Abstract
Civciv koriyoallantoik membran (CAM) CAM tümör implantasyonu için ideal bir sistem haline doğal bağışık yetmezliği ve çok kanlanan bir gübreleme gün sonra 7 gelişmeye başlar ve 12. gün olgunlaşır. Bundan başka, CAM tümör istilasını ve metastazını, çalışma için çekici bir model verme gibi, fibronektin, laminin, kolajen, integrin alfa (v) beta3 ve MMP-2 gibi hücre dışı matris proteinleri içerir. Bilim adamları uzun zamandır anjiyogenez bir model olarak kullanarak CAM fizyolojisi avantajlarından almış. Daha yakın zamanlarda, CAM assay'dir bazik in vitro çalışma ve daha karmaşık bir hayvan kanser modellerinde arasında bir köprü, muhtelif kanserler bakımından bir in vivo model sisteminde ksenograft olarak çalışmak için modifiye edilmiştir. CAM deneyi maliyet ve zaman etkin bir biçimde kullanılabilir biyolojik ilgili sisteminde tümör büyümesi, anti-tümör terapisi, ve pro-tümör molekül yollarının çalışması için izin verir. Burada, CAM xen gelişimini açıklarkadar% 93 embriyonik sağkalım oranları ve güvenilir tümör hepatosellüler karsinom (HCC) ve ograft modeli üç boyutlu, vaskülarize tümörlerin büyümesine yol açan take.
Introduction
Hepatosellüler karsinom (HCC) Dünyada 1 kanser ölümlerinin 3. önde gelen nedenidir. Şu anda HCC hastalarının sadece% 30 potansiyel küratif cerrahi tedavi 2 için uygundur, ve sistemik kemoterapi 3 etkili değildir. Bu nedenle yeni tedavilere HCC için acil bir karşılanmamış bir klinik ihtiyaç ve yeni maddelerin etkin bir test için uygun bir model sistemlerinde gelişme vardır. Tavuk koriallantoik zar (CAM) tahlili in vivo potansiyel anti-tümör ilaç test üretilebilir, uygun maliyetli ve hızlı, orta hacimli bir yöntem sağlar.
CAM tahlil anjiyogenez 4 incelemek için yaygın olarak kullanılır olmuştur. Ayrıca, başarılı bir şekilde glioblastoma 5, pankreas kanseri 6, melanoma 7-9 ve osteosarkom dahil olmak üzere 10-11, kanser, bir tümör ksenograft modeli geliştirilmiştir. Hem ovo 12 ve ex ovo içinde13 teknikleri protokol protokole değişen ayrıntıları literatürde kullanılmıştır. Yüzde 50 11-14 - CAM ksenograft modeli bir büyük zorluk 25 arasında değişen yayınlanan civciv embriyo ölüm oranları ile, yumurta manipülasyonu sonrası embriyonik ölüm nispeten yüksek insidansı.
Bu yazıda, güvenilir histolojik farklılaşmamış HCC benzer üç boyutlu, vaskülarize tümörlerin büyümesini üreten HCC ksenograft modelinde ovo bir in gelişimini açıklar. Biz ilk Ossowski ve ark. 14 tarafından açıklanan protokol adapte var ve son derece yüksek tümör engraftment ile% 93'e varan civciv embriyonik sağkalım oranları elde ettik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Yumurta Kuluçka
- 8 günlük spesifik patojenden serbest embriyolu yumurtaların elde edilir.
- Yumurta tepsisi, yukarı bakacak damgalı biter dönen yumurta yerleştirin ve bir yumurta kuluçka içine döner tepsiye yerleştirin. 36 ° C de 48 saat ve% 50 nem yumurta inkübe edin.
2. CAM Damlama ve Yumurta Açılış
- Inkübatör yumurta toplamak. Yumurta rafa yerleştirin yumurta, yukarı tarafında damgalı ve laminer akış kaputu getirmek.
- Oda ve kaput ışıkları kapatın.
- CAM damarsal yanı sıra hava kesesi maruz yumurta Candler hafifçe yumurta damgalı ucunu tutun.
NOT: Yumurta Candler gelişen embriyo ve ilişkili hava kesesi ve damarsal görselleştirmek için kullanılan bir ışık kaynağıdır. - Iki büyük kan damarları arasında bir kalem işareti koyun.
- Işıkları açın ve pe hava kesesi (damgalı sonu) Yukarıdaki yumurta ucu ve bir delik, bir delik açmak için steril bir itme pimi kullanınncil işareti. Itme pimini tüm yol boyunca itmeyin; 3 mm çapında bir delik derin genellikle yeterli olacaktır.
