Protocol
NOTA: Tutti i metodi indicati in questo protocollo sono stati approvati dalla cura degli animali e uso Comitato Istituzionale.
1. Preparazione del tavolo operatorio
- Impostare il pad di riscaldamento con ricircolo acqua calda sul tavolo operatorio, al microscopio dissezione. Posizionare la piastra di base in acciaio inox sul pad di riscaldamento. Posizionare un tampone assorbente sterile sulla piastra di base e piastra elettrica.
- Disporre di strumenti chirurgici sterili su un tampone assorbente sterile adiacente. Raccogliere due coppie di angolari pinza a punta fine, due paia di pinze ad angolo, tre pinze emostatiche, due fili divaricatori, piccole forbici chirurgiche, micro-forbici, una angioplastica filo (diametro 0,15 pollici) e tre segmenti da 6 pollici di sutura 6.0 seta .
- Piegare l'estremità rotonda del filo angioplastica per abbinare la curvatura dell'arteria femorale. In questo modo sarà più facile per far avanzare il filo durante l'intervento chirurgico.
2. Preparazione diMouse for Surgery
- Anestetizzare un mouse per inalazione continua di 2,5% isoflurano. Assicuratevi di monitorare lo stato dell'animale durante tutta la procedura. Eseguire un test pizzico di piede del mouse per confermare che è completamente anestetizzato. Assicurarsi che l'animale non si muove quando il test pinch viene somministrato.
- Applicare una pomata lubrificante per gli occhi dell'animale per prevenire l'essiccamento. Fissare l'animale in posizione supina al tampone assorbente con del nastro chirurgico. Continuare la somministrazione 2,5% isoflurano via cono.
- Usando una crema depilatoria, rimuovere la pelliccia dalla gamba e addome per la linea mediana. Sciacquare bene la pelle con acqua. Depilazione può essere eseguito un giorno prima dell'intervento. Si noti che il trattamento eccessivo con la crema può provocare irritazione della pelle.
- Immediatamente prima dell'intervento chirurgico, applicare iodopovidone alla zona depilata con un applicatore con punta di cotone per sterilizzare la pelle. Sciacquare la pelle depilata con il 70% di etanolo e seccocon un applicatore con punta di cotone sterile. Ripetere 3 volte.
- Somministrare una dose pre-operatoria di 5 mg / kg di carprofen tramite iniezione sottocutanea.
3. Isolamento dell'arteria femorale
- Utilizzando piccole forbici chirurgiche, fare una incisione curva in pelle sopra l'arteria femorale. Senza mezzi termini sezionare e fissare tessuti circostanti con divaricatori fissatori riavvolgitore magnetica per individuare l'arteria femorale. Inumidire i tessuti periodicamente con soluzione salina per l'irrigazione Applicare salina con un cotton fioc sterili.
- Isolare l'arteria femorale con pinze. Separare delicatamente il nervo dal fascio vascolare con pinze dalla punta sottile. Evitare di pungere la vena, e non danneggiare il nervo. Spingere il nervo lontano dal fascio per evitare di stimolare esso.
- Separare delicatamente la vena femorale dalla arteria femorale, localizzare la biforcazione femorale. La regione della biforcazione è particolarmente difficile da sezionare.
- Posterior alla biforcazione, ciclo di sutura 6.0 seta sotto l'arteria femorale e sicuro con una pinza emostatica. Questo sutura prossimale verrà utilizzato per limitare il flusso sanguigno nell'arteria.
NOTA: C'è una leggera variazione dei legami quando si esegue il metodo di legatura rispetto al metodo di cauterizzazione (vedi Figura 1 e Figura 2). - Distale alla biforcazione, ciclo 6.0 sutura di seta sotto l'arteria femorale e sicuro con una pinza emostatica. Questo distali aiuti sutura nel posizionamento dell'arteria.
- Loop due punti di sutura sotto il ramo muscolare dell'arteria femorale, li pre-cravatta e sicuro con una pinza emostatica. Ricordarsi di bagnare i tessuti con soluzione fisiologica. Se si esegue il metodo cauterizzazione di lesioni filo, solo un sutura in loop è necessario sul ramo muscolare.
4. Prestazioni di dall'arteria femorale Wire Injury
- Limitare il flusso sanguigno nell'arteria femorale tirando la sutura prossimale. Leggermente tirare il hemost distalein e hemostat garantire il ramo per esporre il sito per il arteriotomia. Legare il ramo muscolare legando la sutura intorno ad esso.
