Abstract
ヒヨコ漿尿膜（CAM）は、CAMはその腫瘍の移植のための理想的なシステム作り、自然免疫及び高度に血管新生である受精後7日目までに開発を開始し、12日目により成熟します。さらに、CAMはその腫瘍の浸潤や転移を研究するための魅力的なモデル作り、フィブロネクチン、ラミニン、コラーゲン、インテグリンα（v）のベータ3、およびMMP-2のような細胞外マトリックスタンパク質が含まれています。科学者は、長い血管形成のモデルとして使用することによってCAMの生理機能の利点をとっています。より最近では、CAMアッセイは、基本的なインビトロでの作業がより複雑な動物癌モデル間のギャップを埋めるために、種々の癌のインビボ異種移植モデルシステムとして動作するように変更されています。 CAMアッセイは、コストと時間が効果的である生物学的に関連するシステムにおける腫瘍増殖、抗腫瘍療法、およびプロ腫瘍分子経路の研究を可能にします。ここでは、CAMのXenの開発を説明最大93％の胚の生存率と肝細胞癌（HCC）のograftモデルと信頼性の腫瘍は、三次元の、血管新生化腫瘍の成長につながる取ります。
Introduction
肝細胞癌（HCC）は、世界1におけるがん死亡率の3 番目の主要な原因です。現在、HCC患者のわずか30％が治癒の可能性の外科的治療2、および全身化学療法の対象となる3有効ではありません。そのため、新たな肝細胞癌治療のための押し満たされていない臨床的必要性、および新しい薬剤の効率的な試験に適したモデル系の開発があります。ニワトリ絨毛尿膜（CAM）アッセイは、再現可能な、費用対効果、及びインビボでの潜在的な抗腫瘍薬を試験する迅速ミディアムスループット方法を提供します。
CAMアッセイは、血管新生4を研究するために広く使用されています。また、正常神経膠芽腫5、6膵臓癌、黒色腫7-9、および骨肉腫10-11含む、癌の腫瘍異種移植片モデルに開発されました。どちらOVO 12とEX卵内13の技術は、プロトコルからのプロトコルに様々な詳細は、文献に利用されてきました。 50％11-14 - CAM異種移植モデルに対する一つの大きな課題は、25に至るまで公表されたニワトリ胚死亡率で、卵の操作後胚死亡の発生率が比較的高いです。
この記事では、我々は確実に組織学的に未分化HCCに似ている三次元の、血管新生化腫瘍の増殖を生産HCCの卵内異種移植モデルの開発について説明します。まずオソウスキら 14によって記載されたプロトコルを適応していると非常に高い腫瘍の生着に93％までのヒヨコ胚の生存率を達成しています。
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Protocol
1.卵のインキュベーション
- 8日齢の特定病原体フリーの孵化卵を入手します。
- 卵トレイを回転させるに卵を置き、上向きに刻印が終了し、卵のインキュベーターの内側に回転トレイを置きます。 36°Cおよび50％の湿度で48時間の卵をインキュベートします。
2. CAMを削除し、卵を開きます
- インキュベーターから卵を収集します。卵のラックに卵を置き、刻印側を上にし、層流フードにもたらします。
- 部屋とフードライトをオフにします。
- CAMの血管系だけでなく、気嚢を露出するために卵キャンドラーに軽く卵の刻印の端を持ってください。
注：卵キャンドラーは、発生中の胚および関連気嚢と血管系を可視化するために使用される光源です。 - 二つの主要な血管の間に鉛筆マークを配置します。
- ライトの電源をオンにし、PEで気嚢（刻印終了）上記の卵の先端と一つの穴に一つの穴を作るために、滅菌プッシュピンを使用ncilマーク。すべての方法を介してプッシュピンを押さないでください。深い3ミリメートルの周りの穴は、通常は十分であろう。
- ライトをオフにします。気嚢上の穴にしっかりと開放端を押して、安全電球を絞ります。 CAMは、鉛筆のマークでシェルから離れて落下させる、鉛筆のマークの穴に空気を引っ張るために吸引を適用します。
- 気嚢がキャンドラーを使用して、鉛筆でマークされた穴に卵の刻印端から移動したことを確認してください。それはしていない場合、安全バルブを使用して再適用する吸引両方の穴が若干深くするために押しピンを使用して。
- ライトをオンにします。添付15/16インチカットオフホイールでDREMEL回転工具をオンにし、シェルを切断するだけの十分な深2の横方向のカットを行いますが十分な深さではないが押さまですべての方法をカットするために、片手で卵を開催CAM。離間長さ2センチ、1センチメートル周りのカットを行います。直径1cmシリコーンリングが通過できるように十分な幅のカットを作りますしかし、標準的なスコッチテープの幅よりも薄いです。
