Abstract
Muligheten av ondartede celler for å unngå immunforsvaret, preget av svulst flukt fra både medfødte og ervervede immunresponser, er nå akseptert som et viktig kjennetegn på kreft. Vår forskning på brystkreft fokuserer på den aktive rollen som tumor infiltrerer lymfocytter spiller i tumorprogresjon og pasient utfall. Mot dette målet, har vi utviklet en metodikk for rask isolering av intakte lymfoide celler fra normale og unormale vev i et forsøk på å vurdere dem andreplassen til sin opprinnelige tilstand. Homogenates utarbeidet ved hjelp av en mekanisk dissociator showet både økt levedyktighet og celle utvinning samtidig bevare overflaten reseptor uttrykk sammenlignet med enzym-fordøyd vev. Videre gjorde enzymatisk fordøyelse av de resterende uløselige materialet ikke gjenopprette flere CD45 + celler som indikerer at kvantitative og kvalitative målinger i primær homogenate sannsynlig genuint reflektere infiltrere subpopulasjoner i vevet fragment. Den lymfoide celler i disse homogenater lett kan karakteriseres ved hjelp av immunologiske (fenotype, proliferasjon, etc.) eller molekyl (DNA, RNA og / eller protein) nærmer seg. CD45 + celler kan også brukes til rensing subpopulasjon, in vitro ekspansjon eller nedfrysing. En ytterligere fordel ved denne tilnærmingen er at den primære vev supernatanten fra homogenater kan brukes til å karakterisere og sammenligne cytokiner, kjemokiner, immunoglobuliner og antigener til stede i normale og maligne vev. Denne protokollen fungerer svært godt for menneske brystvev og bør være knyttet til et bredt utvalg av normale og unormale vev.
Protocol
MERK: Alle prøvene ble anskaffet ved hjelp av en protokoll godkjent av Medical Ethics Committee ved Institutt Jules Bordet med skriftlig informert samtykke innhentes fra hver pasient.
1. Klargjøring av vevhomogenat
- Dissekere resected vev (ondartet og normalt vev resected fra operasjonsstuen) er i patologi lab av opplært personell for umiddelbar henting. Svulst, NANT (tatt lengst avstand fra svulsten som mulig) og normalt vev fragmenter blir rutinemessig behandlet innen 1 - 3 hr av kirurgisk eksisjon i en BSL2 laboratorium ved hjelp av standard biosikkerhet prosedyrer for menneskelig vev. Et flytskjema av protokollen er vist i figur 1.
- Veie alle vevfragmenter (normal, Nant og tumor) og måle lengde, bredde og høyde (lengde x bredde x høyde). Dette er et viktig skritt for den påfølgende normalisering av cellepopulasjoner, ekstrahert RNA, etc.
NEITE: Utvalget av utvalgsstørrelse er 100 til 10 000 mm 3 uten fett hvis mulig. - Forlaget tumorfragment på et objektglass for H & E-farging for å verifisere at vevet er faktisk en del av tumoren.
- Gjør dette ved å trykke et glass objektglass på svulsten fragment og bruke milde press med fingrene for et par sekunder.
- Fest lysbilde med isopropanol for 2 minutter etterfulgt av et vasketrinn i vann. Counterstain vevet i 30 sek med Mayers hematoksylin.
- Vask raset i seks bad vann. Flekken i Phloxine B 2% for 15 sek.
- Vask i ett bad med vann etterfulgt av fire bad av isopropanol og avslutt med ett bad med vann.
- Inkuber i isopropanol i 1 min og avløp. Klart i to bad xylen.
- Monter med xylen basert montering medium. Undersøk for tumorcelledannelse (Figur 2).
MERK: Hovedsakelig, kreftceller holde seg til trykt lysbilde - den stromal, lymfoid eller annonseipose celler sjelden holde seg, slik at rommene mellom tumorceller (figur 2).
