Questo protocollo descrive la rapida dissociazione non enzimatica di frammenti di tessuto umano fresco per la valutazione qualitativa e quantitativa delle cellule CD45+ (linfociti/leucociti) presenti in vari tessuti umani normali e maligni. Inoltre, il surnatante ottenuto dall'omogenato del tessuto primario può essere raccolto e conservato per ulteriori analisi o sperimentazioni.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Un semplice e rapido protocollo non-enzimaticamente dissociare freschi tessuti umani per l'analisi di linfociti infiltranti
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
La capacità delle cellule maligne di eludere il sistema immunitario, caratterizzata dalla fuga del tumore da entrambe le risposte immunitarie innate e adattative, è ormai accettato come un importante segno distintivo di cancro. La nostra ricerca sul cancro al seno si concentra sul ruolo attivo che tumorali infiltranti linfociti svolgono nella progressione tumorale e outcome dei pazienti. Verso questo obiettivo, abbiamo sviluppato una metodologia per la rapida isolamento delle cellule linfoidi intatte dai tessuti normali e anormali nel tentativo di valutarli in prossimità al loro stato originario. Omogenati preparati utilizzando un dissociatore spettacolo meccanico sia aumentata la vitalità delle cellule e di recupero, mantenendo l'espressione del recettore di superficie rispetto tessuti enzima-digerite. Inoltre, la digestione enzimatica del materiale insolubile restante non ha recuperato CD45 + cellule supplementari indicano che le misurazioni quantitative e qualitative nella omogeneizzato primario probabile riflettano effettivamente sottopopolazioni infiltrano nel Fragm tessutient. Le cellule linfoidi in questi omogenati possono essere facilmente caratterizzata usando immunologica (fenotipo, proliferazione, etc.) o molecolare (DNA, RNA e / o proteine) approcci. Cellule CD45 + possono essere utilizzati anche per la purificazione sottopopolazione, l'espansione in vitro o crioconservazione. Un ulteriore vantaggio di questo approccio è che il supernatante tessuto primaria da omogenati può essere utilizzato per caratterizzare e confrontare citochine, chemochine, immunoglobuline e antigeni presenti in tessuti normali e maligni. Questa funzione di protocollo estremamente bene per i tessuti mammari umani e dovrebbero essere applicate a una vasta gamma di tessuti normali e anormali.
Introduzione
Il microambiente tumorale è composto da vari tipi di cellule con numerosi studi che dimostrano che ognuno di essi svolge un ruolo distinto e importante nella tumorigenesi1,2. Questi includono, ma non sono limitati a, cellule immunitarie infiltranti, cellule stromali, cellule endoteliali e cellule tumorali3. Studi ex vivo sui linfociti infiltranti il tumore (TIL; Le cellule CD45+ o leucociti, che sono prevalentemente linfociti nei tumori al seno) da campioni di tessuto umano fresco sono rese difficili dalla loro bassa frequenza, dalle piccole dimensioni dei campioni spesso disponibili per la ricerca e dalla potenziale perdita d....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
NOTA: Tutti i campioni sono stati acquisiti utilizzando un protocollo approvato dal Comitato Etico Medico dell'Istituto Jules Bordet con il consenso informato scritto ottenuto da ogni paziente.
