Abstract
Het vermogen van maligne cellen aan het immuunsysteem, gekenmerkt door tumor ontsnappen van zowel aangeboren en adaptieve immuunreacties ontwijken nu aanvaard als een belangrijk kenmerk van kanker. Ons onderzoek op borstkanker richt zich op de actieve rol die tumor-infiltrerende lymfocyten spelen in tumorprogressie en prognose van de patiënt. Naar dit doel hebben we een methode voor de snelle isolatie van intacte lymfoïde cellen van normale en abnormale weefsels in een poging om hen nabij hun natieve toestand te evalueren. Homogenaten bereid met een mechanische dissociator geven beide verhoogde levensvatbaarheid en cel herstel met behoud van oppervlakte receptor expressie in vergelijking met enzym-verteerd weefsels. Bovendien, enzymatische digestie van de overblijvende onoplosbare materiaal geen bijkomende CD45 + cellen aangeeft dat kwantitatieve en kwalitatieve metingen in de primaire homogenaat waarschijnlijke gezondheidstoestand van infiltrerende subpopulaties in het weefsel Fragm herstellenent. De lymfoïde cellen in deze homogenaten kunnen gemakkelijk worden gekarakteriseerd met behulp van immunologische (fenotype, proliferatie, etc.) en moleculaire (DNA, RNA en / of eiwit) nadert. CD45 + cellen kunnen ook worden gebruikt voor subpopulatie zuivering, in vitro uitbreiding of cryopreservatie. Een bijkomend voordeel van deze benadering is dat het primaire weefsel supernatant van de homogenaten worden gebruikt om te karakteriseren en te vergelijken cytokinen, chemokinen, immunoglobulinen en antigenen aanwezig in normale en maligne weefsels. Dit protocol functioneert uitstekend voor menselijk borstweefsel en dienen voor een breed scala van normale en abnormale weefsels.
Protocol
OPMERKING: Alle specimens verkregen werden met behulp van een protocol dat door de Medisch Ethische Commissie van het Instituut Jules Bordet goedgekeurd met schriftelijke toestemming verkregen van elke patiënt.
1. Bereiding van het weefselhomogenaat
- Ontleden gereseceerde weefsels (maligne en normaal weefsel weggesneden uit de operatiekamer) zijn in de pathologie lab door opgeleid personeel voor onmiddellijke pickup. Tumor, NANT (die het verst van de tumor mogelijk) en normaal weefsel fragmenten worden routinematig verwerkt binnen 1-3 uur van chirurgische excisie in een BSL2 laboratorium onder toepassing van standaard biologische veiligheid procedures voor menselijke weefsels. Een stroomschema van het protocol is geïllustreerd in figuur 1.
- Weeg alle weefselfragmenten (normaal, NANT en tumor) en meet de lengte, breedte en hoogte (lengte x breedte x hoogte). Dit is een belangrijke stap voor de verdere normalisatie van cel subpopulaties, geëxtraheerd RNA, etc.
NOTE: Het bereik van de steekproef is 100 tot 10.000 mm 3 met geen vet, indien mogelijk. - Imprint de tumor fragment op een glasplaatje voor H & E kleuring om te controleren of het weefsel is eigenlijk een deel van de tumor.
- Doe dit door het indrukken van een glazen microscoop dia op de tumor fragment en het toepassen van lichte druk met de vingers voor een paar seconden.
- Bevestig de dia met isopropanol gedurende 2 min gevolgd door een wasstap met water. Tegenkleuring het weefsel gedurende 30 seconden met Mayer's hematoxyline.
- Was de dia in zes baden van water. Vlekken in Phloxine B 2% gedurende 15 sec.
- Wassen in een bad van water, gevolgd door vier baden van isopropanol en afwerking met een bad van water.
- Incubeer in isopropanol gedurende 1 min en afvoer. Duidelijk in twee baden van xyleen.
- Monteer met xyleen op basis van montage medium. Onderzoek voor tumor cellulariteit (figuur 2).
