Abstract
Evnen af maligne celler til at unddrage sig immunsystemet, kendetegnet ved, tumorundvigelse fra både medfødte og adaptive immunrespons, er nu accepteret som et vigtigt kendetegn for cancer. Vores forskning i brystkræft fokuserer på den aktive rolle, tumorinfiltrerende lymfocytter spille i tumor progression og patient resultat. Mod dette mål, udviklede vi en metode til hurtig isolering af intakte lymfoide celler fra normale og unormale væv i et forsøg på at vurdere dem nærmest til deres oprindelige tilstand. Homogenater fremstillet ved hjælp af en mekanisk dissociator show både øget rentabilitet og celle opsving mens overfladen receptorekspression forhold til enzym-fordøjede væv bevares. Desuden har enzymatisk nedbrydning af det resterende uopløselige materiale ikke gendanne yderligere CD45 + celler indikerer, at kvantitative og kvalitative målinger i det primære homogenat sandsynligvis reelt afspejler infiltrerende delpopulationer i vævet Fragment. De lymfoide celler i disse homogenater kan let karakteriseres ved immunologiske (fænotype, proliferation, etc.) eller molekylær (DNA, RNA og / eller protein) nærmer sig. CD45 + celler kan også anvendes til subpopulation oprensning in vitro ekspansion eller kryopræservering. En yderligere fordel ved denne fremgangsmåde er, at den primære væv supernatanten fra homogenaterne kan anvendes til at karakterisere og sammenligne cytokiner, kemokiner, immunoglobuliner og antigener til stede i normale og maligne væv. Denne protokol fungerer særdeles godt for menneskerettighederne brystvæv og bør gælde for en lang række af normale og unormale væv.
Protocol
BEMÆRK: Alle enheder er anskaffet ved hjælp af en protokol, der er godkendt af Medical Ethics Committee for Institut Jules Bordet med skriftligt informeret samtykke opnået fra hver patient.
1. Fremstilling af vævshomogenat
- Dissekere resektion væv (maligne og normalt væv resekteret fra operationsstuen) er i patologi laboratorium af uddannet personale til øjeblikkelig afhentning. Tumor, NANT (taget længst afstand fra tumoren som muligt) og normale vævsfragmenter rutinemæssigt behandles inden for 1 - 3 timer for kirurgisk excision i en BSL2 laboratorium ved anvendelse af standard biosikkerhed procedurer for humane væv. Et rutediagram af protokollen er illustreret i figur 1.
- Alle vævsfragmenter (normal, Nant og tumor) veje og måle længde, bredde og højde (længde x bredde x højde). Dette er et vigtigt skridt for den efterfølgende normalisering af cellesubpopulationer, udvundet RNA, etc.
NOTE: Rækken af prøvestørrelse er 100 til 10.000 mm 3 med ingen fedt hvis det er muligt. - Indfotografere tumorfragment på en glasplade for H & E-farvning for at verificere, at vævet er faktisk en del af tumoren.
- Gør dette ved at trykke på et glas objektglas på tumorfragment og tilføre et let pres med fingrene i et par sekunder.
- Fastgør dias med isopropanol i 2 minutter efterfulgt af en vask skridt i vand. Kontrastfarve vævet i 30 sek med Mayers hematoxylin.
- Vask dias i seks bade vand. Farv i Phloxine B 2% i 15 sek.
- Vask i et bad af vand efterfulgt af fire bade isopropanol og slut af med et bad af vand.
- Der inkuberes i isopropanol i 1 min og afløb. Klart i to bade xylen.
- Monter med xylen baseret mounting medium. Undersøg for tumor cellularitet (figur 2).
BEMÆRK: Hovedsageligt, tumorceller holde sig til den prentet slide - det stromale, lymfoide eller adipose celler sjældent fortsat efterlader mellemrum mellem tumorceller (figur 2).
- Placer vævsfragment i en lille kultur skål indeholdende 1 ml kemisk defineret, serumfrit hæmatopoietisk celle medium (i det følgende benævnt medium) ved stuetemperatur og terninger det i små stykker (~ 1 - 2 mm 2) ved anvendelse af en steril skalpel.
- Overfør alt (vævsfragmenter + medium) til en mekanisk dissociator C rør.
- Skyl petriskål og skalpel med 2 ml medium ved anvendelse af en Pasteur-pipette og tilsæt dette til C røret (volumen af medium til dissociation = 3 ml).