- Plasser vev fragment i en liten kulturskål inneholdende 1 ml av kjemisk definert, serumfritt hematopoietisk cellemedium (heretter referert til som medium) ved romtemperatur og terninger det opp i små biter (~ 1 - 2 mm 2) ved hjelp av en steril skalpell.
- Overføre alt (vevfragmenter + medium) til en mekanisk dissociator C røret.
- Skyll petriskål og skalpell med 2 ml medium med en Pasteur pipette og legge dette til C tube (volum av medium for dissosiasjon = 3 ml).
- Bruk den mekaniske dissociator program A.01 for C-rør (den mest skånsomme programmet) for å homogenisere vev fragmenter i en enkelt celle suspensjon. Plasser C rør i apparatet og kjøre programmet to ganger etter hverandre (en syklus = 25 sek).
MERK: Dette Homogeniseringsprosedyren er etablert og validert for menneskelig brystvev, andre tumeller eller vev typer kan være nødvendig å bruke et annet program og bør testes først. - Fjern C røret fra apparatet og dekanter homogenatet direkte inn i en 40 um cellefilter satt på en 50 ml-rør. Ved bruk av samme Pasteur pipette som i trinn 1.6, overfører en hvilken som helst væske som er igjen i røret C til cellefilter.
- Overføre den filtrerte væsken inn i et 15 ml rør ved anvendelse av en 1 ml mikropipette spissen. Midlertidig holde celle sil og sin 50 ml tube.
- Skyll C-røret med ytterligere 3 ml medium og overføre denne, igjen ved å bruke den samme Pasteur pipette som i trinn 1.6, i den cellefilter fremdeles sittende på 50 ml rør. Klem en maksimal mengde av den resterende væske fanget i unhomogenized vevet inn i 50 ml rør ved forsiktig å bevege det rundt silen med en ren Pasteur pipette eller 1 ml spiss som deretter kastes for å unngå forurensing av eluatet.
- Plasser celle sil opp ned på tHan opprinnelige C røret og skyll med 3 ml medium slik at unhomogenized vevet faller tilbake inn i røret C.
- Re-homogen som i trinn 1.7 i to sykluser av A.01 programmet.
- Hell dette andre homogenat gjennom cellefilter sittende på 50 ml rør, skyll C røret igjen med 3 ml medium (som i trinn 1.10), og overføre den Pasteur pipette til cellefilter sittende på 50 ml rør igjen å klemme en maksimal Mengden av væske fra den gjenværende bindevev fanget i cellefilter.
- På dette punkt er et volum på ~ 2,5 ml i 15 ml rør og ~ 9 ml i 50 ml-rør.
2. Separering av vevet supernatanten og celle
- Sentrifuger homogenater i 15 ml og 50 ml rør i 15 minutter ved 600 x g ved romtemperatur.
- Dekanter SN fra 15 ml rør i et rent rør og midlertidig lagre ved 4 ° C. Dette supernatant = primærtumor, NANT eller normal tissue SN (sluttvolum 2,5 ml) blir deretter klares og porsjonert før lagring ved -80 ° C for fremtidig analyse (se nedenfor).
- Kast supernatanten fra 50 ml tube.
- Forsiktig resuspender begge cellepelletene i et sluttvolum på 1 ml medium. Kort beskrevet, først forsiktig bryte cellepelleten i begge rørene (ved å trykke røret på en hard overflate). Resuspender cellepelleten løst i 50 ml med 500 ul medium og overføre denne cellesuspensjon til 15 ml røret for å resuspendere den andre pellet. Gjenta dette trinnet en gang med de andre 500 mL av medium for maksimal utvinning av celler.
- Overføring 10 mL av cellesuspensjonen til en liten tube, bland med 10 ul trypanblått (fortynning 1: 1) og teller antall levedyktige celler ved hjelp av en hemocytometer.
