Summary

פרוטוקול פשוט ומהיר לללא אנזימי רקמות אנושיות טריות לנתק לניתוח להחדרה לימפוציטים

Published: December 06, 2014
doi:

Summary

This protocol describes the rapid non-enzymatic dissociation of fresh human tissue fragments for qualitative and quantitative assessment of CD45+ cells (lymphocytes/leukocytes) present in various normal and malignant human tissues. Additionally, the supernatant obtained from the primary tissue homogenate can be collected and stored for further analysis or experimentation.

Abstract

היכולת של תאים ממאירים ללהתחמק ממערכת החיסון, המתאפיינת בבריחת גידול משני תגובות חיסון מולדים ובעלי כושר הסתגלות, מקובל כיום כסימן היכר חשוב של הסרטן. המחקר שלנו על סרטן השד מתמקד בתפקיד הפעיל שלימפוציטים גידול הסתננות לשחק בהתקדמות גידול ותוצאת מטופל. לקראת מטרה זו, פיתחנו מתודולוגיה לבידוד המהיר של תאי הלימפה שלמים מרקמות נורמליות ולא נורמליות במאמץ כדי להעריך אותם בסמוך למדינה האם שלהם. Homogenates הוכנה באמצעות תכנית Dissociator מכאנית שתי התאוששות כדאיות ותא גדלה תוך שמירת רקמות לעומת ביטוי קולט משטח לאנזים-מעוכלות. יתר על כן, עיכול אנזימטי של החומר מסיס שנותר לא התאושש CD45 תאים + נוספים מצביעים על כך שמדידות כמותיות ואיכותיות בhomogenate העיקרי העשויים באמת משקפות תת-אוכלוסיות שחדרו בfragm הרקמהאף אוזן גרון. תאי הלימפה בhomogenates אלה יכולים להיות בקלות מאופיינת באמצעות חיסוני (פנוטיפ, הפצה, וכו ') או מולקולרי (DNA, RNA ו / או חלבון) מתקרב. גם תאי CD45 + יכולים לשמש לטיהור תת-אוכלוסייה, התרחבות במבחנה או הקפאה. יתרון נוסף של גישה זו הוא שsupernatant הרקמה העיקרי מhomogenates יכול לשמש כדי לאפיין ולהשוות ציטוקינים, כמוקינים, נוגדנים ואנטיגנים הנמצאים ברקמות נורמליות וממאירים. פונקציות זה פרוטוקול טוב מאוד לרקמות שד אנושיות וצריכה להיות ישימות למגוון רחב של רקמות נורמליות ולא נורמליות.

Introduction

The tumor microenvironment is composed of various cell types with numerous studies showing they each play distinct and important roles in tumorigenesis1,2. These include, but are not limited to, infiltrating immune cells, stromal cells, endothelial cells and tumor cells3. Ex vivo studies of tumor infiltrating lymphocytes (TIL; CD45+ cells or leukocytes, which are predominantly lymphocytes in breast tumors) from fresh human tissue samples is made difficult by their low frequency, the small sample sizes often available for research and the potential for loss of viability during extraction. Because immune cells infiltrating tumors are usually present as passengers rather than permanent residents in general they are easier to release from the tissue matrix.

Dissociating tumor tissue while maintaining cellular integrity is technically challenging and has traditionally been performed using a combination of mechanical and enzymatic steps to prepare single cell suspensions4-8. This approach involves lengthy incubation periods and is associated with a significant reduction in cell viability as well as the loss of cell surface receptors by enzymatic cleavage. High quality flow cytometric studies characterizing TIL in the tumor microenvironment as well as clean purifications of CD45+ subpopulations by flow cytometry or antibody-coated beads are more difficult to achieve from enzyme-digested tumor tissue. In addition, the supernatant (SN) from the resulting tumor homogenate is not amenable to further analysis including quantification of secreted proteins (cytokines, chemokines, immunoglobulins or tumor antigens) or experimental treatment of normal cells, because of the potential for protein degradation in the enzymatic digests.

