Protocol
Все животные были обработаны в соответствии с Национальными Институтами Здоровья принципов. Уход и использование комитета животных в университете штата Алабама в Бирмингеме одобрил использование животных.
1. Получение РНК и ДНК из обогащенной астроцитов населения с помощью флуоресцентного Активированный сортировки клеток (FACS) астроцитов из полного ткани головного мозга
- Седативный животное с CO 2 в течение 1 мин и затем быстро обезглавить. Проанализируйте кору, как описано в Альбукерке и др, 26. это не является необходимым для удаления оболочки мозга.
Примечание: Трансгенные крысы, выражающие EGFP под S100β (астроцитов маркер) промотор были порождены Итакура др 27 и используется для FACS сортировки астроцитов.. - Подготовьте всю гомогената мозга с использованием папаин комплект диссоциации в нестерильных условиях в соответствии с протоколом производителя. Тепло активировать папаин при 37 ° С на водяной бане в течение 10 мин. Примечание:Папаин решение обеспечивается производителем и содержит L-цистеин и ЭДТА (см таблицу материалов).
- Вырезать или Dremel отверстие в верхней части 50 мл коническую пробирку, чтобы трубка проведении 95% O 2: 5% СО 2 должен быть подан в закрытом коническую пробирку (фиг.1А). Поместите расчлененные кору в 10мм блюдо культуры, содержащие диссоциации СМИ (MEM с добавлением 20 мМ глюкозы и пенициллин / стрептомицин (500 ед / мл) и уравновешенной до 95% O 2: 5% СО 2) и использовать чистую лезвие рубить ткани в 1 х 1 мм 2 шт.
- Передача ткани с помощью 10 мл эксплуатации Pipetman 50 мл коническую трубку содержащих папаин решение. Разрешить ткани оседают на дне пипетки перед сбросом, чтобы минимизировать количество диссоциации СМИ, перенесенные. Держите папаин решение, уравновешенной 95% O 2: 5% CO 2 через поверхность теплообмена газа в течение всего срока инкубации. Не пузырь папаин Solutiна. Выдержите ткани в течение 20 мин в 37 ° С на водяной бане.
- После инкубации в растворе папаина, растирают ткани в 10 раз с 10 мл пипетки в медленной скорости. Центрифуга подвески облачно клеток при 1000 мкг в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Равновесие ДНКазы / раствор альбумина ингибитор (предоставляется изготовителем) через поверхность теплообмена газа и повторно приостанавливать осажденные клетки в 3 мл ДНКазы альбумина ингибитор / раствор. Подготовка коммерческих градиент разрывной плотностью, следуя инструкциям производителя.
- Спин градиент разрывной плотностью в 1000 мкг в течение 6 мин. Изолировать диссоциированных клеток из нижней части трубки всасывания нижнюю гранул с помощью пипетки.
- Повторное приостановить диссоциированных клеток в 2-3 мл DPBS с 0,02% альбумина бычьей сыворотки и 1 мг / мл ДНКазы или предпочтительных HEPES буферных культуральные среды. Пройдите через 40 мкм фильтр, перед FACS (2А). Держите клетки на льду до сортировки.
- Выполните FACS 28. </ LI>
- Гранул клетки в 1,5 мл центрифужные пробирки при 2000 х г в течение 5 мин при 4 ° С.
Примечание: осаждали астроциты могут быть использованы немедленно или не хранится в -80 ° С до выделения ДНК.
- Извлечение РНК и ДНК, используя предпочитаемый метод изоляции 29 30. Оценка РНК и ДНК концентрации и качества с помощью спектрофотометра и Bioanalyzer 31.
Примечание: Используйте только высокое качество РНК и ДНК в последующих шагов, 260/280 = 2,0-2,2 и 1,8-1,9 соответственно. Анализ Bioanalyzer важно оценить для деградации РНК или ДНК фрагментации. РНК или ДНК может быть использована немедленно или хранить в -80 ° С или -20 ° С, соответственно, для последующих исследований.
2. Оценка состояния метилирования ДНК гена с использованием Метилирование чувствительных высокого разрешения расплава анализа (MS-HRMA)
- Введите гена последовательность интерес в привилегированные программного обеспечения онлайн отображения метилирование выявить любые островов CpG в генеинтерес 32.