MERK: På dette punktet en brøkdel av cellesuspensjonen kan også bli analysert av flowcytometri for å vurdere cellestørrelse, detaljnivå og om ønskelig et begrenset antall undergruppe markører for mer precise vurdering av den relative cellefordeling i homogenatet før omfattende analyse eller eksperimentering. Alle analyser ved flowcytometri innlemme CD45 merking for normalisering av undergruppene. - Pelletere cellene ved sentrifugering ved 300 xg i 10 minutter ved romtemperatur. Cellene fra svulsten, NANT, eller normalt vev er nå klar for ytterligere rensning eller analyse. Disse trinnene er best når utført på samme dag som operasjonen.
NB: For flowcytometrisk analyse, men ikke cellesortering de gjenværende røde blodceller skal bli lysert etter antistoff-merking ved tilsetning av 0,4 ml røde blodcellelysebuffer til cellepelleten, umiddelbart virvling i 1 sek og inkubering i minst 10 min ved værelses temperatur (beskyttet fra lys) før analyse.
3. Avklaring av Tissue Supernatant
- Sentrifuger 1,5 ml rør med vev SN ved 15.000 xg i 15 min ved 4 ° C.
- Fjern forsiktig than supernatanten uten å røre eller forstyrre pelleten. Overfør til et rent rør (eller rør), avhengig av antallet og volumet av de ønskede porsjoner.
- Oppbevar supernatanten ved -80 ° C for fremtidig bruk.
4. Pasient Blood
- Samle en blodprøve fra hver pasient som en kontroll ved venepunksjon i hepariniserte rør dagen før operasjonen. Sentrifugere blodet ved 400 x g i 10 min ved 20 ° C med en brems for å oppnå plasma og et buffy coat.
- Fjerne plasma og klargjøre den ved sentrifugering ved 10 000 xg i 15 min ved 20 ° C. Alikvoter og lagre plasma ved -80 ° C for fremtidig bruk. Fortynne buffycoat i medium
- Separer mononukleære celler ved hjelp av standard ficoll-hypaque gradientsentrifugering før umiddelbar analyse, undergruppe isolasjon, DNA / RNA / protein utvinning eller nedfrysing.
5. flowcytometrisystemer
- Etikett celler i henhold til fremstillingenr instruksjoner ved 4 ° C, beskyttet mot lys. Lyse røde blodceller i cellesuspensjoner fra vevfragmenter etter antistoffmerking ved å tilsette 0,4 ml av cellelyseringsbuffer til cellepelleten.
- Vortex umiddelbart etter 1 sek og inkuberes i minst 10 minutter ved romtemperatur, beskyttet mot lys. Før de merkede celler i et strømningscytometer for datainnsamling uten vasking.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Enzymatisk nedbrytning av vev fragmenter med enten kommersielt tilgjengelige vev dissosiasjon løsninger eller forskjellige laboratorie blandinger av kollagenase, DNase og / eller hyaluronidase inhibitorer, spalte et bredt utvalg av reseptorer på overflaten av celler. Våre studier, i første omgang fokusert på CD4 + T-celler infiltrere brystsvulster, ble raskt presentert med et stort teknisk problem på grunn av spalting av overflate CD4 reseptorer som bruker standard enzymatiske fordøyelsen protokoller 4-8. Vi testet en rekke kollagenase-enzymer med eller uten DNase og hyaluronidase inhibitorer, finne at kollagenase I og II helt fjernet CD4 fra celleoverflaten, til tross for høy levedyktighet av lymfocytt (figur 3A). En moderat effekt på CD4 ble observert med kollagenase IV ved korte inkubasjonstider (1 - 2 hr) med lavere CD4 antistoff merking detektert i fordøyd lymfeknute og tumorvev sammenlignet med ufordøyd blod og benmarg fra den samme pasient (Figur 3B; oppmerksom på at på grunn av begrensninger i vevet vi mottar vi klarte ikke å sammenligne fordøyd og ufordøyd lymfeknute og svulstvev). Dette tap av CD4 ble bekreftet å være en teknisk biprodukt av kollagenase IV fordøyelse ved å sammenligne ufordøyde og fordøyd CD4 + T-celler isolert fra friskt blod donor (data ikke vist). Mens disse CD4 lo T-celler kan bli isolert fra kollagenase-IV-spaltet vevsfragmenter ved hjelp av magnetiske kuler, de rensede populasjoner ofte inneholde varierende mengder av forurensning av andre celler fra tumormikromiljøet og dermed var suboptimal for våre eksperimentelle formål.