OPMERKING: Hoofdzakelijk, tumorcellen vasthouden aan de bedrukte slide - de stromale, lymfoïde of adipose cellen zelden blijven, waardoor ruimten tussen de tumorcellen (figuur 2).
- Plaats het weefsel fragment in een kleine kweekschaal die 1 ml chemisch gedefinieerd serumvrij hematopoietische celmedium (hierna gemiddeld) bij kamertemperatuur en snijd het in kleine stukjes (~ 1-2 mm 2) met een steriele scalpel.
- Transfer alles (weefselfragmenten + gemiddeld) om een mechanische dissociator C buis.
- Spoel het petrischaaltje scalpel met 2 ml medium met behulp van een Pasteur pipet en voeg deze aan de C buis (volume medium voor dissociatie = 3 ml).
- Gebruik het mechanische dissociator programma A.01 voor C buizen (de meest zachtaardige programma) om het weefsel fragmenten homogeniseren in een enkele celsuspensie. Plaats de C buis in het apparaat en tweemaal start het programma in elkaar (een cyclus = 25 sec).
OPMERKING: Deze homogenisering procedure is vastgesteld en gevalideerd voor menselijke borstweefsel, andere tumof of weefsel typen kan nodig zijn om een ander programma te gebruiken en moet eerst worden getest. - Verwijder de C buis uit het apparaat en giet het homogenaat direct in een 40 micrometer cel zeef gezeten op een 50 ml buis. Met dezelfde Pasteur pipet als in stap 1.6, overdracht vloeistof die in de C buis naar cel zeef.
- Breng de gefilterde vloeistof in een buis van 15 ml met behulp van een 1 ml micropipet tip. Tijdelijk houden de cel zeef en haar 50 ml buis.
- Spoel de C buis met een extra 3 ml medium en breng dit opnieuw met dezelfde Pasteur pipet als in stap 1.6, de cel zeef nog gezeten op de 50 ml buis. Knijp een maximumbedrag van de resterende vloeistof opgesloten in de unhomogenized weefsel in de 50 ml buis door het voorzichtig bewegen rond de zeef met een schone Pasteur pipet of 1 ml tip die vervolgens wordt weggegooid om te voorkomen dat besmetting van het eluaat.
- Plaats de cel zeef ondersteboven op thij oorspronkelijk C buis en spoel met 3 ml medium zodat de unhomogenized weefsel valt terug in de C buis.
- Opnieuw homogeniseren zoals in stap 1.7 twee cycli van het A.01 programma.
- Giet deze tweede homogenaat door de cel zeef gezeten op de 50 ml tube, spoel de C buis opnieuw met 3 ml medium (zoals in stap 1.10) en breng met het Pasteur pipet om de cel zeef gezeten op de 50 ml buis weer knijpen een maximum hoeveelheid vloeistof uit de resterende bindweefsel opgesloten in de cel zeef.
- Op dit moment, een volume van ~ 2,5 ml in de 15 ml buis ~ 9 ml in de 50 ml buis.
2. Scheiding van de Tissue supernatant en Cellen
- Centrifugeer de homogenaten in de 15 ml en 50 ml buisjes gedurende 15 min bij 600 xg bij kamertemperatuur.
- Decanteer de SN van de 15 ml buis in een schone buis en tijdelijk bewaren bij 4 ° C. Dit supernatant = primaire tumor, NANT of normale tissue SN (eindvolume 2,5 ml) wordt vervolgens toegelicht en in porties verdeeld voor opslag bij -80 ° C voor latere analyse (zie hieronder).
- Verwijder het supernatant van de 50 ml buis.
- Voorzichtig mengen zowel celpellets in een eindvolume van 1 ml medium. In het kort, eerst voorzichtig breken de celpellet in beide buizen (de buis te tikken op een hard oppervlak). Resuspendeer de losse cel pellet in 50 ml met 500 pl medium en breng deze celsuspensie aan de 15 ml buis de tweede pellet te resuspenderen. Herhaal deze stap een keer met de tweede 500 ul medium voor een maximaal herstel van de cellen.
- Breng 10 pl van de celsuspensie aan een buisje, meng met 10 ui trypan blauw (verdunning 1: 1) en tel het aantal levensvatbare cellen met een hemocytometer.