- Brug den mekaniske dissociator program A.01 for C-rør (den mest skånsomme program) at homogenisere væv fragmenter i en enkelt celle suspension. Placer C røret i apparatet og køre programmet to gange i træk (en cyklus = 25 sek).
BEMÆRK: Denne homogenisering procedure er blevet etableret og valideret for brystvæv menneske, andre tumeller eller væv typer kan være nødvendigt at bruge et andet program, og bør testes først. - Fjern C røret fra apparatet og dekanteres homogenatet direkte ind i en 40 um cellefilter siddende på en 50 ml rør. Under anvendelse af samme Pasteur pipette som i trin 1.6, overføre væske tilbage i C røret til cellen si.
- Overfør den filtrerede væske i et 15 ml rør med en 1 ml mikropipettespids. Midlertidigt holde cellefilter og 50 ml rør.
- Skyl C rør med en yderligere 3 ml medium og overføre denne, igen ved hjælp af samme Pasteur pipette som i trin 1.6, til cellen si stadig siddende på 50 ml rør. Klem et maksimalt beløb af den resterende væske fanget i unhomogenized væv ind i 50 ml rør ved forsigtigt at flytte den rundt sien med en ren Pasteur-pipette eller 1 ml tip, der efterfølgende smidt væk for at undgå forurening af eluatet.
- Placer cellefilter hovedet på than oprindelige C rør og skylles med 3 ml medium, således at unhomogenized væv falder tilbage i C rør.
- Re-homogeniseres som i trin 1.7 i to cyklusser af A.01 programmet.
- Hæld denne anden homogenat gennem cellen si sad på 50 ml rør, skyl C rør igen med 3 ml medium (som i trin 1.10) og overføre med Pasteur-pipette til cellen si sad på 50 ml rør igen klemme en maksimal mængde af væske fra det resterende bindevæv fanget i cellen si.
- På dette tidspunkt, et volumen på ~ 2,5 ml i 15 ml rør og ~ 9 ml i 50 ml rør.
2. Separation af vævet supernatanten og celler
- Centrifuger homogenater i 15 ml og 50 ml rør i 15 minutter ved 600 xg ved stuetemperatur.
- Dekanteres SN fra 15 ml rør til et rent rør og midlertidigt opbevares ved 4 ° C. Denne supernatant = primær tumor, NANT eller normal TIssue SN (slutvolumen 2,5 ml) efterfølgende præciseret og i portioner før opbevaring ved -80 ° C til fremtidige analyser (se nedenfor).
- Supernatanten fra 50 ml rør.
- Forsigtigt resuspender begge cellepellets i et endeligt volumen på 1 ml medium. Kort fortalt først forsigtigt bryde cellepelleten i begge rør (ved at trykke røret på en hård overflade). Resuspender løs cellepellet i 50 ml med 500 pi medium og denne cellesuspension overføres til 15 ml røret for at resuspendere den anden pellet. Gentag dette trin én gang med den anden 500 pi medium for maksimal genvinding af celler.
- Transfer 10 pi af cellesuspensionen til et lille rør, blandes med 10 pi trypanblåt (fortynding 1: 1) og tælle antallet af levedygtige celler ved anvendelse af et hæmocytometer.
BEMÆRK: På dette tidspunkt en brøkdel af cellesuspensionen kan også analyseres ved flowcytometri for at evaluere cellestørrelse, granularitet og om ønsket et begrænset antal subpopulation markører for mere Precise vurdering af den relative celle fordeling i homogenatet før omfattende analyse eller eksperimenter. Alle analyser ved flowcytometri indarbejde CD45 mærkning af normalisering af subpopulationer. - Pelletere cellerne ved centrifugering ved 300 xg i 10 minutter ved stuetemperatur. Cellerne fra tumoren, NANT eller normalt væv er nu klar til yderligere oprensning eller analyse. Disse yderligere trin er bedst, når udført på samme dag som kirurgi.
BEMÆRK: flowcytometrisk analyse, men ikke cellesortering de resterende røde blodlegemer bør lyseres efter antistofmærkning ved tilsætning 0,4 ml røde blodlegemer lysepuffer til cellepelleten straks hvirvelbehandling i 1 sek og inkubere mindst 10 min ved stuetemperatur temperatur (beskyttet mod lys) før analysen.
3. Præcisering af Tissue Supernatant
- Centrifuger 1,5 ml rør med væv SN ved 15.000 xg i 15 minutter ved 4 ° C.
- Fjern forsigtigt than supernatant uden at røre eller forstyrre bundfaldet. Overførsel til et rent rør (eller rør) afhængigt af antallet og omfanget af alikvoter ønskede.