- Дизайн праймеров против бисульфит преобразуются последовательность ДНК 33 и усиливать с помощью предпочтительного ДНК-полимеразы в соответствии с протоколом производителя. Проверка усиленный размер продукта путем запуска 1% агарозном геле ДНК при 100 V в течение 45 мин. Хранить грунтовки при концентрации запас 20 мкм, -20 ° С.
- Бисульфит преобразовать 500-1000 нг ДНК каждого образца и метилированной ДНК, начиная от стандартов 0-100% из тех же видов животных 34. Образцы элюирования, чтобы обеспечить концентрацию 20 нг / мкл. Проверьте концентрацию бисульфита преобразованного ДНК с помощью спектрофотометра 31.
- Настройка 20 мкл реакции для MS-HRM амплификации с использованием предпочтительного ДНК-полимеразы и праймеров в концентрации 5 мкМ в соответствии с таблицей 1 и 2. Выполнить все образцы, включая FACS ДНК и метилированных стандартов, в трех экземплярах.
- В зависимости от программного обеспечения для анализа, установить до и после запуска и остановки параметрывокруг переходов кривой плавления. Набор предварительно расплава начала и до расплава параметры остановки, так что разница между ними составляет 0,2 - 0,5 ° С. Установите после расплава начало и пост-расплава остановить аналогично. Экстракт пиковые разница температур данные для каждого образца.
- Использование процентов метилированных стандартов (Y-значение) и соответствующие им средние различия пиковой температуры (X-значение) генерировать уравнение линейной регрессии (3А-В, Таблица 3-4). Используйте этот линейное уравнение регрессии для оценки статуса метилирования неизвестных образцов 35.
3. Оценка Hyper-метилированных Promoter активность с помощью использования Пробирной люциферазы
- Определить CpG островки гена-мишени (этап 2.1). ПЦР-амплификации представляющих интерес областей 36 и клона вверх по течению от luc2 люциферазы светляков гена-репортера, чтобы произвести CpG-островков luc2 плазмиды 37.
- Линеаризуем 30 мкг CpG-островков luc2 плазмиды через ограничениеФермент пищеварение 38. Проверьте сайты рестрикции дайджеста и избегать двойных сокращений, используя предпочтительный резака программное обеспечение 38. Тепло-инактивации ферментов на соответствующем температуре и продолжительности следующие пищеварение в соответствии с протоколом производителя. Минимальная потеря ДНК происходит во время стадии линеаризации.
- Метилировать линеаризованные плазмиды с использованием CpG-метилазы (M.Sssl) O / N на 30 ° C или оставить необработанной следующее производителя протокол для следующих корректировок кроме.
- Выполните 50 мкл реакции.
- Используйте 5 единиц CpG метилазой метилировать 700 нг линеаризованной плазмиды.
- Запуск реакции O / N для 13-19 часов.
- После CpG реакции метилазой, выполните очистку ДНК с использованием стандартных, коммерчески доступны силикагель мембраны очистить комплект в соответствии с протоколом производителя. Значительные потери ДНК происходят следующие CpG метилазой реакцию, потеря 30-60%.
- Убедитесь, метилирование плазмид с помощью ограничения Хпа II дайджеста. Принимать по 1 мкг метилированного или не метилированной ДНК и переваривают с ограничением Хпа II в течение 1 часа при 37 ° С. Используйте 5-10 единиц Хпа II для каждого мкг ДНК. После Хпа II пищеварения, выполните очистку ДНК с использованием предпочтительного, в продаже силикагель мембраны очистить комплект. Выполнить обе CpG метилированных и не метилированные плазмиды на 1% геле агарозы ДНК в ТАЕ буфере TBE или на 100 В в течение 45 мин для визуализации (фиг.4В).
- Тема и метилированных и не-метилированных плазмид двойного расщепления с соответствующими ферментами рестрикции, чтобы освободить полнометражный Люк 2 (вектор) и CpG острова (вставка) Фрагменты 38. Выполните двойной пищеварения O / N в соответствующей температуре и тепло инактивации ферментов после расщепления в соответствии с протоколом производителя. Минимальная потеря концентрации ДНК происходит во время двойного ограничения дайджеста.
- Запустите двойным усваивается плазмиды на 1% агарозном геле ДНК при 100 V в течение 1 часа, чтобы позволить разделения ое вектор и вставьте (рис 4C). Внимание. Ношение защитной UV маску, гель разместить ДНК на столе черном свете, чтобы визуализировать полос. На основании размера, акцизного метиловым и не денатурированного вставкой и без метилированным вектора, используя чистую хирургическую лезвие.