OPMERKING: Op dit punt een fractie van de celsuspensie kan ook worden geanalyseerd door flow cytometrie celgrootte, granulariteit beoordelen en desgewenst een beperkt aantal subpopulatie markers voor meer precise evaluatie van de relatieve celverdeling in het homogenaat voor uitgebreide analyse en experimenten. Alle analyses door flowcytometrie nemen CD45 etikettering voor normalisering van de subpopulaties. - Pellet de cellen door centrifugatie bij 300 xg gedurende 10 min bij kamertemperatuur. De cellen van de tumor, NANT of normaal weefsel zijn nu klaar voor verdere zuivering of analyse. Deze extra stappen zijn best wanneer uitgevoerd op dezelfde dag als de operatie.
OPMERKING: Voor flowcytometrische analyse maar niet celsortering de resterende rode bloedcellen dienen na antilichaamidentificatie worden gelyseerd door toevoeging van 0,4 ml van rode bloedcellen lysisbuffer aan de celpellet, onmiddellijk vortexen 1 sec en het incuberen van ten minste 10 minuten bij kamertemperatuur temperatuur (beschermd tegen licht) voor de analyse.
3. Verduidelijking van de Tissue Supernatant
- Centrifugeer de buisjes van 1,5 ml met weefsel SN bij 15.000 xg gedurende 15 min bij 4 ° C.
- Verwijder voorzichtig tHij vloeistof zonder te raken of de pellet te verstoren. Over te dragen aan een schone buis (of buizen), afhankelijk van het aantal en de omvang van de porties gewenst.
- Bewaar het supernatant bij -80 ° C voor toekomstig gebruik.
4. Patiënt Blood
- Verzamel een bloedmonster uit elke patiënt een controle door venapunctie in gehepariniseerde buizen de dag vóór de operatie. Centrifugeer het bloed bij 400 xg gedurende 10 min bij 20 ° C met de rem van het plasma en een bufferlaag verkrijgen.
- Verwijder het plasma en verduidelijkt door centrifugatie bij 10.000 xg gedurende 15 min bij 20 ° C. Aliquot en bewaar plasma bij -80 ° C voor toekomstig gebruik. Verdun de buffy coat in middelgrote
- Scheid de mononucleaire cellen met behulp van standaard Ficoll-Hypaque centrifugatie voor onmiddellijke analyse subpopulatie isolatie, DNA / RNA / eiwit-extractie of cryopreservatie.
5. flowcytometrie
- Etiket cellen volgens de fabricageinstructies r's bij 4 ° C, beschermd tegen licht. Lyse rode bloedcellen in celsuspensies van weefselfragmenten na antilichaamidentificatie door toevoeging van 0,4 ml lysis buffer op de celpellet.
- Vortex onmiddellijk gedurende 1 seconde en incubeer ten minste 10 minuten bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht. Steek de gelabelde cellen in een flowcytometer voor gegevensverzameling zonder te wassen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Enzymatische digestie van weefsel fragmenten met hetzij commercieel verkrijgbaar weefsel dissociatie oplossingen of diverse laboratorium mengsels van collagenase, DNase en / of hyaluronidase remmers, splitsen diverse receptoren op het celoppervlak. Onze studies, richtte zich op CD4 + T-cellen infiltrerende borsttumoren, werden snel gepresenteerd met een groot technisch probleem door splitsing van het oppervlak CD4 receptoren middels standaard enzymatische digestie protocollen 4-8. We testten verschillende collagenase enzymen met of zonder DNase en hyaluronidase remmers, vinden dat collagenase I en II volledig verwijderd CD4 uit het celoppervlak ondanks hoge levensvatbaarheid van de lymfocyten (Figuur 3A). Een matig effect op CD4 waargenomen met collagenase IV met korte incubatietijden (1-2 uur) met lagere CD4 antilichaam labeling gedetecteerd gedigereerd lymfeklieren en tumorweefsel vergeleken onverteerd bloed en beenmerg van dezelfde patiënt (Figuur 3B; er rekening mee dat als gevolg van beperkingen op het weefsel die we ontvangen we waren niet in staat om te vergelijken verteerd en onverteerde lymfeklieren en tumorweefsel). Dit verlies van CD4 werd bevestigd technische bijproduct van collagenase IV digestie door vergelijking onverteerde en gedigereerd CD4 + T-cellen geïsoleerd uit gezonde donor bloed (gegevens niet getoond). Hoewel deze CD4 lo T-cellen kunnen worden geïsoleerd uit collagenase-IV gedigereerde weefselfragmenten via magnetische partikels, de gezuiverde populaties bevatten vaak wisselende hoeveelheden verontreinigende andere cellen van de tumor micro-omgeving en dus suboptimaal voor onze experimentele doeleinden.