1. Preparazione del tessuto omogenato
- Sezionare tessuti asportati (tessuto maligno e normale resezione dalla sala operatoria) sono nel laboratorio di patologia da personale qualificato per il ritiro immediato. Tumore, NANT (presa la distanza maggiore dal tumore possibile) e frammenti di tessuto normale sono comunemente trattati nell'ambito 1 - 3 ore di escissione chirurgica in un laboratorio BSL2 utilizzando le procedure di biosi....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
La digestione enzimatica di frammenti di tessuto sia con soluzioni disponibili in commercio dissociazione tessuto o varie miscele di laboratorio di collagenasi, DNasi e / o inibitori ialuronidasi, unirà un'ampia varietà di recettori presenti sulla superficie delle cellule. I nostri studi, inizialmente concentrati sulle cellule CD4 + T infiltranti i tumori al seno, sono stati rapidamente presentati con un grave problema tecnico dovuto alla scissione dei recettori CD4 superficie utilizzando enzimatici stand.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Questo studio descrive un metodo ottimizzato per la rapida preparazione di normali e maligne omogenati di tessuto mammario senza digestione enzimatica per la successiva separazione delle cellule, l'estrazione, la crioconservazione e / o l'analisi fenotipica di CD45 + sottopopolazioni. L'obiettivo di questo approccio sperimentale è quello di produrre immagini della TIL che riflettono strettamente il loro stato in vivo e confrontarle con tessuti normali con la manipolazione minima dei tessu.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori dichiarano che non esiste alcun conflitto di interessi.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni fromthe Fondo belga per la Ricerca Scientifica (FNRS), Les Amis de l'Institut Bordet, FNRS-Opération Télévie, Piano di cancro del Belgio, Fonds Lambeau-Marteaux, Fonds JC Heuson e Fonds Barsy.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| GentleMacs Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | BD Medimachine è in qualche modo equivalente |
| Centrifuga 5810 R | Eppendorf | o altra centrifuga da tavolo standard | |
| Centrifuga 5417 R | Eppendorf | o altra microcentrifuga standard | |
| Esco Classe II A2 Biosafety Cabinet | ESCO globale | o altra cappa | |
| BSL2 standardMicroscopio invertito | Nikon eclipse TS100 | o altro microscopio compatibile per un emacitometro | |
| Bü Camera di | Marienfield | 640210 | o altro ematocitometro standard |
| Citometro a flusso Navios | Beckman Coulter | o altro citometro a flusso (8-10 colori consigliati) | |
| GentleMacs C-Tube | Miltenyi Biotec | 130-096-344 | BD Medimachine utilizza Filcon |
| Cell Culture Dish | Sarstedt | 72.710 | o altri materiali plastici non pirogeni |
| Bisturi monouso | Swann-Morton | 0510 | o bisturi sterile monouso standard |
| BD Cell Strainer 40 & micro; m | Becton Dickinson | 734-0002 | o altra plastica apirogena |
| BD Falcon Tube 50 ml | Becton Dickinson | 352070 | o altra plastica apirogena |
| BD Falcon Tube 15 ml | Becton Dickinson | 352097 | o altra plastica apirogena |
| BD FACS Tube 5 ml | Becton Dickinson | 352008 | o altra plastica apirogena |
| Sterile Pasteur Pipetta 5 ml | VWR | 612-1685 | o altra plastica apirogena |
| Tubo per microfuga 1,5 ml | Eppendorf | 7805-00 | o altra plastica apirogena |
| X-Vivo 20 | Lonza | BE04-448Q | terreno privo di siero consigliato |
| Soluzione salina tamponata con fosfato | Lonza | BE17-516F | fisiologico standard PBS |
| Blu di tripano | VWR | 17942E | o altra macchia vitale |
| VersaLyse | Beckman Coulter | A09777 | per esperimenti di citometria a flusso |
| Fattibilità fissabile Colorante eFluor 780 | eBioscience | 65-0865-14 | per esperimenti di citometria a flusso |
| anti-CD3 FITC | BD Biosciences | 345763 | per esperimenti di citometria a flusso |
| anti-CD3 Vio Blue | Miltenyi Biotec | 130-094-363 | per esperimenti |
| di citometria a flussoanti-CD4 PE | BD Biosciences | 345769 | per esperimenti di citometria a flusso |
| anti-CD4 APC | Miltenyi Biotec | 130-091-232 | per esperimenti di citometria |
| a flusso anti-CD8 ECD | Beckman Coulter | 737659 | per esperimenti di citometria a flusso |
| anti-CD8 PerCP | BD Biosciences | 345774 | per esperimenti di citometria a flusso |
| anti-CD19 APC-Vio770 | Miltenyi Biotec | 130-096-643 | per esperimenti di citometria a flusso |
| anti-CD45 VioGreen | Miltenyi Biotec | 130-096-906 | per esperimenti di citometria a flusso |
Riferimenti
- Chen, D. S., Mellman, I. Oncology meets immunology: the cancer-immunity cycle. Immunity. 39 (1), 1-10 (2013).
- Boudreau, A., van't Veer, J. L., Bissell, M. J. An 'elite hacker': breast tumors exploit the normal microenvironment pr....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
