Abstract
Способность опухолевых клеток, чтобы избежать иммунной системы, характеризующийся выхода опухоли с обеих врожденных и адаптивных иммунных ответов, в настоящее время принимается в качестве важной отличительной чертой рака. Наше исследование на рак молочной железы сосредотачивается на активной роли, что опухолевые проникновения лимфоциты играют в опухолевой прогрессии и результаты лечения. С этой целью мы разработали методику быстрого выделения интактных лимфоидных клеток от нормальных и аномальных тканей с целью оценки их вблизи их родного государства. Гомогенаты, полученные с использованием механического диссоциатора показывать обе повышенную жизнеспособность и клеток восстанавливаться при сохранении поверхностной экспрессии рецептора по сравнению с ферментом усваивается тканями. Кроме того, ферментативное расщепление оставшихся нерастворимого материала не восстановить дополнительные CD45 + клеток, указывающие, что количественные и качественные измерения в первичной гомогената вероятно, действительно отражают Проникнув субпопуляции в ткани ФрагмEnt. В лимфоидных клеток в этих гомогенатах может быть легко характеризуется использованием иммунологических (фенотип, пролиферацию и т.д.) или молекулярный (ДНК, РНК и / или белка) подходы. CD45 + клетки могут быть также использованы для очистки субпопуляций, расширение в пробирке или криоконсервации. Дополнительным преимуществом этого подхода является то, что первичный супернатант ткани из гомогенатов может быть использован для характеристики и сравнить цитокины, хемокины, иммуноглобулины и антигенов, присутствующих в нормальных и злокачественных тканей. Этот протокол функционирует очень хорошо для ткани молочной железы человека, а также должны быть применимы к широкому спектру нормальных и ненормальных ткани.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: Все образцы были получены с помощью протокола одобрен Комитетом по этике Медицинского института Жюля Борде мимо с письменного информированного согласия, полученного от каждого пациента.
1. Получение гомогената ткани
- Проанализируйте Резецированная тканей (злокачественных и нормальных тканей Резецированная из операционной) находятся в лаборатории патологии обученным персоналом для немедленного пуска. Опухоль, NANT (берутся по дальней дистанции от опухоли, как это возможно) и нормальные фрагменты ткани регулярно обрабатываются в течение 1 - 3 ч хирургического иссечения в BSL2 лаборатории с использованием стандартных процедур биобезопасности для тканей человека. Блок-схема протокола проиллюстрировано на фиг.1.
- Взвесьте все фрагменты тканей (обычный, Нант и опухоль) и измерить длину, ширину и высоту (длина х ширина х высота). Это важный шаг для последующей нормализацией клеточных субпопуляций, экстрагировали РНК, и т.д.
НЕТTE: диапазон размеров образца составляет от 100 до 10000 мм 3 без жира, если это возможно. - Отказ от ответственности фрагмент опухоли на предметное стекло для H & E окрашивания, чтобы убедиться, что ткань на самом деле часть опухоли.
- Для этого нажмите на предметное стекло микроскопа, на фрагменте опухоли и, слегка надавливая пальцами на несколько секунд.
- Закрепите слайд с изопропанола в течение 2 мин с последующим стадии промывки в воде. Контрастирующая ткань на 30 сек с гематоксилином Майера.
- Вымойте слайд в шести ванн воды. Пятно в Phloxine В 2% в течение 15 сек.
- Промыть в одном ванну водой, а затем четыре ванны изопропанола и отделки с одной ванне с водой.
- Выдержите в изопропанола в течение 1 мин и канализации. Ясно в двух ваннах ксилола.
- Установите ксилолом основе монтажа среды. Проверьте для клетками опухоли (рис 2).
ПРИМЕЧАНИЕ: В основном, опухолевые клетки прилипают к тисненой слайд - стромы, лимфоидные или объявлениемipose клетки редко остаются, оставляя промежутки между опухолевыми клетками (фиг.2).