- Işıkları kapat. Hava kesesi üzerindeki deliğin karşı sıkıca açık ucu basarak, emniyet ampul sıkın. CAM kalem işareti de uzak kabuk düşmesine neden kalem işaretine deliğe hava çekmek için emme uygulayın.
- Hava kesesi Candler kullanarak kalem işaretli deliğe yumurta damgalı ucundan geçti olmadığını kontrol edin. Değil varsa, emniyet ampul kullanarak emiş yeniden uygulamak ardından iki delik biraz daha derin yapmak ve itme pimi kullanın.
- Işıkları aç. Bağlı bir 15/16 inç cut-off tekerleği ile dremel döner aracı açmak ve kabuk kesmek için sadece yeterince derin iki enine kesimler yapmak ama yeterince derin değil depresif aşağı tüm yol kesmek için, bir yandan yumurta Holding CAM. Birbirinden uzunluğu 2 cm ve 1 cm çapında kesim yapın. 1 cm çapında bir silikon halka geçebilir ve böylece yeterince geniş kesim yapmakStandart seloteyip genişliğinden daha ama daha ince.
- Sonraki hafifçe kabuk kesme tekerleği dokunarak arasında iki enine kesik uçlarında 1 uzunlamasına kesim yapmak.
- Kabuk kabuk parçasının ve paralel altında steril forseps kaydırın. Forseps ile kabuk parçasını alın ve temiz tüm parça kaldırmak.
- Kaldırma kolaylığı için kendi üzerine bir ucunu üzerine kat için emin olun, yeni açılan pencere üzerinde seloteyip yerleştirin.
- Geri inkübatör (NOT dönen yumurta rafları) yumurta tepsisine aşılama zamanına kadar yerleştirin yumurta.
3. Aşılama
- Örneğin matrigel olarak, bazal membran proteini karışımı tutun buz üzerinde kaputu (polimerizasyonu önlemek için) ve yer.
- 5 dakika boyunca doku kültürü inkübatör - (T75 şişeye başına 5 ml 4) ve yer matara hücreleri ayırmak için 2 mM EDTA kullanın.
- Medyada müstakil hücreleri tekrar süspansiyon ve hemasitometre ve tripan mavisi kullanarak sayın. 500.000 t arası kullanın, CAM üzerine aşılama hücre hattı bağlı için 2.000.000 hücreleri o. Ön deneylerde doğru numarayı optimize edin.
- 5 dakika boyunca 500 xg'de uygun hücre sayısı ve santrifüj için gerekli Tedbir hacmi.
- Süpernatantı atın ve sonra PBS 40 μ l ++ ve bazal membran karışımı 20 μ l hücre pelletini.
Not: Hücre / bazal membran karışımı süspansiyon haline resuspending deneyler için gerektiği gibi, bu noktada, hücreler ilaçlar ya da diğer test maddeleri ile muamele edilebilir. Alternatif olarak, ajanlar aşılama sonrası hücre / bazal membran karışımı süspansiyonu pipetle edilebilir. - Laminer akış kaputu kuvöz ve yerden yumurta yumurta raf al.
- Peel bant pencerenin kapalı, steril forseps kullanarak bir kriyojenik flakon kapaktan 1 mm silikon halka almak ve pencereden halka bırakın.
- Pipet PBS 60 μ l hücre çözümü ++ ve bazal membran Karışımındoğrudan CAM üzerine oturan silikon halkanın ortasına e.
- Yeniden bant pencere ve inkübatör geri yumurta rafı hareket ettirin. Kolayca yerinden hale gelebilir halka ve hücre süspansiyonu olarak yumurta taşırken bu noktada, dikkatli olun.
- Tümörlerin, 5 ila 7 gün boyunca büyümeye izin verin.
4. Hasat Tümörleri
- Kaputu altında-pad yerleştirin. Histoloji için gerektiği gibi 35 x 10 mm tabak ve paraformaldehit kapları hazırlayın. Her bir 35 x 10 mm levha 1 ml PBS ++ koyun.
- Kaputu biohazard torbası koyun. Steril diseksiyon makas alın ve damgalı sonuna yakın delik yumurtanın içine sivri ucunu.
- Uzunlamasına tüm yumurta etrafında kesin.