- Гель экстракт ДНК, используя насыщенный фенол, рН 6,6. Вкратце, весят гель, содержащий ДНК вектора или вставки. Использование 100 мкл фенола на 0,1 г геля ДНК. Перемешать гель ДНК в фенол с помощью стекло Dounce гомогенизатора.
- Добавить хлороформ (используя 1/5 объема фенола) и встряхните образцов в течение 20 сек. Инкубируйте образцы при комнатной температуре в течение 2-3 мин. Центрифуга течение 15 мин при максимальной скорости (16,1 х 1000 х г) при 4 ° С.
- Удалить водный раствор и добавить объем 0.1x 3 м ацетата натрия и 2.5X объема этанола. Инкубируйте образцы в течение 1 ч при -80 ° С. После инкубации удаления этанола и повторно приостанавливать ДНК в 30 мкл буфера предпочтительной. Значительные потери ДНК происходит следующее изоляции вставками и векторы, 30-50% вотпесчаники
- Re-перевязывать метилированных и не метилированных вставками в не-метилированных вектор с помощью ДНК-лигазы Т4 38. Используйте соотношение 1: 4 вектора для вставки на лигирования реакций. Реакция установки в соответствии с инструкциями производителя. Использование общего объема 50 мкл для реакций и инкубируют O / N при -20 ° С или на льду с крышкой над ведро льда.
- После перевязки, выполните очистку ДНК с использованием предпочтительного, в продаже силикагель мембраны очистить комплект. Значительные потери происходят ДНК после лигирования реакции, приблизительное потери ДНК 30-50%. Проверка повторного лигирования, запустив на 1% агарозном геле ДНК при 100 V в течение 45 мин и оценить концентрацию повторно лигировали плазмид (рис 4D).
- Трансфекции метилированные или не метилированных плазмид в D54 клеток с использованием коммерческой реагента для трансфекции в соответствии с протоколом производителя. Семенной D54 клеток на 12-луночный планшет при 0,14 × 10 6 клеток / лунку.
- После 24 часов, трансфекции клеток Wiго равные концентрации либо (1) не-CpG-methyated luc2 плазмиды + Renilla или другого вектора управления люциферазы или (2) метилированного CpG-luc2 плазмиды + Renilla или другого вектора управления люциферазы.
- Разрешить клетки для трансфекции в течение 24 часов перед проведением анализа двойную люциферазы. Выполните анализ в соответствии с инструкциями производителя. Выполните показания, используя люминометра. Читайте каждую лунку в трех экземплярах.
- Рассчитать соотношение активности люциферазы Firefly, чтобы Renilla или другой контроль активности люциферазы. Нормализовать метилированное Светлячок: управления активности люциферазы к не-метилированных Firefly: управления активности люциферазы путем деления метилированное активность люциферазы не-денатурированного активности люциферазы
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Обогащенный население астроцитов была приобретена с помощью FACS сортировки EGFP-S100β трансгенных животных 27. В связи с ухудшением качества клеток и молекулярных молекул, выделенных из животных старше послеродовой день 50 (p50), животных в возрасте р0-р40 являются оптимальными для подобных экспериментов. Кортикальной тканью был использован для этих экспериментов. Коры от двух до шести животных были объединены вместе. FACS была выполнена в ЗАО Комплексный проточной цитометрии основной комплекс. Сортировка была выполнена на Becton Dickinson FACSAria II. возбуждения EGFP получали с использованием 488 нм лазера; компенсация не было необходимости. Закрытого населения была направлена на основе вперед и боковое рассеивание (1В). Живая клетка население определяется с помощью этидия бромид индикатор мертвых клеток и закрытого (рис 1С). Два различных популяций наблюдались на основе профиля EGFP (рис 1D). Через эмпирического тестирования, клеточной популяции с высокой EGFPПрофиль был идентифицирован как EGFP-положительных клеточной популяции (фиг 1F-F ''). Визуальный анализ второго населения с низким профилем EGFP показал клеточные фрагменты, выражающие EGFP, но лишены ядер, вероятно, представляющий мусор из астроцитов процессов (рис 1G-G ''). Типичные изображения диссоциированных EGFP положительных астроцитов следующие диссоциации, но до сортировки (рисунок 2А) и после сортировки (2В), показаны. Изолированные EGFP позитивных клеток население продемонстрировало увеличение 40-кратное ALDH1L1 мРНК, в астроцитов специфического маркера 39 (рис 2С). Кроме того, несмотря на общий экспрессии S100β в NG2 + OPCs и астроцитов 39, мы наблюдали 4-кратное уменьшение NG2 мРНК, маркера клеток-предшественников олигодендроцитов 39, что указывает на выделение обогащенного астроцитов клеточной популяции (фиг.2С-D). РНКи ДНК, выделенная из FACS отсортированы астроциты были достаточно высокого качества и количества, которые будут использоваться для последующих исследований метилирования. Всего РНК и ДНК, выделенная из различных возрастов и количества животных перечислена в качестве эталона для ожидаемой доходности молекулярных молекул следующей FACS (таблица 5). Следует отметить, что выход будет также изменяться в зависимости от количества животных, используемых, инкубационного периода, и опыт исследователя. Таблица 6 демонстрирует изменчивость событий приобрела в зависимости от количества животных, используемых и инкубационного периода.