I en kontinuerlig søken etter en bedre tilnærming, i 2008 har vi testet en ny mekanisk dissociator uten å bruke enzymer. Dette apparatet produsert bryst vevshomogenater raskt og med overflatereseptor integritet opprettholdes 9. Representant flowcytometri prikkplotter av svulsten cellehomogenater Follovinge dissosiasjon og merking med spesifikke antistoffer mot epitelceller (EpCAM) og leukocytter (CD45) er vist i figur 3C. Disse bildene er typiske rutinemessige observasjoner for brystkreft homogenater. Denne protokollen ikke signifikant påvirker levedyktigheten til CD45 + celler (4% døde celler); Det er imidlertid et betydelig tap av levedyktige EpCAM + celler (38% døde celler i tumor vist; varierer mellom tumorer). Til tross for dette tap, kan det levedyktige EpCAM + og CD45 + -undergrupper bli separert på basis av størrelse og struktur til store epitelceller (= tumorceller), små epitelceller og store CD45 + celler og liten CD45 + celler (de fleste cellene , som er hovedsakelig lymfocytter, figur 3C).
Den betydelige økningen i levedyktige CD45 + celler innhentet ved hjelp av denne tilnærmingen tillater kjøp av reproduserbar flerfarget flowcytometri data (ved hjelpopptil ti farger) til mer fullstendig karakterisere TIL undergrupper i brystkreft. Representative flowcytometri dot plots av de store til undergrupper er vist i figur 4, med våre nylige eksperimenter som viser at det også er mulig å påvise og kvantifisere mindre T- og B-celler undergrupper infiltrerer tumoren 10-12, inkludert intracellulær farging for kanonisk T og B-celle transkripsjonsfaktorene 12. Gating strategier for lymfocytter er basert på levedyktige CD45 + celler identifisert med en levedyktighet flekk (merk:. Svulster kan variere sterkt i mengden av mobilnettet rusk og døde epitelceller avhengig av BC subtype, klasse, etc). Denne tilnærmingen har blitt brukt til å rense lymfocytsubpopulasjoner fra homogenate med magnetiske kuler eller celle sortering genuttrykk analyse ved hjelp av mikromatriser eller QRT-PCR 9 for. Løselig meklere i SN, inkludert cytokiner og immunglobuliner, er tallfestet ved hjelp av en bead basert immunoassay med de resulterende dataene normalisert til størrelsen av vevet fragment. En sammenligning av cytokin uttrykk (en Th1 / Th2 / TH7 / Th9 / Th17 basseng) eller total immunglobuliner (IgA, IgE, IgG, IgM) i BC SN med SN fra normalt brystvev avslører økning i både knyttet til svulstvev (Figur 5). Disse primære vev SN er også effektivt analysert for antigener 10-12 og anvendes for eksperimentell behandling av lymfocytter fra friske donorer, for derved å gjengi TIL fenotype i normale celler 9.
Figur 1. Protokoll flytskjema. Vår prosedyre for behandling ferske menneskelig vev og noen analytiske tilnærminger som senere kan brukes til å vurdere lymfocytter infiltrere menneskelig vev vises.
Figur 2. H & E farget bilde av et bryst svulstvev avtrykk. Denne avtrykk, hentet fra en fersk bryst svulstvev fragment, viser tilstedeværelse av kreftceller med åpne plasser som gjenspeiler områder som ikke ble overført. Klikk her for å se en større versjon av denne figur.