- Поместите ткани фрагмент в небольшой чашки для культивирования, содержащей 1 мл в химически определенной, не содержащей сыворотки среде гемопоэтических клеток (далее по тексту среды) при комнатной температуре и кости его на мелкие кусочки (~ 1 - 2 мм 2) с использованием стерильной скальпель.
- Передача все (фрагменты ткани + среда) с механической Диссоциатор C трубки.
- Промойте чашку Петри и скальпель с 2 мл среды с использованием пипетки Пастера и добавить к С трубки (объем среды для диссоциации = 3 мл).
- Используйте механическую Диссоциатор программы A.01 Для C трубок (самый нежный программы) для гомогенизации фрагментов ткани в одной клеточной суспензии. Поместите C трубку в аппарате и запустить программу два раза подряд (один цикл = 25 сек).
Примечание: Эта процедура гомогенизации была создана и утверждена для человеческой ткани молочной железы, другие товойили или ткани типа, возможно, потребуется использовать другую программу и должны быть проверены в первую очередь. - Снимите C трубку от аппарата и переливать гомогената непосредственно в сито 40 мкм клетки, сидящего на 50 мл трубки. Используя ту же пипетку Пастера как на стадии 1.6, передача какой-либо жидкости, оставшейся в C трубки к клеточный фильтр.
- Передача отфильтрованной жидкости в 15 мл пробирку с помощью микропипетки наконечник в 1 мл. Временно держать сотовый сетчатый фильтр и его 50 мл трубку.
- Промойте C трубку с дополнительными 3 мл среды и передавать это, опять же, используя тот же пипетку Пастера как в шаге 1.6, в ячейки фильтра еще сидящего на 50 мл трубки. Сожмите максимальное количество остаточной жидкости в ловушке в unhomogenized ткани в 50 мл пробирку, осторожно перемещая его вокруг сито с чистой пипетки Пастера или 1 мл наконечником, который впоследствии выбросить, чтобы избежать загрязнения элюата.
- Поместите ячейки фильтра вверх дном на тОн оригинала С трубки и промыть 3 мл среды таким образом, что unhomogenized ткани падает обратно в C трубки.
- Re-гомогенизации, как в шаге 1,7 в течение двух циклов программы A.01.
- Вылейте эту вторую гомогената через ячейки сетчатого фильтра, сидящего на 50 мл трубку, промыть C трубку снова 3 мл среды (как в шаге 1,10) и передачи с пипетки Пастера в ячейки фильтра, сидящего на 50 мл трубку снова сжимая максимум Количество жидкости от остаточного соединительной ткани, захваченного в клеточный фильтр.
- В этот момент, объем ~ 2,5 мл в 15 мл пробирку и ~ 9 мл в 50 мл пробирку.
2. Разделение тканей супернатанта и клеток
- Центрифуга гомогенатах в 15 мл и 50 мл пробирки в течение 15 мин при 600 х г при комнатной температуре.
- Декантировать SN от 15 мл пробирку в чистую пробирку и временно хранить при 4 ° С. Этот супернатант = первичная опухоль, NANT или нормальный тиСГУП SN (конечный объем 2,5 мл) с последующим уточнением и аликвоты перед хранением при -80 ° С в течение будущих анализов (см. ниже)
- Жидкость над осадком сливают из 50 мл пробирку.
- Осторожно ресуспендирования обеих клеточных гранул в конечном объеме 1 мл среды. Короче говоря, сначала слегка нарушить осадок клеток в обеих трубках (нажав трубку на твердую поверхность). Ресуспендируют осадок клеток свободную в 50 мл 500 мкл среды и передачи этой клеточной суспензии в 15 мл пробирку для ресуспендирования второй осадок. Повторите этот шаг, как только со второй 500 мкл среды для максимального восстановления клеток.
- Передача 10 мкл клеточной суспензии в небольшой трубки, смешать с 10 мкл трипанового синего (разведение 1: 1) и подсчитать количество жизнеспособных клеток с использованием гемоцитометра.
