Abstract
लड़की chorioallantoic झिल्ली (सीएएम) सीएएम यह ट्यूमर आरोपण के लिए एक आदर्श व्यवस्था कर रही है, स्वाभाविक रूप से immunodeficient और अत्यधिक vascularized है निषेचन के बाद दिन 7 से विकसित करने के लिए शुरू होता है और 12 दिन से परिपक्व होती है। इसके अलावा, सीएएम यह ट्यूमर आक्रमण और मेटास्टेसिस अध्ययन करने के लिए एक आकर्षक मॉडल बनाने ऐसे फ़ाइब्रोनेक्टिन, laminin, मज्जा, इंटीग्रिन अल्फा (v) beta3, और एमएमपी 2 के रूप में बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन, शामिल हैं। वैज्ञानिकों ने लंबे angiogenesis की एक मॉडल के रूप में उपयोग करके सीएएम के शरीर क्रिया विज्ञान का लाभ ले लिया है। हाल ही में, सीएएम परख बुनियादी इन विट्रो काम और अधिक जटिल जानवर कैंसर मॉडलों के बीच की खाई को पाटने कि विभिन्न तरह के कैंसर के लिए एक इन विवो जेनोग्राफ्ट मॉडल प्रणाली के रूप में काम करने के लिए संशोधित किया गया है। सीएएम परख लागत और समय प्रभावी है कि दोनों एक जैविक रूप से प्रासंगिक प्रणाली में ट्यूमर के विकास, विरोधी ट्यूमर चिकित्सा, और समर्थक ट्यूमर आणविक रास्ते के अध्ययन के लिए अनुमति देता है। यहाँ, हम सीएएम एक्सईएन के विकास का वर्णनअप करने के लिए 93% की भ्रूण जीवित रहने की दरों और विश्वसनीय ट्यूमर के साथ हेपैटोसेलुलर कार्सिनोमा (एचसीसी) की ograft मॉडल तीन आयामी, vascularized ट्यूमर के विकास के लिए अग्रणी ले।
Introduction
हेपैटोसेलुलर कार्सिनोमा (एचसीसी) दुनिया एक में कैंसर से मृत्यु के 3 प्रमुख कारण है। वर्तमान में एचसीसी रोगियों का केवल 30% संभावित उपचारात्मक शल्य चिकित्सा उपचार 2 के लिए पात्र हैं, और प्रणालीगत कीमोथेरपी 3 प्रभावशाली नहीं है। इसलिए, उपन्यास एचसीसी उपचार के लिए एक दबाने unmet नैदानिक जरूरत है, और नए एजेंटों की कुशल परीक्षण के लिए उपयुक्त मॉडल प्रणाली का विकास है। लड़की chorioallantoic झिल्ली (सीएएम) परख विवो में संभावित विरोधी ट्यूमर दवाओं के परीक्षण के एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने, लागत प्रभावी है, और मध्यम तेज throughput विधि प्रदान करता है।
सीएएम परख angiogenesis 4 अध्ययन करने के लिए बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया गया है। यह भी सफलतापूर्वक ग्लियोब्लास्टोमा 5, अग्नाशय के कैंसर के 6, मेलेनोमा 7-9, और osteosarcoma 10-11 सहित कैंसर की एक ट्यूमर जेनोग्राफ्ट मॉडल के रूप में विकसित किया गया है। दोनों ओवो 12 और पूर्व ओवो में13 तकनीक प्रोटोकॉल से प्रोटोकॉल के लिए अलग-अलग विवरण के साथ, साहित्य में उपयोग किया गया है। 50 प्रतिशत 11-14 - सीएएम जेनोग्राफ्ट मॉडल के लिए एक बड़ी चुनौती 25 से लेकर प्रकाशित लड़की भ्रूण मृत्यु दर के साथ, अंडे के हेरफेर के बाद भ्रूण मौत के अपेक्षाकृत उच्च घटना है।
इस अनुच्छेद में, हम मज़बूती से histologically अविभाजित एचसीसी जैसे लगते हैं कि तीन आयामी, vascularized ट्यूमर के विकास को पैदा करता है कि एचसीसी की जेनोग्राफ्ट मॉडल ओवो एक में के विकास का वर्णन है। हम पहले Ossowski एट अल। 14 द्वारा वर्णित एक प्रोटोकॉल ढाल लिया है और अत्यंत उच्च ट्यूमर engraftment के साथ अप करने के लिए 93% की लड़की भ्रूण जीवित रहने की दर हासिल की है।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. अंडे ऊष्मायन