- 次に、間に軽くシェルにカットオフホイールをタッチして、2つの横方向のカットの端部の1の長手方向のカットを行います。
- シェルにシェル片と並列の下で滅菌ピンセットをスライドさせます。ピンセットで殻の部分をつかみ、きれいに作品全体を削除します。
- 除去を容易にするため自体に一端を超える倍にしてくださいすること、新しく開いたウィンドウの上にスコッチテープを配置します。
- 接種時まで（NOT回転卵ラックで）卵トレイにインキュベーターに戻って卵を置きます。
3.接種
- （重合を防止するため）とフードに置き、氷上で、そのようなマトリゲルとして、基底膜タンパク質の混合物を保管してください。
- 5分間組織培養インキュベーター中で - （T75フラスコあたり5ミリリットル4）と場所フラスコの細胞を分離するために2 mMのEDTAを使用してください。
- メディアで剥離した細胞を再懸濁し、血球計およびトリパンブルーを用いて数えます。 50万トンの間で使用します細胞株に応じて、CAM上に移植するための2,000,000細胞O。予備実験で適切な数を最適化します。
- 5分間500×gで適切な細胞数と遠心分離のために必要な測定量。
- 上清を捨て、次いで、PBS ++の40μLと基底膜の混合物の20μLに細胞ペレットを再懸濁します。
注：細胞/基底膜の混合懸濁液に再懸濁することにより実験のために必要に応じて、この時点で、細胞は、薬物または他の試験薬剤で処理することができます。あるいは、薬剤は、移植後の細胞/基底膜の混合懸濁液にピペッティングすることができます。 - 層流フード内でインキュベーターと場所から卵と卵のラックを取得します。
- ウィンドウのオフピールテープ、滅菌ピンセットを用いて低温バイアルのキャップから1ミリメートルのシリコンリングを取得し、窓からリングをドロップします。
- ピペットでPBSの60μlの細胞溶液++および基底膜mixtur電子直接、CAM上に載っているシリコーンリングの中心部へ。
- ウィンドウを再テープとバックインキュベーターに卵のラックを移動します。この時点で、卵を移動する際、リング、細胞懸濁液として十分注意してください、簡単に変位することができます。
- 腫瘍は5〜7日間増殖できるようにします。
4.収穫腫瘍
- フード内の下パッドに置きます。組織学のために必要に応じて、35×10 mmプレート及びパラホルムアルデヒドコンテナを準備します。各35×10ミリメートルプレートに1mlのPBS ++を入れてください。
- フード内でバイオハザードバッグを置きます。無菌解剖はさみを取り、刻印端付近の穴に卵の中に先端を挿入します。
- 縦方向全体の卵の周りをカットします。
注：リング付きCAMおよび腫瘍は、ウィンドウを持つシェルの上半分に固執する必要があります。 - 解剖ハサミとピンセットを使用して、離れたCAMから腫瘍を分析し、35×10ミリメートルプレートに腫瘍を配置します。測定し、腫瘍の重量を量ります。 paraformaldehyで修正された腫瘍その後、脱パラフィン - 埋め込み、それらを組織学および免疫組織化学の実験で使用するため。
5.（オプション）：腫瘍細胞解離
- 35×10ミリメートルプレートに腫瘍をミンチする解剖ハサミを使用してください。 15mlの遠心チューブにみじん切り腫瘍を注ぎ、ピペッティングを介して可能な限り多くのPBS ++を削除します。
- （PBS中1mg / mlの++）コラゲナーゼの2ミリリットルを加え、数回にわたってチューブを回して、（数時間まで）、少なくとも37℃で30分間チューブをインキュベートします。
- 各チューブに5ミリリットルのメディアを追加し、ダウン20ピペッティングにより完全に再懸濁 - 40倍。徹底したピペット操作は、完全な細胞解離のために重要です。
- 沈殿物が沈降することを許可し、上清を新しいチューブに移します。 5分間500×gで遠心分離します。解離細胞ペレットを残し、上清を取り除きます。
注：この時点で、細胞ペレットは、種々の実験のために使用することができる（フローサイトメトリー、ウェスタンブロッティング、RNAの単離などで使用するために溶解します）。全腫瘍細胞数はまた、血球計およびトリパンブルー染色を用いて得ることができます。小さく、楕円形の細胞は、CAMからの鶏の細胞であり、腫瘍細胞としてカウントすべきではないことに注意してください。腫瘍は慎重に、CAMから離れて解剖されている場合は非腫瘍（CAM）細胞の混入の最小数があるはずです。