In een voortdurend zoeken naar een betere aanpak, in 2008 hebben we een nieuwe mechanische dissociator getest zonder gebruik van enzymen. Deze inrichting geproduceerd borstweefsel homogenaten snel en oppervlakreceptor integriteit behouden 9. Representatieve flowcytometrie puntdiagrammen van de tumor celhomogenaten following dissociatie en labeling met specifieke antilichamen tegen epitheelcellen (EpCAM) en leukocyten (CD45) getoond in figuur 3C. Deze beelden zijn typisch routine observaties voor borsttumor homogenaten. Dit protocol niet significant de levensvatbaarheid van CD45 + cellen (4% dode cellen) te wijzigen; er is echter een aanzienlijk verlies van levensvatbare EpCAM + cellen (38% dode cellen in tumor getoond; varieert tumoren). Ondanks dit verlies kan de levensvatbare EpCAM + en CD45 + subsets worden gescheiden op basis van omvang en structuur in grote epitheelcellen (= tumorcellen), kleine epitheelcellen en grote CD45 + cellen en kleine CD45 + cellen (de meerderheid van de cellen , die hoofdzakelijk lymfocyten; Figuur 3C).
De aanzienlijke toename van levensvatbare CD45 + cellen verkregen met behulp van deze benadering maakt het verkrijgen van reproduceerbare multicolor flowcytometrie gegevens (mettot tien kleuren) de TIL subsets vollediger karakteriseren borstkanker. Representatieve flowcytometrie puntdiagrammen van grote TIL subsets zijn getoond in figuur 4, met onze recente experimenten aangetoond dat het ook mogelijk detecteren en kwantificeren kleine T- en B-cel populaties infiltreren de tumor 10-12, intracellulaire kleuring voor canonieke T en B-cel transcriptiefactoren 12. Gating strategieën lymfocyten gebaseerd zijn op levensvatbare CD45 + cellen geïdentificeerd met een levensvatbaarheid vlek (noot:. Tumoren kunnen zeer in de hoeveelheid cellulair afval en dode epitheelcellen naargelang de BC subtype, rang, enz variëren). Deze aanpak is met succes gebruikt om lymfocyt subpopulaties te zuiveren van het homogenaat met magnetische korrels of celsortering voor genexpressie analyse met microarrays of qRT-PCR 9. Oplosbare mediatoren in de SN, met inbegrip van cytokines en immunoglobulinen, zijn gekwantificeerd met behulp van een bead- immunoassay met de verkregen gegevens genormaliseerd tot de omvang van het weefsel fragment. Een vergelijking van cytokine-expressie (een Th1 / Th2 / Th7 / Th9 / Th17 zwembad) of totaal immunoglobulinen (IgA, IgE, IgG, IgM) in BC SN SN van normaal borstweefsel brengt verhoogde beide geassocieerd met de tumor tissue (Fig 5). Deze primaire weefsel SN zijn ook effectief geanalyseerd antigenen 10-12 en gebruikt voor experimenteel behandelen lymfocyten van gezonde donoren, waardoor de TIL fenotype in normale cellen 9 reproduceren.
Figuur 1. Protocol stroomschema. De procedure voor de behandeling van verse menselijke weefsels en sommige benaderingen die vervolgens kan worden gebruikt om lymfocyten infiltreren menselijke weefsels beoordelen getoond.
