genetics | NucleoBond Xtra EF | |
| collagenase | Wako Pure Chemical Industries | 639-00951 | |
| trypsin inhibitor | GIBCO | R-007-100 | |
| Luminometer | Promega | GloMax™ 96 Microplate Luminometer | |
| IVIS Imaging System | Xenogen Corp. | Xenogen IVIS Spectrum in vivo imaging system | |
| blood sample analyzer | Sysmex | pocH-100i Automated Hematology Analyzer |
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