- 8 दिन पुराने विशिष्ट रोगज़नक़ मुक्त embryonated अंडे प्राप्त करते हैं।
- अंडे की ट्रे, ऊपर की ओर का सामना करना पड़ मुहर लगी सिरों घूर्णन में अंडे प्लेस, और एक अंडे इनक्यूबेटर अंदर घूर्णन ट्रे जगह है। 36 डिग्री सेल्सियस पर 48 घंटा और 50% आर्द्रता के लिए अंडे सेते हैं।
2. सीएएम गिराने और अंडे खुलने
- इनक्यूबेटर से अंडे इकट्ठा। अंडा रैक में जगह अंडे, ऊपर की ओर मुहर लगी है, और लामिना का प्रवाह हुड के लिए लाने के लिए।
- कमरे और हुड लाइट बंद।
- सीएएम की वाहिका के साथ ही हवा की थैली को बेनकाब करने के लिए अंडा कन्दलेर को हल्के से अंडे की मुहर लगी अंत पकड़ो।
नोट: अंडा कन्दलेर विकासशील भ्रूण और संबद्ध हवा की थैली और vasculature कल्पना करने के लिए प्रयोग किया जाता है एक प्रकाश स्रोत है। - दो प्रमुख रक्त वाहिकाओं के बीच में एक पेंसिल के निशान रखें।
- रोशनी पर बारी और पीई पर हवा की थैली (मुहर लगी अंत) के ऊपर अंडे की नोक और एक छेद में एक छेद बनाने के लिए एक बाँझ धक्का पिन का उपयोगncil निशान। धक्का पिन के माध्यम से सभी तरह से धक्का नहीं है; 3 मिमी के आसपास एक छेद गहरी आमतौर पर पर्याप्त होगा।
- बत्तिया बुझा दो। हवा की थैली ऊपर छेद के खिलाफ मजबूती से खुले अंत दबाने, सुरक्षा बल्ब निचोड़। सीएएम पेंसिल के निशान पर दूर खोल से ड्रॉप करने के लिए कारण, पेंसिल के निशान पर छेद में हवा खींचने के लिए सक्शन लागू करें।
- हवा की थैली कन्दलेर का उपयोग कर पेंसिल से चिह्नित छेद करने के लिए अंडे की मुहर लगी छोर से ले जाया गया है कि जाँच करें। यह नहीं है, तो सुरक्षा बल्ब का उपयोग कर सक्शन फिर से लागू तो दोनों छेद थोड़ा गहरा बनाने के लिए और करने के लिए धक्का पिन का उपयोग करें।
- बत्तियां जला दो। जुड़ी एक 15/16 इंच कट ऑफ पहिया के साथ DREMEL रोटरी उपकरण पर बारी और खोल के माध्यम से कटौती करने के लिए अभी काफी गहरी दो अनुप्रस्थ कटौती करने लेकिन गहरी पर्याप्त नहीं उदास करने के लिए सभी तरह से नीचे कटौती करने के लिए, एक हाथ में अंडा होल्डिंग सीएएम। एक दूसरे से अलग लंबाई में 2 सेमी और 1 सेमी के आसपास कटौती करें। व्यास में 1 सेमी एक सिलिकॉन अंगूठी के माध्यम से पारित कर सकते हैं कि इतना व्यापक पर्याप्त कटौती करेंमानक स्कॉच टेप की चौड़ाई से अधिक लेकिन पतली।
- इसके बाद, हल्के से खोल करने के लिए कट ऑफ पहिया छू द्वारा बीच और दो अनुप्रस्थ कटौती के सिरों पर एक अनुदैर्ध्य काट कर।
- खोल के लिए खोल टुकड़ा और समानांतर तहत बाँझ संदंश स्लाइड। संदंश के साथ खोल टुकड़ा ले लो और सफाई से पूरे टुकड़ा हटा दें।
- हटाने की आसानी के लिए खुद पर एक छोर पर गुना करने के लिए सुनिश्चित कर रही है, नए खुले खिड़की पर स्कॉच टेप रखें।
- वापस इनक्यूबेटर में (नहीं घूर्णन अंडा रैक में) अंडे की ट्रे में टीका के समय तक जगह अंडे।
3. टीका
- , इस तरह के Matrigel के रूप में, तहखाने झिल्ली प्रोटीन मिश्रण रखें बर्फ पर हुड में (polymerization रोकने के लिए) और जगह।