NOTA: Sollevamento l'arteria verso l'alto in modo più efficace limitare il flusso di sangue che tirare da solo in senso orizzontale. - Sever il piccolo ramo con la cauterizzazione tra i due punti di sutura. Utilizzando micro-forbici, eseguire un arteriotomia nel ramo laterale della biforcazione. Utilizzare pinze in equilibrio su un rotolo di nastro adesivo chirurgico per stabilizzare le micro-forbici.
- Confermare la presenza della arteriotomia usando pinze dalla punta sottile. Sollevare delicatamente l'apertura del arteriotomia con le pinze. Introdurre l'estremità arrotondata del filo nel arteriotomia con pinze. Per facilitare l'avanzamento del filo, aggiungere uno o due gocce di lidocaina alla regione con una siringa.
- Quando il filo raggiunge la sutura prossimale, rilasciare la sutura e regolare in modo che esso non può impedire l'avanzamento del filo. Inserire il filo fino a quando non può avanzare ulteriormente. La punta di the filo dovrebbe fermarsi nella regione del legamento inguinale.
- Lasciare che il filo di rimanere in arteria femorale per un minuto. Dopo un minuto, retrarre e far avanzare il filo in un movimento di taglio dieci volte di ferire e spogliare l'endotelio dell'arteria femorale. Per una lesione di minore gravità, diminuire il numero di volte che il filo è tirato dentro e fuori l'arteria o lasciare il filo nell'arteria solo per 1 min.
- Ritrarre il filo lentamente. Quando l'estremità arrotondata del filo ha superato la sutura prossimale, limitare il flusso nell'arteria tirando la sutura prossimale. Rientrare completamente il filo.
5. legatura Branch Muscular
- Stringere la sutura rimanente sul ramo muscolare. Questo consentirà di evitare il sanguinamento dal arteriotomia. Flusso di ritorno al ramo muscolare, e confermare che il sangue non perde da esso. Tagliare le estremità delle suture sul ramo muscolare.
6. Metodo alternativo: localizzato Cauzazione del arteriotomia
NOTA: Un approccio alternativo può essere presa per evitare la legatura del ramo muscolare e consentire l'accesso vascolare attraverso il principale grande arteria femorale.
- Partendo da 4.1, per limitare il flusso femorale tirando sutura prossimale. Estrarre la sutura distale e la sutura fissaggio leggermente ramo muscolare per esporre il sito per l'arteriotomia (Figura 1 e Figura 2).
- Utilizzando micro-forbici, eseguire un arteriotomia al punto di diramazione dell'arteria femorale e il ramo muscolare. Se l'incisione viene effettuata nel lato dell'arteria, può essere più facile per cauterizzare. Utilizzare pinze in equilibrio su un rotolo di nastro adesivo chirurgico per stabilizzare le micro-forbici.
- Per verificare il successo di cauterizzazione, ripristinare il flusso per l'arteria femorale allentando la sutura prossimale. Se l'emorragia si verifica dal arteriotomia, ripetere la cauterizzazione. Se la cauterizzazione ha successo, il flusso di sangue sarà rimemorizzata distale al arteriotomia.
- Introdurre il filo ed eseguire il pregiudizio filo come descritto nella sezione 4.
- Continuare limitando il flusso di sangue nell'arteria femorale. Scaldare una cauterizzazione a punta fine almeno 6 centimetri di distanza dal mouse. Come la punta cauterizzazione raffredda, applicare leggermente i lati della arteriotomia per chiudere l'incisione.
- Per verificare il successo di cauterizzazione, ripristinare il flusso per l'arteria femorale allentando la sutura prossimale. Se l'emorragia si verifica dal arteriotomia, ripetere la cauterizzazione. Se la cauterizzazione è successo, il flusso di sangue verrà ripristinato distale al arteriotomia. Rimuovere il prossimale temporanea e legami distali.
7. L'impianto di Perivascolare Drug Delivery Patch
- Creare un cerotto farmaco perivascolare può essere creato come descritto in precedenti studi 11 o utilizzando metodi simili. Blunt angoli della regione di barriera della patch drug delivery usando forbici sterili
- Posizionare il pat consegna della drogach sopra l'arteria femorale feriti con il lato di rilascio farmaco rivolto l'arteria. Se necessario, utilizzare pinze per migliorare la posizione della patch.
8. ferita Chiusura e recupero
- Chiudere la ferita con una semplice sutura interrotta composto da nodi quadrati. Una sutura discontinua prolunga chiusura della ferita in caso l'animale cerca di rimuovere la sutura.
- Spegnere l'anestesia e rimuovere l'animale dal set up. Lasciare che l'animale di recuperare sul pad riscaldamento.