Примечание: В этот момент часть клеточной суспензии могут также быть проанализированы с помощью проточной цитометрии, чтобы оценить размер ячейки, детализации и, если желательно ограниченное число маркеров субпопуляций для получения дополнительной PRECISE оценка относительного распределения клеток в гомогенате до всестороннего анализа или эксперимента. Все анализы методом проточной цитометрии включают CD45 маркировки для нормализации субпопуляции. - Гранул клетки центрифугированием при 300 х г в течение 10 мин при комнатной температуре. Клетки из опухоли, NANT, или нормальной ткани готовы к дальнейшей очистки или анализа. Эти дополнительные шаги лучше всего, когда выполняется в тот же день, как операции.
Примечание: Для анализа проточной цитометрии, но не сортировки клеток остаточные красные кровяные клетки лизируют следует после мечения антител путем добавления 0,4 мл буфера для лизиса клеток красных кровяных к осадку клеток, сразу же встряхиванием в течение 1 сек и инкубации минимум 10 мин при комнатной Температура (в защищенном от света) перед анализом.
3. Уточнение ткани супернатанта
- Центрифуга трубки 1,5 мл тканевой SN при 15000 х г в течение 15 мин при 4 ° С.
- Осторожно снимите тон супернатант, не касаясь или нарушая гранул. Передача в чистую пробирку (или труб), в зависимости от количества и объема аликвоты желаемых.
- Хранить надосадочную жидкость при температуре -80 ° С для последующего использования.
4. Пациент крови
- Возьмите образец крови от каждого пациента в качестве контроля из вены в гепаринизированные труб день до операции. Центрифуга крови при 400 х г в течение 10 мин при 20 ° С с тормозом выключения для получения плазмы и лейкоцитарной пленки.
- Удалить плазму и уточнения его центрифугированием при 10000 х г в течение 15 мин при 20 ° С. Аликвоты и хранить в плазме при -80 ° С для последующего использования. Развести Баффи пальто в среде
- Отделите мононуклеарных клеток, используя стандартные Ficoll-гипак центрифугирование в градиенте до немедленного анализа, выделения субпопуляции, ДНК / РНК / извлечения белка или криоконсервации.
5. проточной цитометрии
- Этикетка клетки в соответствии с производстваИнструкция по R, при 4 ° С, в защищенном от света месте. Лизировать красные кровяные клетки в суспензии клеток из фрагментов ткани после маркировки антител путем добавления 0,4 мл клеточной буфера для лизиса к осадку клеток.
- Вихревой сразу же в течение 1 сек и инкубировать минимум 10 мин при комнатной температуре, в защищенном от света. Проходят меченых клеток в проточной цитометрии для сбора данных без промывки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Переваривание ферментом фрагментов ткани с коммерчески доступными ткани диссоциации растворов или смесей различных лабораторных коллагеназы, ДНКазы и / или ингибиторов гиалуронидаза, расщеплять широкий спектр рецепторов на поверхности клеток. Наши исследования, изначально нацеленные на CD4 + Т-клетки проникают опухолей молочной железы, были быстро представлены в основных технических проблем в связи с расщеплением поверхностных CD4 рецепторов с использованием стандартных ферментативного расщепления протоколы 4-8. Мы протестировали множество ферментов коллагеназы с или без ДНКазы и ингибиторов гиалуронидаза, установив, что коллагеназы I и II, полностью удалены CD4 на поверхности клеток, несмотря на высокую жизнеспособность лимфоцитов (фиг.3А). Умеренное воздействие на CD4 наблюдалось с коллагеназы IV при малых временах инкубации (1 - 2 ч) с нижней маркировки CD4 антитела, обнаруженных в расщепленной лимфатического узла и опухолевой ткани по сравнению с непереваренной крови и костного мозга из того же пациента (3В; обратите внимание, что из-за ограничений на ткани мы получаем мы были не в состоянии сравнить переваривается и непереваренной лимфатический узел и опухолевой ткани). Эта потеря CD4 было подтверждено, что техническая побочный продукт коллагеназы IV пищеварения путем сравнения непереваренные и расщепляли CD4 + Т-клетки, выделенные из крови здорового донора (данные не показаны). В то время как эти CD4 ло Т-клетки могут быть выделены из коллагеназы IV-расщепл фрагментов ткани с использованием магнитных шариков, очищенные популяции часто содержат различные количества загрязнений другими клетками из микросреды опухоли и, таким образом, были ниже оптимального для экспериментальных целей.