- Supernatanten opbevares ved -80 ° C til fremtidig brug.
4. Patient Blood
- Indsaml en blodprøve fra hver patient som en kontrol ved venepunktur i hepariniserede rør dagen før operation. Centrifugeres blodet ved 400 x g i 10 min ved 20 ºC med bremsen for at opnå plasma og en buffy coat.
- Fjern plasma og tydeliggøre det ved centrifugering ved 10.000 xg i 15 min ved 20 ºC. Alikvot og opbevares plasma ved -80 ° C til fremtidig brug. Fortynd fibrinlag i medium
- Adskil mononukleære celler ved anvendelse af standard Ficoll-Hypaque gradient centrifugering før øjeblikkelig analyse subpopulation isolation, DNA / RNA / protein udvinding eller kryopræservering.
5. Flowcytometri
- Label celler ifølge fremstillingenr anvisninger ved 4 ° C, beskyttet mod lys. Lyse røde blodlegemer i cellesuspensioner fra vævsfragmenter efter antistofmærkning ved tilsætning 0,4 ml celle lysis buffer til cellepelleten.
- Vortex straks i 1 sek og inkuberes mindst 10 minutter ved stuetemperatur, beskyttet mod lys. Pass de mærkede celler i et flowcytometer til datafangst uden vask.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Enzymatisk fordøjelse af vævsfragmenter med enten kommercielt tilgængelige væv dissociation opløsninger eller forskellige laboratorie blandinger af collagenase, DNase og / eller hyaluronidase-inhibitorer, spalte en lang række af receptorer på overfladen af celler. Vore studier, i første omgang fokuseret på CD4 + T-celler infiltrerer brysttumorer, blev hurtigt præsenteret med et stort teknisk problem på grund af spaltning af overflade- CD4-receptorer ved hjælp af standard enzymatisk fordøjelse protokoller 4-8. Vi testede forskellige collagenase enzymer med eller uden DNase og hyaluronidase-inhibitorer, fastslog, at collagenase I og II fjernes fuldstændigt CD4 fra celleoverfladen på trods af høj lymfocytlevedygtighed (figur 3A). En moderat virkning på CD4 blev observeret med collagenase IV med korte inkuberingstider (1 - 2 timer) med lavere CD4-antistof mærkning detekteret i fordøjet lymfeknude og tumorvæv sammenlignet med ufordøjet blod og knoglemarv fra den samme patient (Figur 3B; opmærksom på, at på grund af begrænsninger i vævet, vi modtager vi ikke kunne sammenligne fordøjet og ufordøjet lymfeknude og tumorvæv). Dette tab af CD4 blev bekræftet at være en teknisk biprodukt af collagenase IV fordøjelse ved at sammenligne ufordøjede og fordøjet CD4 + T-celler isoleret fra sundt donorblod (data ikke vist). Mens disse CD4 lo T-celler kan isoleres fra collagenase IV-fordøjet vævsfragmenter anvendelse af magnetiske perler, de oprensede populationer ofte indeholde varierende mængder af forurening med andre celler fra tumoren mikromiljø og dermed var suboptimal for vores eksperimentelle formål.
I en kontinuerlig søgen efter en bedre tilgang, vi i 2008 afprøvet en ny mekanisk dissociator uden brug af enzymer. Dette apparat fremstillet bryst vævshomogenater hurtigt og med overfladen receptor integritet opretholdes 9. Repræsentant flowcytometri dot plots af tumorcellen homogenater følgenfløj dissociation og mærkning med specifikke antistoffer mod epitelceller (EpCAM) og leukocytter (CD45) er vist i figur 3C. Disse billeder er typiske rutinemæssige observationer for bryst tumor homogenater. Denne protokol ændrer ikke signifikant levedygtigheden af CD45 + celler (4% døde celler); Men der er et betydeligt tab af levedygtige EpCAM + -celler (38% døde celler i tumoren vist; varierer mellem tumorer). På trods af dette tab kan levedygtig EpCAM + og CD45 + delmængder adskilles på grundlag af størrelse og struktur i store epitelceller (= tumorceller), små epitelceller og store CD45 + celler og lille CD45 + celler (de fleste celler , som er hovedsagelig lymfocytter; figur 3C).