Для метилирования исследований, начиная с высоким качеством и в достаточном количестве ДНК имеет важное значение для успешных последующих применений. Для обеспечения достаточного лизис ткани для РНК или ДНК добычи, все гомогенизации ткани или клеток последовало используя 23G игла 7x, заботясь, чтобы избежать вспенивания во время лизиса растиранием. После того, как высокое качество ДНК извлекается и бисульфит конвертироватьред области интереса могут быть направлены для MS-HRMA. Следует отметить, что при оценке качества и концентрации бисульфита преобразованного ДНК, спектрофотометр должен быть установлен, чтобы читать на фактор OD 33, как бисульфит преобразуются ДНК одноцепочечной. В 260/280 значения бисульфита преобразованного ДНК колебался от 2.20-2.70.
Перед началом исследования метилирования, важно, чтобы надлежащим образом выбрать и калибровки термоциклер для исследований МС-HRMA. Кроме того, необходимо определить, как экспортировать и использовать исходные данные, полученные от MS-HRMA. Applied Biosystems Высокое разрешение плавления Руководство по началу работы были использованы для оказания помощи в калибровке термоциклер 7900HT. Наконец, данные извлекаются и импортирован в программное обеспечение для анализа HRM для последующего анализа данных. Как указано в протоколе, до и после пуска и остановки параметры расположен недалеко от переходов кривой плавления. Пик температурные различия были использованы для экстраполяции статус метилирования неизвестного SAmples. Оценочные данные, полученные от метилирования MS-HRMA близко соответствовали данным метилирования, полученных от пиросеквенирования (данные Пиросеквенирование был создан в доме с использованием праймеров, направленные же регионы, как MS-HRM праймеров) (3С) 15.
Двойной люциферазы анализа был использован для оценки транскрипционной активности гипер-метилированных регионах интерес ген (фиг.4А). Каждый CpG-островков luc2 плазмида линеаризованной а затем метилированы. Тем не менее, так как и вставка (CpG острова) и вектор (luc2) метилированы в ходе реакции, необходимо вырезать метилированную вставку и повторно лигируют к не-метилированных вектора. Благодаря обширной манипуляции плазмиды, возникают значительные потери и необходимо начать с достаточной исходного материала. HpaII пищеварения была использована для проверки статуса метилирования каждой плазмиды, как HpaII только переваривает без метилированную ДНК (фиг.4В). Следует отметить, чтоЕсли O / N метилирование недостаточно, дополнительно 1x Сэма и 1x из CpG метилазой могут быть добавлены следующие 1 ч инкубации при 30 ° С. Продолжить O / N инкубации после добавления дополнительного SAM и CpG метилазой. Генерация метиловым и не денатурированного CpG-остров-luc2 плазмиды позволяет прямой оценки изменений между метилирование ДНК и транскрипционной активности через измерения активности люциферазы.