In our search for a method to prepare single cell homogenates from breast tissues [including tumor, non-adjacent non-tumor (NANT) and normal (from mammary reductions) breast tissues] without enzymatic digestion, we tested a variety of mechanical homogenization techniques. Homogenates prepared using a mechanical dissociator had increased cell viability (2-fold) and total cell recovery (2-fold) while preserving surface receptor expression. Enzymatic digestion of the remaining insoluble material did not recover additional CD45+ cells suggesting they were all released in the initial homogenate. Thus, this rapid and simple approach allows both qualitative and quantitative assessment of the CD45+ subpopulations present in various normal and malignant human tissues. An added advantage of this approach is that the SN from the initial homogenate (primary tissue SN) can be collected and stored for further analysis or experimentation.

Protocol

הערה: כל הדגימות נרכשו באמצעות פרוטוקול שאושר על ידי ועדת האתיקה הרפואית של מכון ז'ול בורדה בכתב הסכמה מהדעת שהתקבלה מכל מטופל. 1. הכנת homogenate רקמות לנתח רקמות resected (רקמה ממארת ונו…

Representative Results

עיכול אנזימתי של שברי רקמות עם שני פתרונות זמינים מסחרי ניתוק רקמה או תערובות מעבדה שונות של collagenase, DNase ו / או מעכבי hyaluronidase, לדבוק במגוון רחב של קולטנים על פני השטח של תאים. המחקרים שלנו, התמקדו בתחילה בתאי CD4 + T חדירת גידולים בשד, הוצגו במהירות עם בעיה טכנית עיקרי…

Discussion

מחקר זה מתאר שיטה מותאמת להכנה המהירה של homogenates רקמת שד הנורמלית וממאירים ללא עיכול אנזימטי למיון לאחר תא, חילוץ, הקפאה ו / או ניתוח פנוטיפי של CD45 + תת-אוכלוסיות. המטרה של הגישה הניסויית הזה היא לייצר תמונות של TIL המשקף באופן הדוק את מדינתם in vivo ולהשוות אותם לר…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי מענקי fromthe קרן בלגית למחקר מדעי (FNRS), Les Amis de l'Institut Bordet, FNRS הפעולה Télévie, התכנית למלחמה בסרטן בבלגיה, Fonds לאמבו-Marteaux, Fonds JC Heuson וFonds Barsy.

Materials

Equipment Company Catalog Number Comments/Description
GentleMacs Dissociator  Miltenyi Biotec 130-093-235 BD Medimachine is somewhat equivalent
Centrifuge 5810 R Eppendorf N/A or other standard table top centrifuge
Centrifuge 5417 R Eppendorf N/A or other standard microcentrifuge
Esco Class II A2 Biosafety Cabinet ESCO global N/A or other standard BSL2 hood
Inverted Microscope Nikon eclipse TS100 N/A or other microscope compatible for a hemacytometer
Bürker Chamber Marienfield  640210 or other standard hemacytometer
Navios Flow Cytometer Beckman Coulter N/A or other flow cytometer (8-10 color recommended)
Materials Company Catalog Number Comments/Description
GentleMacs C-Tube Miltenyi Biotec 130-096-344 BD Medimachine uses Filcon
Cell Culture Dish Sarstedt 72,710 or other non-pyrogenic plasticware 
Disposable Scalpel Swann-Morton 0510 or standard single use sterile scalpel
BD Cell Strainer 40µm Becton Dickinson 734-0002 or other non-pyrogenic plasticware 
BD Falcon Tube 50mL Becton Dickinson 352070 or other non-pyrogenic plasticware 
BD Falcon Tube 15mL Becton Dickinson 352097 or other non-pyrogenic plasticware 
BD FACS Tube 5mL Becton Dickinson 352008 or other non-pyrogenic plasticware 
Sterile Pasteur Pipette 5 mL  VWR 612-1685 or other non-pyrogenic plasticware 
Microfuge Tube 1.5 mL Eppendorf 7805-00 or other non-pyrogenic plasticware 
Reagents Company Catalog Number Comments/Description
X-Vivo 20 Lonza BE04-448Q serum-free medium recommended
Phosphate buffered saline Lonza BE17-516F standard physiological PBS
Trypan blue  VWR 17942E or other vital stain
VersaLyse Beckman Coulter A09777 for flow cytometry experiments
Fixable viability Dye eFluor 780  eBioscience 65-0865-14 for flow cytometry experiments
anti-CD3 FITC BD Biosciences 345763 for flow cytometry experiments
anti-CD3 Vio Blue Miltenyi Biotec 130-094-363 for flow cytometry experiments
anti-CD4 PE BD Biosciences 345769 for flow cytometry experiments
anti-CD4 APC Miltenyi Biotec 130-091-232 for flow cytometry experiments
anti-CD8 ECD Beckman Coulter 737659 for flow cytometry experiments
anti-CD8 PerCP BD Biosciences 345774 for flow cytometry experiments
anti-CD19 APC-Vio770 Miltenyi Biotec 130-096-643 for flow cytometry experiments
anti-CD45 VioGreen Miltenyi Biotec 130-096-906 for flow cytometry experiments