Figuur 2. H & E gekleurde beeld van een borst tumorweefsel opdruk. Deze afdruk, genomen uit een verse borsttumorweefsel fragment, toont de aanwezigheid van tumorcellen met de open ruimtes reflecterende gebieden die niet overgebracht werden. Klik hier om een grotere versie te bekijken van dit cijfer.
. Figuur 3. Optimalisatie van borstweefsel dissociatie van lymfocyten analyse Flow cytometrische analyse van: (A) CD4 oppervlakexpressie op lymfocyten van onverteerd en collagenase I / II gedigereerd tumorweefsel; (B) CD4 expressie op lymfocyten van lymfeklieren en tumorweefsel verteerd with collagenase IV en vergeleken met onverteerde bloed en beenmerg cellen van dezelfde patiënt; en (C) Analyse van totale leukocyten (CD45 +) en epitheelcellen (EpCAM +) tumorweefsel snel mechanisch gedissocieerd met het protocol beschreven. De levensvatbaarheid van epitheliale cellen en CD45 + cellen met behulp van ons protocol wordt beoordeeld via de incorporatie van fixable levensvatbaarheid kleurstof. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4. Tumor-infiltrerende lymfocyten in het homogenaat. Meerkleurig stroom cytometrische analyse werd uitgevoerd op de dag van de operatie na mechanische dissociatie volgens de hieronder beschreven protocol. De levensvatbare cellen en grote lymfocytensubpopulaties eenre getoond: CD3 is een pan-T-cel marker, CD4 en CD8 zijn belangrijke T-cel subgroep markers en CD19 is een pan B-cel marker. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 5. Oplosbare mediatoren in de supernatant. Een panel van cytokines (Th1 / Th2 / Th7 / Th9 / Th17) en immunoglobulinen (IgA, IgE, IgG, IgM) werden beoordeeld met behulp van bead based immunoassays analyseren SN afgeleid uit normale BC weefsels volgens de hieronder beschreven protocol.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Deze studie beschrijft een geoptimaliseerde werkwijze voor de snelle bereiding van normaal en kwaadaardig borstweefsel homogenaten zonder enzymatische digestie voor daaropvolgende celsortering, extractie, cryopreservatie en / of fenotypische analyse van CD45 + subpopulaties. Het doel van deze experimentele aanpak is om beelden van de TIL die nauw geven hun in vivo staat en ze te vergelijken met normale weefsels met een minimum aan manipulatie van de weefsels vers van de operatiekamer te produceren. Tot op heden heeft ons laboratorium dit protocol dat wordt gebruikt om te analyseren> 250 verse BC weefsels (tumor en NANT),> 35 normaal borstweefsel van mamma-reducties. In principe zou dit protocol rechtstreeks toepasbaar op andere tumor of weefsel types; Echter, sommige optimalisatie nodig zijn (dat wil zeggen de mechanische dissociatie programma, aantal cycli, media volume, etc.). Voor weefsels met een laag lymfocytinfiltratie, met behulp van een groter weefsel fragment kan necess zijnAry, dat is wat we doen voor normale weefsels waar het aantal lymfocyten is laag. Alternatief zou een dichtheidsgradiënt centrifugatie stap worden toegevoegd aan de leukocyten suspensie verrijken. Deze analyse van menselijke T- en B-cel subpopulaties infiltrerende borsttumoren omvat een evaluatie van> 100 merkers met stroomcytometrie (flow cytometrie data voor 74 markers is beschikbaar in de aanvullende gegevens van Gu-Trantien, et al. 9) en zuivering van specifieke lymfocyt subpopulaties voor daaropvolgende immunologische en moleculaire analyses. Verder hebben we cytokinen, chemokinen, immunoglobulinen en tumor antigenen in de primaire tumor SN geëvalueerd (tegenover NANT en normaal weefsel SN) 10,11 als weerspiegeling van deze moleculaire mediatoren in de tumor micro-omgeving. We hebben ook het effect getest van behandeling perifere bloed lymfocyten van gezonde donoren tumor SN en aangetoond dat veel van de genexpressie veranderingen gedetecteerd in de TIL specifiek kan worden gereproduceerd <sup> 9.