Рисунок 1. FACS сортировки изолирует EGFP + клеток popoulation. (А) Использование 50 мл коническую трубку с вырезанное отверстие на верхней позволяет для обмена поверхности газа во папаином. (B) Сортировка клетки закрытого основываясь на передней и боковой разброс участков. (С) этидийбромида основе индикатора мертвых клеток был использован для ворот живой клеточной популяции (красный). (D) Живая челл население продемонстрировали две популяции - один с высоким профилем EGFP (зеленый) и низким профилем EGFP (фиолетовый). Для всех графиков, у-ось представляет область рассеяния на стороне (SSC-A); X-ось представляет передней области боковое рассеивание (FSC-A), зеленый флуоресцентный белок область (GFP-а) или бромидом этидия (EtBr). (EG) Диссоциированные клетки инкубировали с Hoechst и 20 мкл диссоциированных клеток помещали на покровное и отображаемого. (EE '') EGFP + астроциты, с обширными процессов были визуализированы до сортировки (NS). (FF '') После сортировки, высокая EGFP + населения (POS) демонстрируют EGFP + клеток, которые сому ко-локализуются с окрашиванием Hoechst. (GG '') населения низкий EGFP показывает EGFP + окрашивание, не ко-локализуются с окрашиванием Hoechst, вероятно, представляющий астроцитов мусора (для всех изображений, масштаб = 20 мкм). Пожалуйста,Нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2. FACS сортировки EGFP-S100 бета трансгенных животных обеспечивает обогащенный население астроцитов. (А) 20 мкл диссоциированных клеток перед FACS (NS) показаны процессы остаются нетронутыми (масштаб = 50 мкм). (B), представитель изображение после FACS (FACS) клеток будут показаны; астроцитарные процессы удалены и сотовый Сома остатки (масштаб = 20 мкм). Данных (С) КПЦР демонстрирует 40-кратное увеличение ALDH1L1 мРНК в FACS-отсортированных клеток (FACS) по сравнению с не отсортировано населения (NS). (D), NG2 мРНК снижается в 4 раза в FACS отсортированных клеток по сравнению с не отсортировано населения (NS). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3. Пример данных и анализ для MS-HRM исследований. (A) Пример разность температур участков, полученных от стандартов метилирования. Корреспондент процентов метилирования помечены для каждой кривой (Б) Пример уравнения линейной регрессии, генерируемого из крыс метилированы стандартам. (С) Сравнение процентов метилирования, полученной из пиросеквенирования (pyroseq, зеленые полосы) и MS-HRMA (серые столбики) демонстрирует аналогичные уровни метилирования для различных регионов KCNJ10. Данные Пиросеквенирование генерируемые в доме, используя праймеры, направленные же регионы, как MS-HRM Анализ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4. Двойное люциферазы анализ позволяет для оценки транскрипционной активности дифференциально метилированных генов регионов. (А) Схема люциферазы транскрипции анализе активности демонстрирует рабочий процесс протокола. (B), гель ДНК показывает различия в метилированным по сравнению с не-метилированных плазмид следующие HpaII пищеварения. Номера для метилированной ДНК легко усваивается после HpaII пищеварения по сравнению с метилированной ДНК, демонстрируя успешное метилирование ДНК плазмиды. (С) гель ДНК демонстрирует разделение вектора от вставки следующий двойной пищеварения. После разделения ДНК, вектора и вставки являются гель извлекается. (D), гель ДНК демонстрирует успешное повторное лигирование вектора и вставки. Повторное лигировали плазмиду обладает аналогичными молекулярную массу, необработанной плазмиды (untx). М., не встретилhylated; М, метилированным; RL, повторно лигируют; untx, лечить. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| , | Объем (мкл) | х3 + 10% избыток | х # образцов |
| MeltDoc ММ | 10 мкл | 33 мкл | |
| Грунтовка 1 | 1.2 мкл | 3.96 мкл | |
| Праймер 2 | 1.2 мкл | 3.96 мкл | |
| гДНК | 1 мкл | --- | |
| дН 2 0 | 6.6 мкл | 21.78 мкл |
Таблица 1. Пример расчета MeltDoctor Mastermix. Запустите каждый МС-HRM Reaие в трех повторах с 10% избытком компенсировать ошибки пипетирования. Последняя колонка показывает расчет, необходимую для нескольких номеров образцов. Общий объем для каждой реакции 20 мкл.
| Цикл | Температура (° С) | Время (сек) | Градиент скорости (%) |
| 95 ° С | : 15 | 100 | |
| 40x | 95 ° С | : 15 | 100 |
| 60 ° С | : 60 | 100 | |
| Параметры плавления | 95 ° С | : 10 | 100 |
| 60 ° С | : 60 | 100 | |
| 95 ° С | : 15 | 1 | |
| 60 ° С | : 15 | 100 | |
| Держать | 4 76 С |
Таблица 2:. Пример протокола для усиления денатурации образцов при 95 ° С в течение 10 мин с последующими 40 циклами амплификации и генерации кривой плавления. Параметры плавления приведены в таблице. Примечание изменения в рампе скоростью, что позволяет на приобретение высокотемпературной разрешение плавления.