В постоянном поиске лучшего подхода, в 2008 году мы испытали новый механический диссоциатор без использования ферментов. Этот аппарат быстро и целостности поверхности рецепторов производятся ткани молочной железы гомогенаты поддерживается 9. Представитель проточной цитометрии точечных участков клеточной гомогенатах Follo опухолиКрыло диссоциации и маркировка со специфическими антителами против эпителиальных клеток (EpCAM) и лейкоцитов (CD45), показаны на фиг.3С. Эти образы являются типичными регулярные наблюдения за опухоли молочной железы гомогенатах. Этот протокол существенно не изменяет жизнеспособность CD45 + клеток (4% мертвых клеток); Однако, существует значительная потеря жизнеспособных EpCAM + клеток (38% мертвых клеток в опухоли, показанных; варьирует от опухолей). Несмотря на эту потерю, жизнеспособным ЕрСАМ + и CD45 + подмножества могут быть отделены на основании размера и структуры в больших эпителиальных клеток (= опухолевых клеток), малый эпителиальных клеток и крупных клеток CD45 + и CD45 + небольшой клеток (большинства клеток , которые в основном лимфоциты; Фигура 3С).
Значительное увеличение жизнеспособных CD45 + клеток, полученных с помощью этого подхода позволяет приобретение воспроизводимого многоцветной проточной цитометрии данных (с использованиемдо десяти цветов), чтобы более полно охарактеризовать подмножества Тиль при раке молочной железы. Представитель проточной цитометрии точечных участков крупных подмножеств TIL показаны на рисунке 4, с наши недавние эксперименты демонстрируют, что можно также обнаружить и количественно незначительные Т- и В-клеток подмножества проникают в опухоль 10-12, в том числе внутриклеточного окрашивания для канонической Т и В-клетки факторы транскрипции 12. Воротные стратегии лимфоцитов основаны на жизнеспособных CD45 + клеток, выявленных с жизнеспособности пятно. (Примечание: опухоли могут сильно в размере остатков клеток и мертвых клеток эпителия в зависимости от БК подтипа, класса и т.д. отличаться). Этот подход был успешно использован для очистки субпопуляции лимфоцитов из гомогената с использованием магнитных шариков или сортировки клеток для анализа экспрессии генов с помощью микрочипов или QRT-PCR 9. Растворимые медиаторы в SN, в том числе цитокинов и иммуноглобулинов, были количественно, используя bead- на основе иммуноанализа с полученными данными, нормированных к размеру фрагмента ткани. Сравнение экспрессии цитокинов (бассейн Th1 / Th2 / Th7 / Th9 / Th17) или общего иммуноглобулинов (IgA, IgE, IgG, IgM) в до н.э. SN с SN от нормальной ткани молочной железы показывает увеличение как связанные с опухолевой ткани (Рисунок 5). Эти первичные ткани SN были также эффективно анализируют на антигены 10-12 и используется для лечения экспериментально лимфоцитов от здоровых доноров, тем самым воспроизводя фенотип TIL в нормальных клетках 9.
На блок-схема 1. Протокол. Наша методика обработки свежей человеческой ткани и некоторые аналитические подходы, которые впоследствии могут быть использованы для оценки лимфоциты проникают тканей человека показаны.