Fig. 3. Optimalisering av brystvev dissosiasjon for lymfocytt analyse Strømningscytometrisk analyse av: (A) CD4-overflate ekspresjon på lymfocytter fra ufordøyd og Kollagenase I / II spaltet tumorvev; (B) CD4 uttrykk på lymfocytter fra lymfeknute og svulstvev fordøyd viddh Kollagenase IV og sammenlignet med ufordøyde blod og benmargsceller fra samme pasient; og (C) analyse av totale leukocytter (CD45 +) og epitelceller (EpCAM +) fra tumorvev hurtig mekanisk dissosiert ved anvendelse av protokollen som er beskrevet her. Levedyktighet av epitelceller og CD45 + celler ved hjelp av vår protokollen er vurdert gjennom inkorporering av fixable levedyktighet fargestoff. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Tumor infiltrerende lymfocytt-delmengdene i homogenatet. Multi strømningscytometrisk analyse ble utført på dagen for kirurgi etter mekanisk dissosiasjon ved anvendelse av protokollen som er beskrevet her. De levedyktige celler og store lymfocytt-subpopulasjoner enre vist: CD3 er et pan T-celle markør, CD4 og CD8 er store T-celle delsett markører og CD19 er et pan B-celle markør. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. Løselig meklere i supernatanten. Et panel av cytokiner (Th1 / Th2 / TH7 / Th9 / Th17) og immunglobuliner (IgA, IgE, IgG, IgM) ble vurdert ved hjelp perle baserte immunoassays å analysere SN avledet fra normal og BC vev ved anvendelse av protokollen som er beskrevet her.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne studien beskriver en optimalisert metode for rask tilberedning av normale og maligne bryst vevshomogenater uten enzymatisk fordøyelse for påfølgende celle sortering, utvinning, nedfrysing og / eller fenotypiske analyse av CD45 + subpopulasjoner. Målet med denne eksperimentelle tilnærming er å produsere bilder av TIL som tett reflekterer deres in vivo staten og sammenligne dem med normalt vev med minimal manipulering av vev frisk fra operasjonsstuen. Til dags dato har vårt laboratorium brukt denne protokollen til å analysere> 250 friske BC vev (tumor og Nant),> 35 normale bryst vev fra brystreduksjoner. I prinsippet bør denne protokollen være direkte relevant for andre tumor eller vevstyper; Imidlertid kan noen optimalisering være nødvendig (dvs. mekanisk dissosiasjon program, antallet sykluser, medievolumet, etc.). For vev med lav lymfocyttinfiltrasjon, ved hjelp av en større vev fragment kan være nødvenær, som er hva vi gjør for normalt vev der lymfocytter er lav. Alternativt kan en densitetsgradient sentrifugeringstrinn tilsettes for å berike leukocytt-suspensjon. Denne analyse av humane T- og B-celle-subpopulasjoner infiltrerende brysttumorer omfatter en vurdering av> 100 markører ved flowcytometri (flowcytometri data for 74 markører er tilgjengelig i de utfyllende data for Gu-Trantien, et al. 9), og rensing av spesifikke lymfocytt subpopulasjoner for påfølgende immunologiske og molekylær analyser. Videre har vi undersøkt cytokiner, kjemokiner, immunoglobuliner og tumorantigener i primærtumor SN (i forhold til NANT og normalt vev SN) 10,11 som en refleksjon av de molekylære mediatorene i tumormikromiljøet. Vi har også testet effekten av behandling av lymfocytter fra perifert blod fra friske donorer med tumor SN og vist at mange av genekspresjon endringer detektert i TIL kan reproduseres spesifikt <sup> 9.