Den væsentlige stigning i levedygtige CD45 + celler opnået ved hjælp af denne metode tillader køb af reproducerbar flerfarvet flowcytometri data (ved hjælp afop til ti farver) til mere fuldt ud at karakterisere de TIL-delmængder i brystkræft. Repræsentant flowcytometri dot plots af de store TIL-undergrupper er vist i figur 4, med vores nye forsøg viser, at det også er muligt at detektere og kvantificere mindre T- og B-celler delmængder infiltrere tumoren 10-12, herunder intracellulær farvning for kanoniske T og B-celle transskriptionsfaktorerne 12. Gating strategier for lymfocytter er baseret på levedygtige CD45 + celler identificeret med en levedygtighed plet (note:. Tumorer kan variere meget i mængden af cellerester og døde epitelceller afhængigt af BC subtype, klasse, osv). Denne fremgangsmåde er med succes blevet brugt til at rense lymfocytsubpopulationer fra homogenatet med magnetiske perler eller celle sortering til genekspression analyse ved hjælp af microarrays eller QRT-PCR 9. Opløselige mediatorer i SN, herunder cytokiner og immunglobuliner, er blevet kvantificeret ved hjælp af en bead- baseret immunassay med de resulterende data normaliseret til størrelsen af vævet fragment. En sammenligning af cytokinekspression (a Th1 / Th2 / Th7 / Th9 / Th17 pool) eller totale immunoglobuliner (IgA, IgE, IgG, IgM) i BC SN med SN fra normalt brystvæv afslører stigninger i både forbundet med tumorvæv (figur 5). Disse primære væv SN er også blevet effektivt analyseret for antigener 10-12 og anvendes til eksperimentelt at behandle lymfocytter fra raske donorer, hvorved gengiver TIL fænotype i normale celler 9.
Figur 1. Protokol flow chart. Vores procedure til behandling af friske humane væv og nogle analytiske tilgange, der efterfølgende kan anvendes til at vurdere lymfocytter infiltrerer humane væv er vist.
Figur 2. H & E farvet billede af et bryst tumorvæv aftryk. Dette aftryk, taget fra en frisk bryst tumorvæv fragment, viser tilstedeværelse af tumorceller med de åbne rum, der afspejler områder, der ikke blev overført. Klik her for at se en større version af dette tal.
. Figur 3. Optimering af brystvæv dissociation for lymfocyt analyse flowcytometrisk analyse af: (A) CD4 overflade-ekspression på lymfocytter fra ufordøjet og Collagenase I / II spaltet tumorvæv; (B) CD4-ekspression på lymfocytter fra lymfeknude og tumorvæv spaltet with Collagenase IV og sammenlignet med ufordøjet blod og knoglemarv-celler fra den samme patient; og (C) analyse af de samlede leukocytter (CD45 +) og epithelceller (EpCAM +) fra tumorvæv hurtigt dissocieret mekanisk ved anvendelse af protokollen beskrevet her. Levedygtighed epitelceller og CD45 + celler ved hjælp af vores protokol vurderes via inkorporeringen af fixable levedygtighed farvestof. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 4. tumorinfiltrerende lymfocytundergrupper i homogenat. Flerfarvet flowcytometrisk analyse blev udført på dagen for kirurgi efter mekanisk dissociering under anvendelse af protokollen beskrevet her. Den levedygtige celler og større lymfocytsubpopulationer enre vist: CD3 er en pan T-celle markør, CD4 og CD8 er store T celledelmængde markører og CD19 er et pan B-celle markør. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 5. Opløselige mediatorer i supernatanten. Et panel af cytokiner (Th1 / Th2 / Th7 / Th9 / Th17) og immunoglobuliner (IgA, IgE, IgG, IgM) blev vurderet ved anvendelse af perle-baserede immunanalyser til at analysere SN afledt fra normal og BC væv under anvendelse af protokollen beskrevet her.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne undersøgelse beskriver en optimeret fremgangsmåde til hurtig fremstilling af normale og maligne bryst vævshomogenater uden enzymatisk fordøjelse til efterfølgende cellesortering, ekstraktion, kryopræservering og / eller fænotypisk analyse af CD45 + subpopulationer. Målet med denne eksperimentelle fremgangsmåde er at producere billeder af TIL, der nøje afspejler deres in vivo tilstand og sammenligne dem med normale væv med minimal manipulation af væv frisk fra operationsstuen. Hidtil har vores laboratorium brugt denne protokol til at analysere> 250 friske BC væv (tumor og Nant),> 35 normale brystvæv fra brystkirtler reduktioner. I princippet bør denne protokol direkte anvendelse på andre tumorer eller vævstyper; Dog kan nogle optimering være nødvendig (dvs. den mekaniske dissociation program, antal cykler, media volumen, etc.). For væv med lav lymfocytinfiltration, ved hjælp af en større væv fragment kan være necessAry, hvilket er, hvad vi gør for normale væv, hvor lymfocyttal er lav. Alternativt kunne en densitetsgradientcentrifugering trin tilsættes for at berige leukocyt suspension. Denne analyse af humane T- og B-celle-subpopulationer infiltrerende brysttumorer omfatter en vurdering af> 100 markører ved flowcytometri (flowcytometri data for 74 markører er til rådighed i de supplerende data Gu-Trantien et al. 9), og oprensning af specifikke lymfocyt subpopulationer for efterfølgende immunologiske og molekylære analyser. Endvidere har vi vurderet cytokiner, kemokiner, immunoglobuliner og tumorantigener i den primære tumor SN (sammenlignet med NANT og normalt væv SN) 10,11 som en afspejling af disse molekylære mediatorer i tumormikromiljøet. Vi har også testet effekten af behandling perifere blodlymfocytter fra raske donorer med tumor SN og vist, at mange af genekspressionen ændringer detekteret i TIL specifikt kan gengives <sup> 9.