Рисунок 2. H & E окрашенных образ ткани отпечаток опухоли молочной железы. Это отпечаток, взяты из свежей фрагмента ткани опухоли молочной железы, показывает наличие опухолевых клеток с помощью открытых пространств, отражающих областей, которые не были переданы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию из этой фигуры.
. Рисунок 3. Оптимизация тканей молочной железы диссоциации для анализа проточной цитометрии лимфоцитов анализ: (A) CD4 поверхностной экспрессии на лимфоцитах от непереваренной и коллагеназы I / II расщепл опухолевой ткани; (B) CD4 выражение лимфоцитов из лимфатических узлов и опухолевой ткани переваривается именноч коллагеназы IV и по сравнению с непереваренных крови и костного мозга клеток из того же пациента; и (С) анализ полных лейкоцитов (CD45 +) и эпителиальных клеток (+) ЕрСАМ из опухолевой ткани быстро механически диссоциируют использованием протокола, описанного здесь. Жизнеспособность клеток эпителия и CD45 + клеток с помощью нашего протокола оценивается с помощью включения фиксируемой жизнеспособности красителя. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 4. Опухоль проникает субпопуляций лимфоцитов в гомогенате. Многоцветный анализ проточной цитометрии проводили на день операции после механической диссоциации с использованием протокола, описанного здесь. Жизнеспособных клеток и основные субпопуляции лимфоцитовRe показано: CD3 является пан маркер Т-клеток, CD4 и CD8 являются основными Т-клеток подмножеств маркеры и CD19 является пан маркером В-клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 5. Растворимые медиаторы в надосадочной жидкости. Панель цитокинов (Th1 / Th2 / Th7 / Th9 / Th17) и иммуноглобулины (IgA, IgE, IgG, IgM) были оценены с использованием бисера на основе иммунологических проанализировать SN, производный от нормального и до н.э. тканей с использованием протокола, описанного здесь.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Это исследование описывает оптимизированный способ быстрого приготовления нормальных и злокачественных гомогенатах ткани молочной железы без ферментативного расщепления для последующей сортировки клеток, экстракции, криоконсервации и / или фенотипического анализа CD45 + субпопуляций. Цель этого экспериментального подхода является создание образы TIL, что точно отражают их состояние в естественных условиях и сравнить их с нормальными тканями с минимальной манипуляции тканей свежих из операционной. На сегодняшний день, наша лаборатория использует этот протокол для анализа> 250 свежих BC ткани (опухоль и уберет),> 35 нормальной ткани молочной железы из молочных сокращений. В принципе, этот протокол должен быть непосредственно применимо к другим опухолевых или ткани типа; Однако, некоторые оптимизации могут быть необходимы (например, механической диссоциации программы, число циклов, объем массовой информации и т.д.). Для тканей с низкой инфильтрацией лимфоцитов, используя больший фрагмент ткани могут быть necessичных, что то, что мы делаем для нормальных тканях, где число лимфоцитов на низком уровне. Кроме того, стадии центрифугирования в градиенте плотности могут быть добавлены, чтобы обогатить лейкоцитов суспензии. Этот анализ Т- и В-субпопуляций клеток человека, проникающих опухолей молочной железы включает оценку> 100 маркеров с помощью проточной цитометрии (проточной цитометрии данных для 74 маркеров доступен в дополнительных данных Гу-Trantien, и др. 9) и очистки определенных лимфоцитов субпопуляции для последующих иммунологических и молекулярных анализов. Кроме того, мы оценили цитокинов, хемокинов, иммуноглобулины и опухолевых антигенов в первичной SN опухоли (по сравнению с Нант и нормальной ткани Sn) 10,11 как отражение этих молекулярных медиаторов в опухолевую микросреду. Мы также тестировали эффект лечения лимфоцитов периферической крови здоровых доноров с опухолевой SN и показано, что многие изменения экспрессии генов, обнаруженных в TIL может быть воспроизведена в частности <SUP> 9.