- 5 मिनट के लिए टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में - (T75 कुप्पी प्रति 5 मिलीलीटर 4) और जगह बोतल कोशिकाओं को अलग करने के लिए 2 मिमी EDTA का प्रयोग करें।
- मीडिया में अलग कोशिकाओं Resuspend और एक hemocytometer और trypan नीले रंग का उपयोग गिनती। 500,000 टी के बीच का उपयोग, सीएएम पर ग्राफ्टिंग सेल लाइन पर निर्भर करता है के लिए 2,000,000 कोशिकाओं ओ। प्रारंभिक प्रयोगों में उचित संख्या का अनुकूलन।
- 5 मिनट के लिए 500 XG पर उचित सेल नंबर और सेंट्रीफ्यूज के लिए आवश्यक उपाय मात्रा।
- सतह पर तैरनेवाला त्यागें और फिर पीबीएस के 40 μ एल ++ और तहखाने झिल्ली मिश्रण के 20 μ एल में सेल गोली resuspend।
नोट: सेल / तहखाने झिल्ली मिश्रण निलंबन में resuspending द्वारा प्रयोगों के लिए जरूरत के रूप में इस बिंदु पर, कोशिकाओं दवाओं या अन्य परीक्षण एजेंटों के साथ इलाज किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, एजेंटों ग्राफ्टिंग के बाद सेल / तहखाने झिल्ली मिश्रण निलंबन पर pipetted जा सकता है। - लामिना का प्रवाह हुड में इनक्यूबेटर और जगह से अंडे के साथ अंडा रैक निकालते हैं।
- पील टेप खिड़की से दूर, निष्फल संदंश का उपयोग कर एक क्रायोजेनिक शीशी की टोपी से 1 मिमी सिलिकॉन अंगूठी निकालते हैं, और खिड़की के माध्यम से अंगूठी ड्रॉप।
- Pipet पीबीएस के 60 μ एल सेल समाधान ++ और तहखाने झिल्ली mixturसीधे सीएएम पर आराम कर सिलिकॉन अंगूठी के केंद्र में ई।
- फिर टेप खिड़की और इनक्यूबेटर में वापस अंडा रैक चाल। आसानी से विस्थापित हो सकते हैं अंगूठी और सेल निलंबन के रूप में अंडे जब चलती है इस बिंदु पर, सावधानी बरतें।
- ट्यूमर 5 से 7 दिनों के लिए विकसित करने की अनुमति दें।
4. कटाई ट्यूमर
- हुड में अंडर पैड रखें। ऊतक विज्ञान के लिए जरूरत के रूप में 35 x 10 मिमी प्लेटों और paraformaldehyde कंटेनर तैयार करें। प्रत्येक 35 x 10 मिमी प्लेट में 1 मिलीलीटर पीबीएस ++ रखो।
- हुड में Biohazard बैग में रखें। बाँझ विच्छेदन कैंची ले लो और मुहर लगी अंत के पास छेद पर अंडे में बताया अंत डालें।
- अनुलंबीय पूरे अंडे के आसपास कट।
नोट: अंगूठी के साथ सीएएम और ट्यूमर खिड़की के साथ खोल के ऊपर आधा रहना चाहिए। - विच्छेदन कैंची और संदंश का प्रयोग, दूर सीएएम से ट्यूमर काटना और 35 x 10 मिमी प्लेट में ट्यूमर जगह है। उपाय और ट्यूमर का वजन। Paraformaldehy में फिक्स्ड ट्यूमरडे और फिर ऊतक विज्ञान और immunohistochemistry प्रयोगों में इस्तेमाल के लिए उन्हें आयल एम्बेड।
5. (वैकल्पिक): ट्यूमर सेल हदबंदी
- 35 x 10 मिमी प्लेट में ट्यूमर कीमा विच्छेदन कैंची का प्रयोग करें। एक 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में कीमा बनाया हुआ ट्यूमर डालो और pipetting के माध्यम से संभव के रूप में ++ के रूप में ज्यादा पीबीएस निकालें।
- (पीबीएस में 1 मिलीग्राम / एमएल ++) कोलैजिनेज़ के 2 मिलीलीटर जोड़ें, कई बार से अधिक ट्यूब बारी है, और (कई घंटे तक) में कम से कम 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूब सेते हैं।
- प्रत्येक ट्यूब 5 मिलीलीटर मीडिया जोड़ें और नीचे 20 Pipetting और अच्छी तरह से resuspend - 40x। पूरी तरह से pipetting पूरा सेल हदबंदी के लिए महत्वपूर्ण है।