| Процент Метилирование (Крыса Стандарт) | Пик разница температур |
| Y | Икс |
| 0 | 5.670116 |
| 5 | 10,70448 |
| 10 | 15,5044 |
| 25 | 25,52295 |
| 50 | 34,43047 |
| 75 | 43,80894 |
| 100 | 53,88717 |
| Пик температуры разница | Расчетное метилирование |
| Икс | Y |
| Пример 1 (N = 4) | |
| 47,450 | 81,115 |
| 46,292 | 78,657 |
| 41,694 | 68,894 |
| 47,292 | 80,779 |
| Пример 2 (N = 4) | |
| 29,925 | 43,904 |
| 24,269 | 31,894 |
| 25,061 | 33,575 |
| 25,389 | 34,272 |
Таблица 4. Пример вычисленной предполагаемой процентов метилирования. Разница пиковая температура образцов неизвестного статуса метилирования используется для оценки процентного метилирование с использованием линейного уравнения регрессии. Представительства данные из двух различных условиях, образец 1 и образец 2, будут показаны; N = 4 для каждого условия.
| Возраст | Количество животных | Всего РНК (нг) | Всего ДНК (нг) |
| P4-P10 | 3-6 | 455-868 | 265-1523 |
| P19-P22 | 1-2 | 220-680 | 583-1483 |
| P40-P50 | 3-4 | 198-260 | 578-1700 |
Таблица 5. Общая РНК и ДНК получены из FACS отсортированы клетки. Возраст и количество животных, используемых в FACS эксперименты в списке. Обратите внимание, что оба коры были использованы для каждой Н. Общая РНК и ДНК в списке в качестве эталона для ожидаемой доходности.
| Возраст | Количество животных | Pos События | Neg События | Время инкубации (при 37 ° С) |
| p26 | 1 | 2.18X10 ^ 6 | 1.15X10 ^ 6 | 20:00 мин |
| p26 | 2 | 4.4X10 ^ 6 | 2.78X10 ^ 6 | 20:00 мин |
| p26 | 2 | 9.2X10 ^ 6 | 3.3X10 ^ 6 | 30:00 мин |
Таблица 6. Количество событий, полученных из FACS на послеродовой день 26. На p26 ряд положительных (+) EGFP событий и негативных событий варьируется в зависимости от количества животных, используемых и инкубационного периода.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical Corporation | LK003150 | |
| AllPrep DNA/RNA Mini Kit | Qiagen | 80204 | |
| Methyl Primer | Applied Biosystems | online | software to localize CpG Islands |
| EZ DNA methylation Kit | Zymo Research | D5001 | |
| Rat Premixed Calibration Standard | EpiGenDx | 80-8060R-Premix | |
| CpG Methylase (M.Sssl) | Zymo Research | E2010 | |
| QIAquick Gel Extraction | QIagen | 28704 | Used for gel extraction and DNA cleanup |
| Restriction enzymes | New England BioLabs | ||
| NEB cutter | New England BioLabs | online | verify restriction digest sites |
| Dual Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1910 | |
| Luc2 vector, pGL4.10 | Promega | E6651 | |
| renilla vector, pGL4.74 | Promega | E2241 | |
| TD-20/20 Luminometer | Turner Designs | ||
| Lipofectamine LTX and Plus Reagent | Life Technologies | A12621 | |
| Phenol, saturated pH 6.6/6.9 | Fisher Scientific | BP 17501-100 | |
| Nanodrop 2000/2000c Spectrophtometer | ThermoScientific | ||
| MeltDoctor Master Mix | Life Technologies | 4415440 | |
| High Resolution Melt (HRM) Software v2.0 | Life Technologies | 4397808 | |
| AB SDS software v2.3 | Life Technologies | online | |
| AB High Resolution Melting Getting Started Guide | Life Technologies | online | |
| AB 7900HT Fast Real-Time System | Life Technologies |
References
- Bird, A. DNA methylation patterns and epigenetic memory. Genes Dev. 16 (1), 6-21 (2002).
- Deaton, A. M., Bird, A. CpG islands and the regulation of transcription. Genes Dev. 25, 1010-1022 (2011).
- Lorincz, M. C., Dickerson, D. R., Schmitt, M. Intragenic DNA methylation alters chromatin structure and elongation efficiency in mammalian cells. Nat Struct. Mol Biol. 11 (11), 1068-1075 (2004).
- Moore, L. D., Le, T. DNA methylation and its basic function. Neuropsychopharmacol. 38, 23-38 (2013).