I deres mikromiljø, er tumor og stromale celler tettere holdes i vevet matrise enn de immunceller, som er karakteristisk vandrings. Den metode som er beskrevet her gir en enkel og rask måte for å isolere og analysere TIL uten enzymatisk oppslutning. Våre mange forsøk på å bli med i denne mekanisk homogenisering tilnærming med en kort enzymatisk fordøyelse å produsere levedyktige og reseptor positiv lymfoide og epitelceller fra samme svulst fragment har vært mislykket. Tissue homogenisering effektivt frigir lymfocytter, men resulterer i et betydelig tap av tumorcellelevedyktighet. En kort enzymatisk nedbrytning av vevet under dannelse av levedyktige tumorceller (det totale antallet øker som en funksjon av koketiden), men har som følge av en parallell nedgang i ekspresjon av mange overflatereseptorer, spesielt tydelig på lymfocytter. Således, for sammenlignende analyse av tumorceller og TIL fra samme tumeller det er fortsatt nødvendig å separat behandle to sekvensielle tumorfragmenter.
Foreløpig har de fleste studier designet for å karakterisere TIL ansatt enzymatiske fordøyelsen (timer til O / N) ofte kombinert med noen form for mekanisk disseksjon 4-8. Utvidelse av TIL for videre analyse eller terapi generelt innebærer påfølgende ex vivo dyrking av TIL eller svulst vev fragmenter med stimulerende midler (dager til uker) 13-15. Den hurtige, ikke-enzymatisk metode for vev dissosiasjon beskrevet her gir en enkel og reproduserbar måte for å ekstrahere intakt CD45 + celler fra normale og unormale vev fragmenter før deres ekspansjon eller analyse. Dette snarlig oppkjøp av CD45 + celler fra pasienter som gjennomgår tumorectomy kan muligens bli utviklet for bruk i en prognostisk biomarkør analysen. I tillegg kan det gi TIL med større potensial for ex vivo ekspansjon før adoptiv immunotherapy.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet med tilskudd Bergem belgiske Fund for Scientific Research (FNRS), Les Amis de l'Institut Bordet, FNRS-drift Télévie, Plan Kreft i Belgia, Fonds Lambeau-marteaux, Fonds JC Heuson og Fonds Barsy.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GentleMacs Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | BD Medimachine is somewhat equivalent |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf | or other standard table top centrifuge | |
| Centrifuge 5417 R | Eppendorf | or other standard microcentrifuge | |
| Esco Class II A2 Biosafety Cabinet | ESCO global | or other standard BSL2 hood | |
| Inverted Microscope | Nikon eclipse TS100 | or other microscope compatible for a hemacytometer | |
| Bürker Chamber | Marienfield | 640210 | or other standard hemacytometer |
| Navios Flow Cytometer | Beckman Coulter | or other flow cytometer (8-10 color recommended) | |
| GentleMacs C-Tube | Miltenyi Biotec | 130-096-344 | BD Medimachine uses Filcon |
| Cell Culture Dish | Sarstedt | 72,710 | or other non-pyrogenic plasticware |
| Disposable Scalpel | Swann-Morton | 0510 | or standard single use sterile scalpel |
| BD Cell Strainer 40 µm | Becton Dickinson | 734-0002 | or other non-pyrogenic plasticware |
| BD Falcon Tube 50 ml | Becton Dickinson | 352070 | or other non-pyrogenic plasticware |
| BD Falcon Tube 15 ml | Becton Dickinson | 352097 | or other non-pyrogenic plasticware |
| BD FACS Tube 5 ml | Becton Dickinson | 352008 | or other non-pyrogenic plasticware |
| Sterile Pasteur Pipette 5 ml | VWR | 612-1685 | or other non-pyrogenic plasticware |