- तलछट व्यवस्थित करने के लिए अनुमति दें, और एक ताजा ट्यूब स्थानांतरण सतह पर तैरनेवाला। 5 मिनट के लिए 500 XG पर अपकेंद्रित्र। अलग सेल गोली पीछे छोड़ रहा है, सतह पर तैरनेवाला निकालें।
नोट: इस बिंदु पर, सेल छर्रों विभिन्न प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है (प्रवाह cytometry, पश्चिमी सोख्ता, आरएनए अलगाव, आदि में उपयोग के लिए lysis)। कुल ट्यूमर कोशिकाओं की संख्या भी एक hemocytometer और trypan नीले रंग धुंधला का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता है। छोटे, अंडाकार आकार कोशिकाओं चिकन कोशिकाओं सीएएम से हैं और ट्यूमर कोशिकाओं के रूप में नहीं गिना जाना चाहिए कि ध्यान दें। ट्यूमर ध्यान सीएएम से दूर विच्छेदित किया जाता है तो गैर ट्यूमर (सीएएम) कोशिकाओं contaminating की एक न्यूनतम संख्या होनी चाहिए।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम का प्रतिनिधि चित्रों यहाँ दिखाए जाते हैं। चित्रा 1 ए विकासशील भ्रूण, हवा की थैली, और सीएएम की वाहिका कल्पना करने के लिए कन्दलेर के उपयोग को दर्शाता है। चित्रा 1 बी -1 सी बनाकर सीएएम छोड़ने की प्रक्रिया को दिखाने दो छेद और उसके बाद सुरक्षा बल्ब का उपयोग नकारात्मक दबाव लागू करने, और चित्रा -1 एक सफलतापूर्वक पेंसिल से चिह्नित छेद के तहत एक बड़े एयर बबल के साथ कैम गिरा से पता चलता है। चित्रा 1E और चित्रा 1F आवश्यक बनाने के लिए DREMEL रोटरी उपकरण के उपयोग का प्रदर्शन एयर बबल और भीतर उजागर vascularized सीएएम के साथ खोल में खोला खिड़की के ऊपर खोल में कटौती।
तीन आयामी, vascularized ट्यूमर सफलतापूर्वक मानव एचसीसी सेल लाइनों Huh7 (2A चित्रा-2 बी) और पीएलसी / पीआरएफ / 5 (चित्रा -2 सी 2 डी) का उपयोग कर बड़े हो रहे थे। Huh7 और पीएलसी / पीआरएफ / 5 कोशिकाओं से हो गई ट्यूमर हायstologically अविभाजित एचसीसी (चित्रा 2 ई-2 एफ) के समान है और यह भी माउस xenograft मॉडल 15,16 में उगाया Huh7 और पीएलसी / पीआरएफ / 5 ट्यूमर जैसे लगते हैं। इसके अलावा, ट्यूमर वजन का उपयोग ट्यूमर वजन अत्यधिक कोलैजिनेज़ (चित्रा 3) का उपयोग ट्यूमर की पूरी हदबंदी के बाद प्राप्त कुल ट्यूमर कोशिकाओं की संख्या के साथ सहसंबद्ध था कि प्रदर्शन से ट्यूमर के आकार की एक माप के रूप में मान्य किया गया था।
इस प्रोटोकॉल का उपयोग, अप करने के लिए 93% की भ्रूण जीवित रहने की दरों को प्राप्त किया गया (1 टेबल)। तालिका 1 से पता चलता है सीएएम जेनोग्राफ्ट मॉडल में तीन अलग-अलग एचसीसी प्रयोगों से डेटा एकत्रित। सफलतापूर्वक 500,000 ट्यूमर कोशिकाओं (Huh7 या पीएलसी / PRF5) के साथ grafted किया गया है कि 33 अंडे की कुल में से केवल 3 अंडे, लड़की भ्रूण मौत में 90.9% की समग्र जीवित रहने की दर हुई। इसके अलावा, ट्यूमर बहुत मज़बूती से जीवित भ्रूण के साथ अंडे की 100% (30/30) के रूप में सफलतापूर्वक ट्यूमर गठन किया था, 5 दिनों के बाद बड़े हो रहे थे।