- Santos, K. F., Mazzola, T. N. The prima donna of epigenetics: the regulation of gene expression by DNA methylation. Braz.J.Med.Biol.Res. 38 (10), 1531-1541 (2005).
- Day, J. J., Sweatt, J. D. Cognitive neuroepigenetics: a role for epigenetic mechanisms in learning and memory. Neurobiol. Learn.Mem. 96, 2-12 (2011).
- Denk, F., McMahon, S. B. Chronic pain: emerging evidence for the involvement of epigenetics. Neuron. 73, 435-444 (2012).
- Endres, M., et al. DNA methyltransferase contributes to delayed ischemic brain injury. J. Neuroscience. 20 (9), 3175-3181 (2000).
- Qureshi, I. A., Mehler, M. F. Emerging role of epigenetics in stroke: part 1: DNA methylation and chromatin modifications. Arch.Neurol. 67, 1316-1322 (2010).
- Tian, R., et al. disease mutant glial fibrillary acidic protein compromises glutamate transport in astrocytes. J Neuropathol. Exp Neurol. 69, 335-345 (2010).
- Perisic, T., Holsboer, F., Rein, T. The CpG island shore of the GLT-1 gene acts as a methylation-sensitive enhancer. Glia. 60 (9), 1345-1355 (2012).
- Olsen, M. L., Higashimori, H., Campbell, S. L., Hablitz, J. J. Functional expression of Kir4.1 channels in spinal cord astrocytes. Glia. 53 (5), 516-528 (2006).
- Poopalasundaram, S., et al. Glial heterogeneity in expression of the inwardly rectifying K+ channel, Kir4.1, in adult rat CNS. Glia. 30, 362-372 (2000).
- Hibino, H., Fujita, A., Iwai, K., Yamada, M. Differential assembly of inwardly rectifying K+ channel subunits. Kir4.1 and Kir5.1, in brain astrocytes. 279, 44065-44073 (2004).
- Nwaobi, S. E., Lin, E., Peramsetty, S. R. DNA methylation functions as a critical regulator of Kir4.1 expression during CNS development. Glia. 62 (3), 411-427 (2014).
- Li, L., Head, V. Identification of an inward rectifier potassium channel gene expressed in mouse cortical astrocytes. Glia. 33, 57-71 (2001).
- Kucheryavykh, Y. V., et al. Downregulation of Kir4.1 inward rectifying potassium channel subunits by RNAi impairs potassium transfer and glutamate uptake by cultured cortical astrocytes. Glia. 55 (3), 274-281 (2007).
- Djukic, B., Casper, K. B., Philpot, B. D., Chin, L. S. Conditional knock-out of Kir4.1 leads to glial membrane depolarization, inhibition of potassium and glutamate uptake, and enhanced short-term synaptic potentiation. J. Neuroscience. 27, 11354-11365 (2007).
- Fujita, A., et al. Clustering of Kir4.1 at specialized compartments of the lateral membrane in ependymal cells of rat brain. Cell Tissue Res. 359 (2), 627-634 (2015).
- MacFarlane, S. N., Sontheimer, H. Electrophysiological changes that accompany reactive gliosis in vitro. J Neuroscience. 17 (19), 7316-7329 (1997).
- Ambrosio, R., Maris, D. O., Grady, M. S., Winn, H. R. Impaired K(+) homeostasis and altered electrophysiological properties of post-traumatic hippocampal glia. J. Neuroscience. 19 (18), 8152-8162 (1999).
- Anderova, M., et al. Voltage-dependent potassium currents in hypertrophied rat astrocytes after a cortical stab wound. Glia. 48 (4), 311-326 (2004).
- Olsen, M. L., Campbell, S. C., McFerrin, M. B., Floyd, C. L. Spinal cord injury causes a wide-spread, persistent loss of Kir4.1 and glutamate transporter 1: benefit of 17 beta-oestradiol treatment. Brain. 133, 1013-1025 (2010).
- Koller, H., Schroeter, M., Jander, S., Stoll, G. Time course of inwardly rectifying K(+) current reduction in glial cells surrounding ischemic brain lesions. Brain Res. 872, 1-2 (2000).
- Bordey, A., Lyons, S. A., Hablitz, J. J. Electrophysiological characteristics of reactive astrocytes in experimental cortical dysplasia. J Neurophysiol. 85 (4), 1719-1731 (2001).