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Representative Results
プロトコルにおける重要なステップの代表的な画像がここに表示されます。 図1（a）は、胚、気嚢、およびCAMの血管系を可視化するキャンドラーの使用方法を示します。 図1B-1Cは、することによって、CAMをドロップするプロセスを示します二つの穴と、その後の安全電球を使用して負圧を加えると、 図1Dが正常に鉛筆でマークされた穴の下に大きな気泡とCAMを落とし示したものである。 図1E及び図1Fは、必要に応じて行うためにDREMELロータリーツールの使用法を示します気泡と内に露出血管新生し、CAMとのシェルで開いたウィンドウ上のシェルの削減。
三次元の血管化腫瘍は、正常ヒトHCC細胞株HUH7（ 図2A-2B）及びPLC / PRF / 5（ 図2C-2D）を使用して成長させました。 HUH7とPLC / PRF / 5細胞から増殖した腫瘍こんにちはstologically未分化HCC（ 図2E-2F）に似ており、また、マウス異種移植モデル15,16に成長しHUH7とPLC / PRF / 5腫瘍に似ています。さらに、腫瘍重量を使用することは、腫瘍重量が非常にコラゲナーゼ（ 図3）を使用して、腫瘍を完全に解離した後に得られた全腫瘍細胞の数と相関していたことを実証することにより、腫瘍の大きさの測定として検証されました。
このプロトコルを使用して、最大93％の胚の生存率が達成された（ 表1）。表1は、CAMの異種移植モデルにおける3つの別々のHCC実験からのデータを集約します。成功し50万腫瘍細胞（HUH7またはPLC / PRF5）を移植した33卵の合計のうち、唯一の3卵はニワトリ胚死亡、90.9パーセントの全体的な生存率が得られました。さらに、腫瘍は非常に確実に生存する胚を有する卵の100％（30/30）としてうまく腫瘍形成があったが、5日後に成長させました。
図1. CAMの削除とシェルのウィンドウを開きます。 （A）胚の識別（青矢印）と血管系（黒い矢印）シェルの穴を作るキャンドラー、（B）、（C）天然に存在する空気サックの穴に適用吸引を使用して、（D）の可視化（E - F）は 、離れてシェルから、CAMの成功の削除を表示エアーバブル。ドレメルロータリーツールを使用してシェルでウィンドウを開くには、 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2. CAMは三次元の成長をサポートし、血管柄腫瘍は、その組織学的に未分化HCC似ています。 CAMモデル、Huh7細胞の5日後- （A、B）腫瘍増殖（500,000個の細胞を播種）（スケールバー= 1センチ）、（C - D）CAMモデルの5日後に腫瘍の増殖、PLC / PRF / 5細胞（500,000個の細胞播種）（スケールバー= 1センチ）、HUH7とPLCの（E-F）組織学/ PRF / 5それぞれ腫瘍、（スケールバー= 100μm）をこの図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
細胞数。腫瘍重量対腫瘍重量の図3のプロットは、高 collagenas後の全腫瘍細胞の数と相関しています電子解離。
| 卵の総数 | ニワトリ胚の生存と卵の割合 | 腫瘍の割合は生き残った胚を卵に取ります | |
| HUH7 | 27 | 92.6パーセント（25/27） | 100％（25/25） |
| PLC / PRF / 5 | 6 | 83.3パーセント（5/6） | 100％（5/5） |
| 全体 | 33 | 90.9パーセント（30/33） | 100％（30/30） |
腫瘍の表1胚生存率と料金は、2つのヒト肝細胞癌細胞株を使用して、CAMモデルでください。
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Discussion