I deres mikromiljø er tumor og stromaceller mere stramt holdt i vævet matrix end de immunceller, som er karakteristisk vandrende. Den her beskrevne metode giver en enkel og hurtig måde til isolering og analyse TIL uden enzymatisk fordøjelse. Vores talrige forsøg på at deltage i denne mekaniske homogenisering tilgang med en kort enzymatisk nedbrydning til at producere levedygtige og receptor positiv lymfoide og epitelceller fra samme tumorfragment har været forgæves. Tissue homogenisering effektivt frigiver lymfocytter, men resulterer i et betydeligt tab af levedygtighed tumor celle. En kort enzymatisk fordøjelse af væv frigiver levedygtige tumorceller (det samlede antal øges som funktion af fordøjelsen tid), men har den konsekvens af en parallel reduktion i ekspressionen af mange overfladereceptorer, især tydelig på lymfocytter. Således for sammenlignende analyse af tumorceller og TIL fra samme tumeller det er stadig nødvendigt separat behandle to sekventielle tumorfragmenter.
I øjeblikket har de fleste undersøgelser har til formål at karakterisere TIL ansat enzymatiske fordøjelse (timer til O / N) ofte kombineret med en form for mekanisk dissektion 4-8. Udvidelse af TIL for yderligere analyse eller terapi generelt indebærer den efterfølgende ex vivo dyrkning af TIL eller tumor væv fragmenter med stimulerende midler (dage til uger) 13-15. Den hurtige, ikke-enzymatisk metode til væv dissociation beskrevet her giver en enkel og reproducerbare midler til udvinding intakt CD45 + celler med normal og unormal vævsfragmenter forud for deres ekspansion eller analyse. Denne hurtige erhvervelse af CD45 + celler fra patienter, der undergår tumorectomy kunne eventuelt udvikles til anvendelse i en prognostisk biomarkør assay. Desuden kan det give TIL med større potentiale for ex vivo ekspansion før adoptivforældre immunotherapy.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af tilskud fromthe belgiske fond for videnskabelig forskning (FNRS), Les Amis de l'Institut Bordet, FNRS bejde Télévie, Plan Cancer Belgien, Fonds Lambeau-Marteaux, Fonds JC Heuson og Fonds Barsy.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GentleMacs Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | BD Medimachine is somewhat equivalent |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf | or other standard table top centrifuge | |
| Centrifuge 5417 R | Eppendorf | or other standard microcentrifuge | |
| Esco Class II A2 Biosafety Cabinet | ESCO global | or other standard BSL2 hood | |
| Inverted Microscope | Nikon eclipse TS100 | or other microscope compatible for a hemacytometer | |
| Bürker Chamber | Marienfield | 640210 | or other standard hemacytometer |
| Navios Flow Cytometer | Beckman Coulter | or other flow cytometer (8-10 color recommended) | |
| GentleMacs C-Tube | Miltenyi Biotec | 130-096-344 | BD Medimachine uses Filcon |
| Cell Culture Dish | Sarstedt | 72,710 | or other non-pyrogenic plasticware |
| Disposable Scalpel | Swann-Morton | 0510 | or standard single use sterile scalpel |
| BD Cell Strainer 40 µm | Becton Dickinson | 734-0002 | or other non-pyrogenic plasticware |
| BD Falcon Tube 50 ml | Becton Dickinson | 352070 | or other non-pyrogenic plasticware |
| BD Falcon Tube 15 ml | Becton Dickinson | 352097 | or other non-pyrogenic plasticware |
| BD FACS Tube 5 ml | Becton Dickinson | 352008 | or other non-pyrogenic plasticware |
| Sterile Pasteur Pipette 5 ml | VWR | 612-1685 | or other non-pyrogenic plasticware |