- Albuquerque, C., Joseph, D. J., Choudhury, P. plating, and maintenance of cortical astrocyte cultures. 8, Cold Spring. 10-1101 (2009).
- Itakura, E., et al. Generation of transgenic rats expressing green fluorescent protein in S-100beta-producing pituitary folliculo-stellate cells and brain astrocytes. Endocrinology. 148, 1518-1523 (2007).
- Foo, L. C. Purification of astrocytes from transgenic rodents by fluorescence-activated cell sorting. Cold Spring Harb.Protoc. 2013, 551-560 (2013).
- Smith, C., Otto, P., Bitner, R. A silica membrane-based method for the isolation of genomic DNA from tissues and cultured cells. CSH. Protoc. 2006, 2006-201 (2006).
- Sambrook, J., Russell, D. W. A Single-step Method for the Simultaneous Preparation. of DNA, RNA, and Protein from Cells and. 1, 2006-201 (2006).
- Barbas, C. F., Burton, D. R., Scott, J. K. Quantitation of DNA and. , (2007).
- Zhao, Z., Han, L. CpG islands: algorithms and applications in methylation studies. Biochem. Biophys. Res. Commun. 382, 643-645 (2009).
- Srivastava, G. P., Guo, J., Shi, H. PRIMEGENS-v2: genome-wide primer design for analyzing DNA methylation patterns of CpG islands. Bioinformatics. 24, 1837-1842 (2008).
- Patterson, K., Molloy, L., Qu, W. DNA methylation: bisulphite modification and analysis. J.Vis.Exp.(56), doi:3170 [pii];10.3791/3170. , (2011).
- Drummond, G. B., Vowler, S. L. Categorized or continuous? Strength of an association-and linear regression. Adv.Physiol Educ. 36, 89-92 (2012).
- Sambrook, J., Russell, D. W.
- Arpa, P. Strategies for cloning PCR products. Cold Spring Harb.Protoc. 8, (2009).
- Makovets, S. Basic DNA electrophoresis in molecular cloning: a comprehensive guide for beginners. Methods Mol.Biol. 1054, 11-43 (2013).
- Cahoy, J. D., et al. A transcriptome database for astrocytes, neurons, and oligodendrocytes: a new resource for understanding brain development and function. J Neuroscience. 28, 264-278 (2008).
- Maldonado, P. P., Velez-Fort, M., Levavasseur, F. Oligodendrocyte precursor cells are accurate sensors of local K+ in mature gray matter. J Neuroscience. 33, 2432-2442 (2013).
- Kalsi, A. S., Greenwood, K., Wilkin, G. Kir4.1 expression by astrocytes and oligodendrocytes in CNS white matter: a developmental study in the rat optic nerve. J.Anat. 204, 475-485 (2004).
- Higashi, K., et al. An inwardly rectifying K(+) channel, Kir4.1, expressed in astrocytes surrounds synapses and blood vessels in brain. Am.J.Physiol Cell Physiol. 281 (3), (2001).
- Olsen, M. L., Higashimori, H., Campbell, S. L., Hablitz, J. J. Functional expression of Kir4.1 channels in spinal cord astrocytes. Glia. 53 (5), 516-528 (2006).
- Neusch, C., Rozengurt, N., Jacobs, R. E., Lester, H. A. Kir4.1 Potassium Channel Subunit Is Crucial for Oligodendrocyte Development and In Vivo Myelination. J. Neuroscience. 21 (15), 5429-5438 (2001).
- Kofuji, P., et al. Genetic Inactivation of an Inwardly Rectifying Potassium Channel (Kir4.1 Subunit) in Mice: Phenotypic Impact in Retina. J. Neuroscience. 20 (15), 5733-5740 (2000).
- Kofuji, P., Connors, N. C. Molecular substrates of potassium spatial buffering in glial cells. Mol.Neurobiol. 28, 195-208 (2003).
- Nwaobi, S. E., Lin, E., Peramsetty, S. R. DNA methylation functions as a critical regulator of Kir4.1 expression during CNS development. Glia. 62 (3), 411-427 (2014).
- Wojdacz, T. K., Dobrovic, A.
- Wojdacz, T. K., Dobrovic, A. Methylation-sensitive high resolution melting (MS-HRM): a new approach for sensitive and high-throughput assessment of methylation. Nucleic Acids Res. 35, 10-1093 (2007).
- Laird, P. W. Principles and challenges of genomewide DNA methylation analysis. Nat.Rev.Genet. 11, 191-203 (2010).