このプロトコルのいくつかの重要なステップは、ほとんど改善された胚の生存率だけでなく、腫瘍増殖の信頼性向上を占めています。気嚢に吸引を適用することにより、離れたシェルからCAMを削除すると（卵、鈍的切開などからアルブミンを除去するために、針を使用して）他の既存の方法よりも低侵襲性です。この方法のために必要な2つの小さな穴を作成するために、無菌のプッシュピンを使用すると、プロトコルの最も挑戦的な部分です。あまりにも多くの力を使用すると、プッシュピンをオーバー浸透を通じてCAMとその血管系に損傷を与えることができ、さらには卵を割れや破壊をもたらすことができます。ハンズオン非受精し、食料品買った卵に小さな穴がCAMを落とすの最初の試みの間のミスを最小限に抑えることができます作るためにプッシュピンを使用して練習。さらに、エタノールまたはシェルを清掃するために、他の殺菌剤溶液の使用は、胚の生存率を減少させ、避けるべきです。最後に、無菌のシリコーンリングを使用することに＆＃8220;腫瘍増殖のアシストを播種後1特定の場所にある腫瘍細胞」畜舎や腫瘍の高い率に貢献するには、我々のプロトコルで見てください。
異なる細胞株および/または薬物を扱う際のプロトコルにおける重要なステップのいくつかの最適化は、最も可能性の高い必要があります。播種のための細胞の推奨数は、0.5と2百万の間であり、いくつかの細胞株をいい、三次元の腫瘍を形成するために、より高いまたはより低い播種密度を必要とするかもしれません。あまりにも多くの細胞を移植すると腫瘍は、全体のシリコーンリングを占めている理想的であるよりも、3次元平坦と少なくなり、リングの境界を逃れることができる腫瘍の異常増殖をもたらすことができる一方で、あまりにも少数の細胞を移植することは、悪い腫瘍形成をもたらすことができます。私たちは、任意の特定の細胞株に最適な細胞播種密度を決定するために予備実験を設定することをお勧めします。さらに、 試験管内の薬物濃度の標準にはいくつかの調整が必要とすることができますD。我々は、おそらく、に起因するCAM（60μl）を上に播種され、総容量を参照して薬物濃度を計算するが、時にはin vitroでの平行実験で使用したものよりも「高い」薬物濃度は、腫瘍の成長に及ぼす影響を見るために必要とされます卵の残りの部分への薬物のCAMと分散を通した吸収。
特定の細胞株および薬物のためのプロトコルの最適化に成功した後、CAMの異種移植モデルは、腫瘍の性質及び細胞機構のさまざまな調査するために使用することができます。腫瘍増殖は、重量とサイズの測定値ならびに総腫瘍細胞計数によって評価することができます。腫瘍を固定し、腫瘍マーカーまたは目的の特定のタンパク質を染色するために免疫組織化学を行うことができます。血管形成は、特にニワトリ、内皮細胞17を染色 SNA1、のために染色することによって評価することができます。腫瘍細胞は、分子経路の質問のために溶解され得ます。このような同所動物モデルとして癌のより複雑なモデルを用いたin vitro の仕事に純粋なブリッジングにおける中間ステップとして、CAM異種移植モデルはすぐに複数の生物培養で増殖させた細胞よりも関連する設定でデータを取得する費用対効果の高い方法です。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Premium incubated eggs | Charles River | N/A | http://www.criver.com/files/pdfs/avian/av_c_spf_egg_price_list.aspx |
| Egg incubators | GQF | Hova-Bator 2362N | |
| Rotating egg trays | GQF | 1611 Automatic Egg Turner | |
| Egg candler | Lyon | Hi-Power 950-070 | |
| Dremel 100 rotary tool with 15/16 cut-off wheel | Dremel | 100-N/7 | |
| Sterile forceps, push pin, dissection scissors, Scotch tape | |||
| Matrigel | BD Biosciences | 356234 | |
| Cryogenic vials, external thread with silicone washer | Corning | 430659 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma | C9891 |
References
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