चित्रा 1. सीएएम गिराने और खोल में एक खिड़की खोलने। (ए) भ्रूण की पहचान (नीले तीर) और vasculature (काला तीर) शैल में एक छेद बना कन्दलेर, (बी), (सी) स्वाभाविक रूप से होने वाली हवा की थैली में छेद के लिए आवेदन सक्शन का उपयोग करते हुए, (डी) Visualizing दूर शैल से सीएएम के सफल गिराने दिखा एयर बबल, (ई - एफ)। Dremel रोटरी उपकरण का उपयोग कर खोल में एक खिड़की खोलने यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2 सीपूर्वाह्न तीन आयामी की ग्रोथ, vascularized ट्यूमर कि Histologically Undifferentiated एचसीसी सदृश समर्थन करता है। अभियान मॉडल, Huh7 कोशिकाओं में 5 दिनों के बाद - (ए बी) के ट्यूमर के विकास (500,000 कोशिकाओं वरीयता प्राप्त) (स्केल सलाखों = 1 सेमी), (सी - डी) अभियान मॉडल में 5 दिनों के बाद ट्यूमर के विकास, पीएलसी / पीआरएफ / 5 कोशिकाओं (500,000 कोशिकाओं वरीयता प्राप्त) (स्केल सलाखों = 1 सेमी), Huh7 और पीएलसी (ई-एफ) प्रोटोकॉल / पीआरएफ / 5 क्रमशः ट्यूमर, (पैमाने सलाखों = 100 μ मीटर) यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
कोशिका गिनती। ट्यूमर वजन बनाम ट्यूमर का वजन 3 चित्र प्लॉट अत्यधिक collagenas के बाद कुल ट्यूमर कोशिका गिनती के साथ जोड़ा जाता हैई हदबंदी।
| अंडे की कुल संख्या | लड़की भ्रूण अस्तित्व के साथ अंडे का प्रतिशत | ट्यूमर की दर जीवित भ्रूण के साथ अंडे में ले | |
| Huh7 | 27 | 92.6% (25/27) | 100% (25/25) |
| पीएलसी / पीआरएफ / 5 | 6 | 83.3% (5/6) | 100% (5/5) |
| संपूर्ण | 33 | 90.9% (30/33) | 100% (30/30) |
ट्यूमर की तालिका 1. भ्रूण जीवित रहने की दरों और दरें दो मानव एचसीसी सेल लाइनों का उपयोग अभियान मॉडल में ले लो।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
इस प्रोटोकॉल में कई महत्वपूर्ण कदम की संभावना सबसे अधिक सुधार भ्रूण अस्तित्व के साथ ही ट्यूमर के विकास की वृद्धि की विश्वसनीयता के लिए खाते। हवा की थैली का कश लगाने से दूर खोल से सीएएम गिराने (अंडा, कुंद विच्छेदन, आदि से एल्बुमिन को हटाने के लिए एक सुई का उपयोग) अन्य मौजूदा तरीकों की तुलना में कम आक्रामक है। इस विधि के लिए आवश्यक दो छोटे छेद बनाने के लिए एक बाँझ धक्का पिन का उपयोग प्रोटोकॉल का सबसे चुनौतीपूर्ण हिस्सा है। बहुत अधिक बल का प्रयोग धक्का पिन के साथ खत्म-प्रवेश के माध्यम से सीएएम और उसके वाहिका को नुकसान में परिणाम कर सकते हैं या यहां तक कि खुर या अंडे को नष्ट करने में परिणाम कर सकते हैं। हाथों पर अभ्यास के लिए एक धक्का पिन का उपयोग सीएएम छोड़ने में पहला प्रयास के दौरान की गई गलतियों को कम कर सकते गैर निषेचित, किराने खरीदा अंडे में छोटे छेद बनाने के लिए। इसके अलावा, इथेनॉल या खोल साफ करने के लिए अन्य कीटाणुनाशक समाधान के उपयोग भ्रूण व्यवहार्यता कम हो जाती है, और बचा जाना चाहिए। अंत में, बाँझ सिलिकॉन अंगूठी का उपयोग कर के लिए &# 8220; "खेत ट्यूमर की उच्च दर के ट्यूमर के विकास में सहायता बोने और योगदान देता है एक के बाद एक विशिष्ट स्थान में ट्यूमर कोशिकाओं हमारे प्रोटोकॉल में देखा ले।