В их микросреды, опухолевые и стромальные клетки более плотно удерживается в ткани, чем матрицы иммунных клеток, которые характерны мигрирующих. Метод, описанный здесь, представляет собой простой и быстрый способ для выделения и анализа TIL без ферментативного расщепления. Наши многочисленные попытки присоединиться к этой механической гомогенизации подход с коротким ферментативным расщеплением, чтобы произвести жизнеспособные и рецептора положительным лимфоидных и эпителиальных клеток из того же фрагмента опухоли были безуспешными. Ткань гомогенизации эффективно освобождает лимфоциты, но приводит к значительной потере жизнеспособности опухолевых клеток. Короче ферментативное расщепление ткани освобождает жизнеспособных опухолевых клеток (общее количество увеличивается в зависимости от времени варки), но приводит к тому, параллельной снижением экспрессии многих поверхностных рецепторов, особенно очевидно на лимфоцитах. Таким образом, для сравнительного анализа опухолевых клеток и TIL из того же свою очередьили все же необходимо, чтобы отдельно обрабатывать два последовательных фрагментов опухоли.
В настоящее время большинство исследований, направленных на характеристики TIL использовали ферментативного расщепления (часы -о / N) часто в сочетании с какой-либо форме механического вскрытия 4-8. Расширение Тиль для дальнейшего анализа или лечения обычно включает в себя последующее Экс Vivo выращивание Тиль или фрагментов опухолевой ткани с стимулирующие агенты (дней до нескольких недель) 13-15. Быстрое, неферментативного Способ ткани диссоциации, описанной здесь, обеспечивает простой и воспроизводимые средства для извлечения нетронутыми CD45 + клетки от нормальных и ненормальных фрагментов ткани до их расширения или анализа. Это быстрый приобретение CD45 + клеток у пациентов, перенесших tumorectomy может быть развит для использования в качестве прогностического биомаркера анализа. Кроме того, он может дать TIL с более высоким потенциалом для экс естественных Расширение до приемных immunotherapy.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантами FROMTHE Бельгийского фонда научных исследований (FNRS), Les Amis де l'Institut Борде, FNRS-операции Télévie, плана раке Бельгии, Fonds Ламбо-Marteaux, Fonds JC Heuson и Fonds Барсы.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GentleMacs Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | BD Medimachine is somewhat equivalent |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf | or other standard table top centrifuge | |
| Centrifuge 5417 R | Eppendorf | or other standard microcentrifuge | |
| Esco Class II A2 Biosafety Cabinet | ESCO global | or other standard BSL2 hood | |
| Inverted Microscope | Nikon eclipse TS100 | or other microscope compatible for a hemacytometer | |
| Bürker Chamber | Marienfield | 640210 | or other standard hemacytometer |
| Navios Flow Cytometer | Beckman Coulter | or other flow cytometer (8-10 color recommended) | |
| GentleMacs C-Tube | Miltenyi Biotec | 130-096-344 | BD Medimachine uses Filcon |
| Cell Culture Dish | Sarstedt | 72,710 | or other non-pyrogenic plasticware |
| Disposable Scalpel | Swann-Morton | 0510 | or standard single use sterile scalpel |
| BD Cell Strainer 40 µm | Becton Dickinson | 734-0002 | or other non-pyrogenic plasticware |
| BD Falcon Tube 50 ml | Becton Dickinson | 352070 | or other non-pyrogenic plasticware |
| BD Falcon Tube 15 ml | Becton Dickinson | 352097 | or other non-pyrogenic plasticware |
| BD FACS Tube 5 ml | Becton Dickinson | 352008 | or other non-pyrogenic plasticware |