- Continuare a monitorare il recupero del mouse. Controllare il sito di incisione ogni giorno per garantire che rimanga chiuso. Per il trattamento del dolore post-operatorio, somministrare una iniezione sottocutanea di 5 mg / kg di carprofen ogni 12 ore dopo l'intervento chirurgico e poi ogni 12 ore per 2 giorni. Se il dolore continua oltre i primi 2 giorni, consultare un veterinario per le indicazioni su ulteriori antidolorifici.
9. raccolta femorale arterie di Istologia
- A 28 giorni post-operatorio, effettuare anidride carbonica l'eutanasia sul mouse.
NOTA: La portata appropriata di anidride carbonica dovrebbe sostituire 10-30% della camera per minuto e varierà a seconda delle dimensioni della camera utilizzata. Taglio del diaframma e puntura cardiaca dovrebbe essere eseguita come metodo secondario dell'eutanasia. - Fissare il mouse in posizione supina con del nastro chirurgico. Praticare un'incisione sopra l'arteria femorale, dove è stata fatta l'incisione chirurgica iniziale.
- Per entrambi l'arteria feriti e l'arteria illeso dalla gamba controlaterale, senza mezzi termini sezionare e fissare i tessuti con divaricatori e fissatori riavvolgitore magnetici per individuare l'arteria femorale circostante. Inumidire i tessuti periodicamente con soluzione salina per l'irrigazione. Applicare soluzione salina con un cotton fioc sterili. Fare attenzione a non danneggiare l'arteria.
- Dopo l'arteria femorale è stato isolato dal sito di arteriotomia originale dell'aorta addominale, legare un segzione di sutura di seta nei pressi del sito originale del arteriotomia. Questo sutura identificare la fine più distale dell'arteria femorale e facilitare la manipolazione del campione.
- Utilizzando le forbici micro-dissezione di asportare l'arteria femorale. Effettuare una incisione distale alla sutura. Effettuare l'altro un'incisione sull'estremità opposta dell'arteria femorale, accanto dell'aorta addominale.
- Trasferire l'arteria asportato ad una piastra di Petri di vetro contenente soluzione fisiologica. Sezionare l'arteria più per rimuovere il tessuto connettivo in eccesso o di grasso. Rimuovere delicatamente il sangue dal lume risciacquando con soluzione salina.
- Trasferire l'arteria di un flaconcino da 10% formalina tamponata. Conservare il flacone a 4 ° C con una leggera oscillazione per 48 ore.
- Trasferire l'arteria fissato al 70% di etanolo, per memorizzare fino alla trasformazione per l'istologia.
- Incorpora l'arteria in blocchi di paraffina e la sezione dei blocchi per la colorazione.
- Eseguire colorazione istochimica e immunochimico per valutare l'entità del danno e intimale hyperplasia.
NOTA: Per i risultati rappresentativi, abbiamo usato ematossilina e eosina di visualizzare i nuclei e la morfologia generale o macchia Pentachrome di un Movat per visualizzare le lamelle elastiche e altri componenti arteriose.
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Representative Results
A seguito di infortunio filo, iperplasia neointimale si sviluppa nel tempo e in genere viene esaminata dopo 14 a 28 giorni. Le tecniche descritte in questo cavo lavoro robusta generazione di iperplasia intimale nei topi come mostrato risultati istologici della Figura 3. Un femorale indenne dimostreranno intatta lamelle elastiche e spessore normale e la circonferenza. Una arteria femorale infortunato mostrerà iperplasia intimale, degradato lamelle elastiche e dimostrare nuovamente endotelizzazione in momenti successivi. Re-endotelizzazione viene ultimato in circa 21 giorni, ma questo dipende dal ceppo di topi utilizzati di fondo e può essere valutata mediante immunoistochimica per markers endoteliali in sezioni o, preferibilmente, misurati su en preparati viso utilizzando un colorante blu del Evan, microscopia elettronica a scansione o immunocolorazione con microscopia confocale su en preparazioni faccia dell'arteria. 17,18 per la quantificazione di iperplasia intimale essoè meglio misurare l'area intimale o il rapporto intimale-to-media a tre siti lungo l'arteria lesa per tenere conto di eventuali variazioni lungo la lunghezza della regione lesa dell'arteria.