विभिन्न सेल लाइनों और / या दवाओं के साथ काम कर रहे हैं जब प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम के कुछ अनुकूलन की संभावना सबसे अधिक आवश्यक हो जाएगा। बोने के लिए कोशिकाओं का सुझाव नंबर 0.5 और 2 लाख के बीच है, लेकिन कुछ सेल लाइनों एक अच्छा तीन आयामी ट्यूमर फार्म के लिए अधिक या कम बोने घनत्व आवश्यकता हो सकती है। भी कई कोशिकाओं ग्राफ्टिंग ट्यूमर, पूरे सिलिकॉन अंगूठी रह रहे हैं आदर्श है की तुलना में चापलूसी और कम से कम तीन आयामी हो जाता है, और अंगूठी की सीमा से बच सकते हैं, जिसमें ट्यूमर अतिवृद्धि में परिणाम कर सकते हैं, जबकि बहुत कुछ कोशिकाओं ग्राफ्टिंग, गरीब ट्यूमर गठन में परिणाम कर सकते हैं । हम किसी विशेष सेल लाइन के लिए इष्टतम सेल बोने घनत्व निर्धारित करने के लिए एक प्रारंभिक प्रयोग की स्थापना की सिफारिश। इसके अलावा, इन विट्रो दवा सांद्रता में मानक के लिए कुछ समायोजन की आवश्यकता की जा सकती हैघ। हम सीएएम (60 μl) पर वरीयता दी गई है कि कुल मात्रा के संदर्भ में दवा सांद्रता की गणना, लेकिन इन विट्रो में समानांतर प्रयोगों में इस्तेमाल की तुलना में कभी-कभी "उच्च" दवा सांद्रता संभवतः की वजह से, ट्यूमर के विकास पर प्रभाव को देखने के क्रम में आवश्यक हैं अंडे के आराम करने के लिए सीएएम और दवा के प्रसार के माध्यम से अवशोषण।
विशेष सेल लाइनों और दवाओं के लिए प्रोटोकॉल के सफल अनुकूलन के बाद, सीएएम जेनोग्राफ्ट मॉडल ट्यूमर गुण और सेलुलर तंत्र की एक विस्तृत विविधता की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। ट्यूमर के विकास को वजन और आकार माप के साथ ही कुल ट्यूमर कोशिकाओं की गिनती के माध्यम से मूल्यांकन किया जा सकता है। ट्यूमर तय की और ट्यूमर मार्करों या हित के विशिष्ट प्रोटीन के लिए दाग immunohistochemistry के अधीन किया जा सकता है। एंजियोजिनेसिस विशेष रूप से लड़की endothelial कोशिकाओं 17 जो दाग SNA1, के लिए धुंधला हो जाना द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है। ट्यूमर कोशिकाओं आणविक रास्ते से पूछताछ के लिए lysed किया जा सकता। ऐसे ओर्थोटोपिक पशु मॉडल के रूप में कैंसर के और अधिक जटिल मॉडलों के साथ इन विट्रो काम में शुद्ध पाटने में एक मध्यवर्ती कदम के रूप में, सीएएम जेनोग्राफ्ट मॉडल जल्दी से अधिक जैविक संस्कृति में विकसित कोशिकाओं की तुलना में प्रासंगिक है कि एक स्थापित करने में डेटा प्राप्त करने के लिए एक लागत प्रभावी तरीका है।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Premium incubated eggs | Charles River | N/A | http://www.criver.com/files/pdfs/avian/av_c_spf_egg_price_list.aspx |
| Egg incubators | GQF | Hova-Bator 2362N | |
| Rotating egg trays | GQF | 1611 Automatic Egg Turner | |
| Egg candler | Lyon | Hi-Power 950-070 | |
| Dremel 100 rotary tool with 15/16 cut-off wheel | Dremel | 100-N/7 | |
| Sterile forceps, push pin, dissection scissors, Scotch tape | |||
| Matrigel | BD Biosciences | 356234 | |
| Cryogenic vials, external thread with silicone washer | Corning | 430659 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma | C9891 |
References
- Sangiovanni, A., et al. Increased survival of cirrhotic patients with a hepatocellular carcinoma detected during surveillance. Gastroenterology. 126 (4), 1005-1014 (2004).