In hun micromilieu, worden de tumor en stromale cellen meer strak gehouden in de weefselmatrix dan de immuuncellen, die gekenmerkt migrerend zijn. De hier beschreven methode is een eenvoudige en snelle methode voor het isoleren en analyseren TIL zonder enzymatische digestie. Onze talrijke pogingen om deze mechanische homogenisatie-aanpak te bundelen met een korte enzymatische vertering om levensvatbare en receptor positieve lymfoïde en epitheliale cellen van dezelfde tumor fragment ongelijk zijn gesteld te produceren. Tissue homogenisering efficiënt releases lymfocyten maar resulteert in een aanzienlijk verlies van levensvatbaarheid van tumorcellen. Een korte enzymatische digestie van het weefsel vrijmaakt levensvatbare tumorcellen (het totale aantal toeneemt als functie van de spijsvertering tijd) maar is het gevolg van een parallelle afname van de expressie van vele oppervlakte receptoren, bijzonder duidelijk op lymfocyten. Aldus kan de vergelijkende analyse van tumorcellen en TIL van dezelfde tumof is het nog steeds nodig is om afzonderlijk te verwerken twee opeenvolgende tumorfragmenten.
Op dit moment hebben de meeste studies ontworpen om karakteriseren TIL enzymatische afbraak (uren tot O / N) vaak in combinatie met een vorm van mechanische dissectie 4-8 tewerkgesteld. Uitbreiding van de TIL voor verdere analyse of therapie gaat over het algemeen de volgende ex vivo kweken van TIL of tumorweefsel fragmenten met stimulerende middelen (dagen tot weken) 13-15. De snelle, niet-enzymatische methode voor weefsel dissociatie hier beschreven is, een eenvoudige en reproduceerbare wijze voor het extraheren intacte CD45 + cellen van normaal en abnormaal weefsel fragmenten vóór de uitbreiding of analyse. Deze snelle acquisitie van CD45 + cellen van patiënten die tumorectomy zou kunnen worden ontwikkeld voor een prognostische biomarker assay. Bovendien kan het TIL opleveren met meer mogelijkheden voor ex vivo expansie voor immunothe adoptieverapy.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door subsidies fromthe Belgisch Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek (FNRS), Les Amis de l'Institut Bordet, FNRS-Opération Televie, Plan Cancer van België, Fonds Lambeau-Marteaux, Fonds JC Heuson en Fonds Barsy.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GentleMacs Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | BD Medimachine is somewhat equivalent |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf | or other standard table top centrifuge | |
| Centrifuge 5417 R | Eppendorf | or other standard microcentrifuge | |
| Esco Class II A2 Biosafety Cabinet | ESCO global | or other standard BSL2 hood | |
| Inverted Microscope | Nikon eclipse TS100 | or other microscope compatible for a hemacytometer | |
| Bürker Chamber | Marienfield | 640210 | or other standard hemacytometer |
| Navios Flow Cytometer | Beckman Coulter | or other flow cytometer (8-10 color recommended) | |
| GentleMacs C-Tube | Miltenyi Biotec | 130-096-344 | BD Medimachine uses Filcon |
| Cell Culture Dish | Sarstedt | 72,710 | or other non-pyrogenic plasticware |
| Disposable Scalpel | Swann-Morton | 0510 | or standard single use sterile scalpel |
| BD Cell Strainer 40 µm | Becton Dickinson | 734-0002 | or other non-pyrogenic plasticware |
| BD Falcon Tube 50 ml | Becton Dickinson | 352070 | or other non-pyrogenic plasticware |
| BD Falcon Tube 15 ml | Becton Dickinson | 352097 | or other non-pyrogenic plasticware |
| BD FACS Tube 5 ml | Becton Dickinson | 352008 | or other non-pyrogenic plasticware |