| Microfuge Tube 1.5 ml | Eppendorf | 7805-00 | or other non-pyrogenic plasticware |
| X-Vivo 20 | Lonza | BE04-448Q | serum-free medium recommended |
| Phosphate buffered saline | Lonza | BE17-516F | standard physiological PBS |
| Trypan blue | VWR | 17942E | or other vital stain |
| VersaLyse | Beckman Coulter | A09777 | for flow cytometry experiments |
| Fixable viability Dye eFluor 780 | eBioscience | 65-0865-14 | for flow cytometry experiments |
| anti-CD3 FITC | BD Biosciences | 345763 | for flow cytometry experiments |
| anti-CD3 Vio Blue | Miltenyi Biotec | 130-094-363 | for flow cytometry experiments |
| anti-CD4 PE | BD Biosciences | 345769 | for flow cytometry experiments |
| anti-CD4 APC | Miltenyi Biotec | 130-091-232 | for flow cytometry experiments |
| anti-CD8 ECD | Beckman Coulter | 737659 | for flow cytometry experiments |
| anti-CD8 PerCP | BD Biosciences | 345774 | for flow cytometry experiments |
| anti-CD19 APC-Vio770 | Miltenyi Biotec | 130-096-643 | for flow cytometry experiments |
| anti-CD45 VioGreen | Miltenyi Biotec | 130-096-906 | for flow cytometry experiments |
References
- Chen, D. S., Mellman, I. Oncology meets immunology: the cancer-immunity cycle. Immunity. 39 (1), 1-10 (2013).
- Boudreau, A., van't Veer, J. L., Bissell, M. J. An 'elite hacker': breast tumors exploit the normal microenvironment program to instruct their progression and biological diversity. Cell Adh Migr. 6 (3), 236-248 (2012).
- Gajewski, T. F., Schreiber, H., Fu, Y. X. Innate and adaptive immune cells in the tumor microenvironment. Nat Immunol. 14 (10), 1014-1022 (2013).
- Quezada, S. A., et al. Limited tumor infiltration by activated T effector cells restricts the therapeutic activity of regulatory T cell depletion against established melanoma. J Exp Med. 205 (9), 2125-2138 (2008).
- Grange, C., et al. Phenotypic characterization and functional analysis of human tumor immune infiltration after mechanical and enzymatic disaggregation. J Immunol Methods. 372 (1-2), 119-126 (2011).
- McCauley, H. A., Guasch, G. Serial orthotopic transplantation of epithelial tumors in single-cell suspension. Methods Mol Biol. 1035, 231-245 (2013).
- Gros, A., et al. Myeloid cells obtained from the blood but not from the tumor can suppress T-cell proliferation in patients with melanoma. Clin Cancer Res. 18 (19), 5212-5223 (2012).
- Zirakzadeh, A. A., Marits, P., Sherif, A., Winqvist, O. Multiplex B cell characterization in blood, lymph nodes, and tumors from patients with malignancies. J Immunol. 190 (11), 5847-5855 (2013).
- Gu-Trantien, C., et al. CD4(+) follicular helper T cell infiltration predicts breast cancer survival. J Clin Invest. 123 (7), 2873-2892 (2013).
- Buisseret, L., et al. Lymphocytes Infiltrating Breast Cancer : Density, Composition And Organization. Annals of Oncology. 25 (1), 17 (2014).
- Garaud, S., et al. Characterization of B Cells Infiltrating Human Breast Cancer. Annals of Oncology. 25 (1), 18 (2014).
- Gu-Trantien, C., et al. Cxcl13-Producing Follicular Helper T Cells In Human Breast Cancer. Annals of Oncology. 25 (1), 17 (2014).
- Yee, C. The use of endogenous T cells for adoptive transfer. Immunol Rev. 257 (1), 250-263 (2014).
- Butler, M. O., et al. Ex vivo expansion of human CD8+ T cells using autologous CD4+ T cell help. PLoS One. 7 (1), 30229 (2012).
- Ye, Q., et al. Engineered artificial antigen presenting cells facilitate direct and efficient expansion of tumor infiltrating lymphocytes. J Transl Med. 9, 131 (2011).