| Sterile Pasteur Pipette 5 ml | VWR | 612-1685 | or other non-pyrogenic plasticware |
| Microfuge Tube 1.5 ml | Eppendorf | 7805-00 | or other non-pyrogenic plasticware |
| X-Vivo 20 | Lonza | BE04-448Q | serum-free medium recommended |
| Phosphate buffered saline | Lonza | BE17-516F | standard physiological PBS |
| Trypan blue | VWR | 17942E | or other vital stain |
| VersaLyse | Beckman Coulter | A09777 | for flow cytometry experiments |
| Fixable viability Dye eFluor 780 | eBioscience | 65-0865-14 | for flow cytometry experiments |
| anti-CD3 FITC | BD Biosciences | 345763 | for flow cytometry experiments |
| anti-CD3 Vio Blue | Miltenyi Biotec | 130-094-363 | for flow cytometry experiments |
| anti-CD4 PE | BD Biosciences | 345769 | for flow cytometry experiments |
| anti-CD4 APC | Miltenyi Biotec | 130-091-232 | for flow cytometry experiments |
| anti-CD8 ECD | Beckman Coulter | 737659 | for flow cytometry experiments |
| anti-CD8 PerCP | BD Biosciences | 345774 | for flow cytometry experiments |
| anti-CD19 APC-Vio770 | Miltenyi Biotec | 130-096-643 | for flow cytometry experiments |
| anti-CD45 VioGreen | Miltenyi Biotec | 130-096-906 | for flow cytometry experiments |
References
- Chen, D. S., Mellman, I. Oncology meets immunology: the cancer-immunity cycle. Immunity. 39 (1), 1-10 (2013).
- Boudreau, A., van't Veer, J. L., Bissell, M. J. An 'elite hacker': breast tumors exploit the normal microenvironment program to instruct their progression and biological diversity. Cell Adh Migr. 6 (3), 236-248 (2012).
- Gajewski, T. F., Schreiber, H., Fu, Y. X. Innate and adaptive immune cells in the tumor microenvironment. Nat Immunol. 14 (10), 1014-1022 (2013).
- Quezada, S. A., et al. Limited tumor infiltration by activated T effector cells restricts the therapeutic activity of regulatory T cell depletion against established melanoma. J Exp Med. 205 (9), 2125-2138 (2008).
- Grange, C., et al. Phenotypic characterization and functional analysis of human tumor immune infiltration after mechanical and enzymatic disaggregation. J Immunol Methods. 372 (1-2), 119-126 (2011).
- McCauley, H. A., Guasch, G. Serial orthotopic transplantation of epithelial tumors in single-cell suspension. Methods Mol Biol. 1035, 231-245 (2013).
- Gros, A., et al. Myeloid cells obtained from the blood but not from the tumor can suppress T-cell proliferation in patients with melanoma. Clin Cancer Res. 18 (19), 5212-5223 (2012).
- Zirakzadeh, A. A., Marits, P., Sherif, A., Winqvist, O. Multiplex B cell characterization in blood, lymph nodes, and tumors from patients with malignancies. J Immunol. 190 (11), 5847-5855 (2013).
- Gu-Trantien, C., et al. CD4(+) follicular helper T cell infiltration predicts breast cancer survival. J Clin Invest. 123 (7), 2873-2892 (2013).
- Buisseret, L., et al. Lymphocytes Infiltrating Breast Cancer : Density, Composition And Organization. Annals of Oncology. 25 (1), 17 (2014).
- Garaud, S., et al. Characterization of B Cells Infiltrating Human Breast Cancer. Annals of Oncology. 25 (1), 18 (2014).
- Gu-Trantien, C., et al. Cxcl13-Producing Follicular Helper T Cells In Human Breast Cancer. Annals of Oncology. 25 (1), 17 (2014).
- Yee, C. The use of endogenous T cells for adoptive transfer. Immunol Rev. 257 (1), 250-263 (2014).
- Butler, M. O., et al. Ex vivo expansion of human CD8+ T cells using autologous CD4+ T cell help. PLoS One. 7 (1), 30229 (2012).
- Ye, Q., et al. Engineered artificial antigen presenting cells facilitate direct and efficient expansion of tumor infiltrating lymphocytes. J Transl Med. 9, 131 (2011).