References

  1. Chen, D. S., Mellman, I. Oncology meets immunology: the cancer-immunity cycle. Immunity. 39 (1), 1-10 (2013).
  2. Boudreau, A., van’t Veer, J. L., Bissell, M. J. An ‘elite hacker’: breast tumors exploit the normal microenvironment program to instruct their progression and biological diversity. Cell Adh Migr. 6 (3), 236-248 (2012).
  3. Gajewski, T. F., Schreiber, H., Fu, Y. X. Innate and adaptive immune cells in the tumor microenvironment. Nat Immunol. 14 (10), 1014-1022 (2013).
  4. Quezada, S. A., et al. Limited tumor infiltration by activated T effector cells restricts the therapeutic activity of regulatory T cell depletion against established melanoma. J Exp Med. 205 (9), 2125-2138 (2008).
  5. Grange, C., et al. Phenotypic characterization and functional analysis of human tumor immune infiltration after mechanical and enzymatic disaggregation. J Immunol Methods. 372 (1-2), 119-126 (2011).
  6. McCauley, H. A., Guasch, G. Serial orthotopic transplantation of epithelial tumors in single-cell suspension. Methods Mol Biol. 1035, 231-245 (2013).
  7. Gros, A., et al. Myeloid cells obtained from the blood but not from the tumor can suppress T-cell proliferation in patients with melanoma. Clin Cancer Res. 18 (19), 5212-5223 (2012).
  8. Zirakzadeh, A. A., Marits, P., Sherif, A., Winqvist, O. Multiplex B cell characterization in blood, lymph nodes, and tumors from patients with malignancies. J Immunol. 190 (11), 5847-5855 (2013).
  9. Gu-Trantien, C., et al. CD4(+) follicular helper T cell infiltration predicts breast cancer survival. J Clin Invest. 123 (7), 2873-2892 (2013).
  10. Buisseret, L., et al. Lymphocytes Infiltrating Breast Cancer : Density, Composition And Organization. Annals of Oncology. 25 (1), 17 (2014).
  11. Garaud, S., et al. Characterization of B Cells Infiltrating Human Breast Cancer. Annals of Oncology. 25 (1), 18 (2014).
  12. Gu-Trantien, C., et al. Cxcl13-Producing Follicular Helper T Cells In Human Breast Cancer. Annals of Oncology. 25 (1), 17 (2014).
  13. Yee, C. The use of endogenous T cells for adoptive transfer. Immunol Rev. 257 (1), 250-263 (2014).
  14. Butler, M. O., et al. Ex vivo expansion of human CD8+ T cells using autologous CD4+ T cell help. PLoS One. 7 (1), 30229 (2012).
  15. Ye, Q., et al. Engineered artificial antigen presenting cells facilitate direct and efficient expansion of tumor infiltrating lymphocytes. J Transl Med. 9, 131 (2011).

Play Video

Cite This Article
Garaud, S., Gu-Trantien, C., Lodewyckx, J., Boisson, A., De Silva, P., Buisseret, L., Migliori, E., Libin, M., Naveaux, C., Duvillier, H., Willard-Gallo, K. A Simple and Rapid Protocol to Non-enzymatically Dissociate Fresh Human Tissues for the Analysis of Infiltrating Lymphocytes. J. Vis. Exp. (94), e52392, doi:10.3791/52392 (2014).

View Video