| Sterile Pasteur Pipette 5 ml | VWR | 612-1685 | or other non-pyrogenic plasticware |
| Microfuge Tube 1.5 ml | Eppendorf | 7805-00 | or other non-pyrogenic plasticware |
| X-Vivo 20 | Lonza | BE04-448Q | serum-free medium recommended |
| Phosphate buffered saline | Lonza | BE17-516F | standard physiological PBS |
| Trypan blue | VWR | 17942E | or other vital stain |
| VersaLyse | Beckman Coulter | A09777 | for flow cytometry experiments |
| Fixable viability Dye eFluor 780 | eBioscience | 65-0865-14 | for flow cytometry experiments |
| anti-CD3 FITC | BD Biosciences | 345763 | for flow cytometry experiments |
| anti-CD3 Vio Blue | Miltenyi Biotec | 130-094-363 | for flow cytometry experiments |
| anti-CD4 PE | BD Biosciences | 345769 | for flow cytometry experiments |
| anti-CD4 APC | Miltenyi Biotec | 130-091-232 | for flow cytometry experiments |
| anti-CD8 ECD | Beckman Coulter | 737659 | for flow cytometry experiments |
| anti-CD8 PerCP | BD Biosciences | 345774 | for flow cytometry experiments |
| anti-CD19 APC-Vio770 | Miltenyi Biotec | 130-096-643 | for flow cytometry experiments |
| anti-CD45 VioGreen | Miltenyi Biotec | 130-096-906 | for flow cytometry experiments |
References
- Chen, D. S., Mellman, I. Oncology meets immunology: the cancer-immunity cycle. Immunity. 39 (1), 1-10 (2013).
- Boudreau, A., van't Veer, J. L., Bissell, M. J. An 'elite hacker': breast tumors exploit the normal microenvironment program to instruct their progression and biological diversity. Cell Adh Migr. 6 (3), 236-248 (2012).
- Gajewski, T. F., Schreiber, H., Fu, Y. X. Innate and adaptive immune cells in the tumor microenvironment. Nat Immunol. 14 (10), 1014-1022 (2013).
- Quezada, S. A., et al. Limited tumor infiltration by activated T effector cells restricts the therapeutic activity of regulatory T cell depletion against established melanoma. J Exp Med. 205 (9), 2125-2138 (2008).
- Grange, C., et al. Phenotypic characterization and functional analysis of human tumor immune infiltration after mechanical and enzymatic disaggregation. J Immunol Methods. 372 (1-2), 119-126 (2011).
- McCauley, H. A., Guasch, G. Serial orthotopic transplantation of epithelial tumors in single-cell suspension. Methods Mol Biol. 1035, 231-245 (2013).
- Gros, A., et al. Myeloid cells obtained from the blood but not from the tumor can suppress T-cell proliferation in patients with melanoma. Clin Cancer Res. 18 (19), 5212-5223 (2012).
- Zirakzadeh, A. A., Marits, P., Sherif, A., Winqvist, O. Multiplex B cell characterization in blood, lymph nodes, and tumors from patients with malignancies. J Immunol. 190 (11), 5847-5855 (2013).
- Gu-Trantien, C., et al. CD4(+) follicular helper T cell infiltration predicts breast cancer survival. J Clin Invest. 123 (7), 2873-2892 (2013).
- Buisseret, L., et al. Lymphocytes Infiltrating Breast Cancer : Density, Composition And Organization. Annals of Oncology. 25 (1), 17 (2014).
- Garaud, S., et al. Characterization of B Cells Infiltrating Human Breast Cancer. Annals of Oncology. 25 (1), 18 (2014).
- Gu-Trantien, C., et al. Cxcl13-Producing Follicular Helper T Cells In Human Breast Cancer. Annals of Oncology. 25 (1), 17 (2014).
- Yee, C. The use of endogenous T cells for adoptive transfer. Immunol Rev. 257 (1), 250-263 (2014).
- Butler, M. O., et al. Ex vivo expansion of human CD8+ T cells using autologous CD4+ T cell help. PLoS One. 7 (1), 30229 (2012).
- Ye, Q., et al. Engineered artificial antigen presenting cells facilitate direct and efficient expansion of tumor infiltrating lymphocytes. J Transl Med. 9, 131 (2011).