- Lopez, P. M., Villanueva, A., Llovet, J. M. Systematic review: evidence-based management of hepatocellular carcinoma--an updated analysis of randomized controlled trials. Aliment Pharmacol Ther. 23 (11), 1535-1547 (2006).
- Llovet, J. M., Burroughs, A., Bruix, J. Hepatocellular carcinoma. Lancet. 362 (9399), 1907-1917 (2003).
- Folkman, J. What is the evidence that tumors are angiogenesis dependent. J Natl Cancer Inst. 82, 4-6 (1990).
- Hagedorn, M., et al. Accessing key steps of human tumor progression in vivo by using an avian embryo model. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (5), 1643-1648 (2005).
- Dumartin, L., et al. Netrin-1 mediates early events in pancreatic adenocarcinoma progression, acting on tumor and endothelial cells. Gastroenterology. 138 (4), 1595-1606 (2010).
- Aguirre-Ghiso, J. A., Estrada, Y., Liu, D., Ossowski, L. ERK(MAPK) activity as a determinant of tumor growth and dormancy; regulation by p38(SAPK). Cancer Res. 63 (7), 1684-1695 (2003).
- Baroni, T. E., et al. Ribonomic and short hairpin RNA gene silencing methods to explore functional gene programs associated with tumor growth arrest. Methods Mol Biol. 383, 227-244 (2007).
- Lopez-Rivera, E., et al. Inducible nitric oxide synthase drives mTOR pathway activation and proliferation of human melanoma by reversible nitrosylation of TSC2. Cancer Res. 74 (4), 1067-1078 (2014).
- Balke, M., et al. A short-term in vivo model for giant cell tumor of bone. BMC Cancer. 11, 241 (2011).
- Balke, M., et al. Morphologic characterization of osteosarcoma growth on the chick chorioallantoic membrane. BMC Res Notes. 3, 58 (2010).
- Sys, G. M., et al. The in ovo CAM-assay as a xenograft model for sarcoma. J Vis Exp. (77), e50522 (2013).
- Dohle, D. S., et al. Chick ex ovo culture and ex ovo CAM assay: how it really works. J Vis Exp. (33), (2009).
- Ossowski, L., Reich, E. Experimental model for quantitative study of metastasis. Cancer Res. 40 (7), 2300-2309 (1980).
- Ghanekar, A., Ahmed, S., Chen, K., Adeyi, O. Endothelial cells do not arise from tumor-initiating cells in human hepatocellular carcinoma. BMC Cancer. 13, 485 (2013).
- Ho, J. W., et al. Effects of a novel immunomodulating agent, FTY720, on tumor growth and angiogenesis in hepatocellular carcinoma. Mol Cancer Ther. 4 (9), 1430-1438 (2005).
- Hagedorn, M., et al. VEGF coordinates interaction of pericytes and endothelial cells during vasculogenesis and experimental angiogenesis. Dev Dyn. 230 (1), 23-33 (2004).