Figura 1: fotografie delle fasi critiche dei due metodi per lesioni filo nell'arteria femorale Un confronto delle fasi del metodo di legatura (superiore) al metodo cauterizzazione (inferiore) per eseguire lesioni fili.. Nel metodo di legatura, i due punti di sutura che fissano il ramo muscolare sono pre-legati in modo che possano essere strette per legare il ramo muscolare. La distale più dei due punti di sutura filiali muscolari è serrato. L'inserimento arteriotomia e filo vengono eseguite nel ramo muscolare. Dopo aver eseguito l'infortunio, la sutura rimanente sul ramo muscolare è serrato e tagliato. Nel metodo cauterizzazione, solo uno suture è in loop sotto il ramo muscolare. Il arteriotomia e l'inserimento del filo vengono eseguite al punto di diramazione del ramo muscolare dalla arteria femorale. Dopo aver eseguito l'infortunio, l'incisione è cauterizzato senza legatura o l'arteria femorale o ramo muscolare. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2: superiori fotografie ingrandimento dei punti critici delle due tecniche per le lesioni filo confronto Close-up della procedura relativa al metodo di legatura (in alto) per il metodo di cauterizzazione (in basso).. La posizione del arteriotomia è delimitata con la linea tratteggiata. Clicca qui per vedere una versione più grande di questofigura.
Figura 3:. I risultati istologici rappresentativi di lesioni filo 14 giorni dopo la procedura istologico delle sezioni arterie sono state colorate con ematossilina e eosina (in alto) e pentachrome colorazione di Movat (in basso). Etichettato nell'immagine sono il lume (L), intima (I) e lamina elastica (EL).
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Straight spring wire, 0.15” diameter | Cook | G02426 | |
| High Temperature cautery | Bovie Medical Corp. | HIT1 | |
| High-temperature fine tip for cautery | Bovie Medical Corp. | H101 | |
| Micro-scissors | Fine Science Tools | 15000-13 | For performance of arteriotomy |
| Angled fine-tipped forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | For blunt dissection of vascular bundle |
| Angled forceps | Roboz | RS-5069 | For clearing tissues |
| Surgical scissors | Roboz | RS-5840 | For cutting skin |
| Retractor | Fine Science Tools | 18200-10 | |
| Retractor wire | Fine Science Tools | 18200-05 | Attached to retractor |
| Base plate | Fine Science Tools | 18200-03 | For use with retractor |
| Magnetic retractor fixator | Fine Science Tools | 18200-01 | |
| Needle Holder | Roboz | RS-7822 | |
| Hemostatic forceps | Biomedical Research Instruments, Inc. | 34-1000 | |
| Dissecting microscope | Meiji Techno | EMZ-5TR | |
| Microscope light source | Meiji Techno | FT191 | |
| Warm water recirculator | Gaymar | TP-500 | For maintaining mouse body temperature |
| Reusable heating pad | Gaymar | TP-R 22G | For maintaining mouse body temperature |
| Lidocaine | Various | ||
| 4.0 Vicryl suture with half circle needle | Ethicon | J494G | For post-surgical wound closure |
| Sterile cotton-tipped applicators | Puritan | 25-806-2WC | For application of depilatory cream and absorbing fluids |
| Depilatory cream | Nair | ||
| Isoflurane | Various | ||
| Betadine | Various | ||
| 70% ethanol | Various | ||
| 6.0 braided silk suture | Teleflex Medical | 4-S | For isolation of femoral artery during surgery |
| 0.9% sodium chloride | Various | For irrigating tissues | |
| Gel eye lubricant | Various | ||
| Glass Petri dish | Pyrex | 3160-60 | For femoral artery harvest |
| 10% buffered formalin | Various | For fixation of femoral artery | |
| 70% ethanol | Various | For fixation of femoral artery | |
| Bouin's fluid | Electron Microscopy Sciences | For Movat's Pentachrome staining | |
| Alcian blue, 1% | Electron Microscopy Sciences | 26385-01 | For Movat's Pentachrome staining |
| Alkaline alcohol | Electron Microscopy Sciences | 26385-02 | For Movat's Pentachrome staining |
| Orcein, 0.2% | Electron Microscopy Sciences | 26385-03 | For Movat's Pentachrome staining |
| Hematoxylin alcoholic, 5% | Electron Microscopy Sciences | 26385-04 | For Movat's Pentachrome staining |
| Ferric chloride, 10% | Electron Microscopy Sciences | 26385-05 | For Movat's Pentachrome staining |
| Lugol's Iodine | Electron Microscopy Sciences | 26385-06 | For Movat's Pentachrome staining |
| Woodstain scarlet-acid fuchsin working solution | Electron Microscopy Sciences | 26385-07 | For Movat's Pentachrome staining |
| Acetic acid, 0.5% | Electron Microscopy Sciences | Various | For Movat's Pentachrome staining |
| Phosphotungstic acid, 5% | Electron Microscopy Sciences | 26385-09 | For Movat's Pentachrome staining |
| Alcoholic saffron, 6% | Electron Microscopy Sciences | 26385-10 | For Movat's Pentachrome staining |
References
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