| Microfuge Tube 1.5 ml | Eppendorf | 7805-00 | or other non-pyrogenic plasticware |
| X-Vivo 20 | Lonza | BE04-448Q | serum-free medium recommended |
| Phosphate buffered saline | Lonza | BE17-516F | standard physiological PBS |
| Trypan blue | VWR | 17942E | or other vital stain |
| VersaLyse | Beckman Coulter | A09777 | for flow cytometry experiments |
| Fixable viability Dye eFluor 780 | eBioscience | 65-0865-14 | for flow cytometry experiments |
| anti-CD3 FITC | BD Biosciences | 345763 | for flow cytometry experiments |
| anti-CD3 Vio Blue | Miltenyi Biotec | 130-094-363 | for flow cytometry experiments |
| anti-CD4 PE | BD Biosciences | 345769 | for flow cytometry experiments |
| anti-CD4 APC | Miltenyi Biotec | 130-091-232 | for flow cytometry experiments |
| anti-CD8 ECD | Beckman Coulter | 737659 | for flow cytometry experiments |
| anti-CD8 PerCP | BD Biosciences | 345774 | for flow cytometry experiments |
| anti-CD19 APC-Vio770 | Miltenyi Biotec | 130-096-643 | for flow cytometry experiments |
| anti-CD45 VioGreen | Miltenyi Biotec | 130-096-906 | for flow cytometry experiments |
References
- Chen, D. S., Mellman, I. Oncology meets immunology: the cancer-immunity cycle. Immunity. 39 (1), 1-10 (2013).
- Boudreau, A., van't Veer, J. L., Bissell, M. J. An 'elite hacker': breast tumors exploit the normal microenvironment program to instruct their progression and biological diversity. Cell Adh Migr. 6 (3), 236-248 (2012).
- Gajewski, T. F., Schreiber, H., Fu, Y. X. Innate and adaptive immune cells in the tumor microenvironment. Nat Immunol. 14 (10), 1014-1022 (2013).
- Quezada, S. A., et al. Limited tumor infiltration by activated T effector cells restricts the therapeutic activity of regulatory T cell depletion against established melanoma. J Exp Med. 205 (9), 2125-2138 (2008).
- Grange, C., et al. Phenotypic characterization and functional analysis of human tumor immune infiltration after mechanical and enzymatic disaggregation. J Immunol Methods. 372 (1-2), 119-126 (2011).
- McCauley, H. A., Guasch, G. Serial orthotopic transplantation of epithelial tumors in single-cell suspension. Methods Mol Biol. 1035, 231-245 (2013).
- Gros, A., et al. Myeloid cells obtained from the blood but not from the tumor can suppress T-cell proliferation in patients with melanoma. Clin Cancer Res. 18 (19), 5212-5223 (2012).
- Zirakzadeh, A. A., Marits, P., Sherif, A., Winqvist, O. Multiplex B cell characterization in blood, lymph nodes, and tumors from patients with malignancies. J Immunol. 190 (11), 5847-5855 (2013).
- Gu-Trantien, C., et al. CD4(+) follicular helper T cell infiltration predicts breast cancer survival. J Clin Invest. 123 (7), 2873-2892 (2013).
- Buisseret, L., et al. Lymphocytes Infiltrating Breast Cancer : Density, Composition And Organization. Annals of Oncology. 25 (1), 17 (2014).
- Garaud, S., et al. Characterization of B Cells Infiltrating Human Breast Cancer. Annals of Oncology. 25 (1), 18 (2014).
- Gu-Trantien, C., et al. Cxcl13-Producing Follicular Helper T Cells In Human Breast Cancer. Annals of Oncology. 25 (1), 17 (2014).
- Yee, C. The use of endogenous T cells for adoptive transfer. Immunol Rev. 257 (1), 250-263 (2014).
- Butler, M. O., et al. Ex vivo expansion of human CD8+ T cells using autologous CD4+ T cell help. PLoS One. 7 (1), 30229 (2012).
- Ye, Q., et al. Engineered artificial antigen presenting cells facilitate direct and efficient expansion of tumor infiltrating lymphocytes. J Transl Med. 9, 131 (2011).