NOT: halka ile CAM ve tümör penceresi ile kabuk üst yarısında ayrılmamak gerekir. - Diseksiyon makas ve forseps kullanarak, uzak CAM tümörü incelemek ve 35 x 10 mm plakasındaki tümörü yerleştirin. Tedbir ve tümörler tartın. Paraformaldehy Sabit tümörlerde ve daha sonra Histoloji ve immünohistokimya deneylerinde kullanılmak üzere bunları parafin gömmek.
5. (İsteğe bağlı): Tümör Hücre Ayrılma
- 35 x 10 mm tabak içinde tümör kıymaya diseksiyon makas kullanın. 15 ml santrifüj tüpüne kıyılmış tümör dökün ve pipetlerle mümkün olduğunca ++ kadar PBS kaldırmak.
- (PBS içinde 1 mg / ml ++) kolajenaz 2 ml ilave edilir, birkaç kez fazla tüp edecek ve (birkaç saate kadar), en az 30 dakika boyunca 37 ° C'de tüp inkübe edin.
- Her tüpe 5 ml medya ekleyin ve aşağı yukarı 20 pipetleme iyice tekrar süspansiyon - 40x. Kapsamlı pipet tam hücre ayrışma için kritik öneme sahiptir.
- Sediment yerleşmek için izin verin ve yeni bir tüp süpernatant aktarın. 5 dakika boyunca 500 x g'de santrifüjleyin. Ayrışmış hücre pelet geride bırakarak, süpernatantı.
NOT: Bu noktada, hücre topakları Çeşitli deneyler için kullanılabilir (akış sitometrisi, Western blotting, RNA izolasyonu, vs kullanım için lizis). Toplam tümör hücresi sayısı da bir hemositometre ve tripan mavi boya kullanılarak elde edilebilir. Daha küçük, oval şekilli hücreler tavuk hücreleri CAM ve tümör hücreleri gibi sayılmamalıdır unutmayın. Tümör dikkatlice CAM uzağa disseke ise non-tümör (CAM) hücreleri kirlenmesine neden asgari sayıda olmalıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokolde önemli adımlar Temsilcisi resimler burada gösterilmektedir. Şekil 1A gelişen embriyo, hava kesesi ve CAM damarsal görselleştirmek için Candler kullanımını gösterir. Şekil 1B-1C yaparak CAM bırakarak sürecini göstermek iki delik ve ardından güvenlik ampul kullanarak negatif basınç uygulayarak ve Şekil 1D bir başarıyla kalem işaretli delik altında büyük hava kabarcığı ile CAM düştü gösterir. Şekil 1E ve Şekil 1F gerekli hale getirmek için dremel döner aletin kullanımını göstermek hava kabarcığı ve içinde maruz vaskularize CAM ile kabuk açılan penceresinin üstündeki kabuk keser.
Üç boyutlu, vaskülarize tümör başarılı bir şekilde, insan HCC hücre dizileri Huh7 (Şekil 2A-2B) ve PLC / PRF / 5 (Şekil 2C-2B) kullanılarak büyütüldü. Huh7 ve PLC / PRF / 5 hücrelerinden geliştirilen tümörleri histologically farklılaşmamış HCC (Şekil 2E-2F) benzeyen ve aynı zamanda fare ksenogreft modellerinde 15,16 yetiştirilen Huh7 ve PLC / PRF / 5 tümörler benzerler. Bundan başka, tümör ağırlığı kullanımı tümör ağırlığı yüksek kolajenaz (Şekil 3) ile tümörlerin tam çözülme sonra elde edilen toplam tümör hücresi sayısı ile ilişkili olduğunu ortaya tümör büyüklüğü ölçüsü olarak doğrulanmıştır.
Bu protokolü kullanarak, en fazla% 93 embriyonik sağkalım oranları elde edildi (Tablo 1). Tablo 1 CAM ksenograft modelinde üç ayrı HCC deneyler verileri toplanmış. Başarıyla 500.000 tümör hücrelerinin (Huh7 veya PLC / PRF5) ile aşılanmış 33 yumurta toplam Out, sadece 3 yumurta, civciv embriyo ölüm% 90.9 genel sağkalım oranı sonuçlandı. Ayrıca, tümörler çok güvenilir kalan embriyolar ile yumurtaların% 100 (30/30) olarak başarıyla tümör oluşumunu vardı, 5 gün sonra büyütüldü.
Şekil 1. CAM Damlama ve Kabuğu'nda bir Pencere Açma. (A) Embriyo belirlenmesi (Mavi Ok) ve Damarlanma (Black Arrow) Kabuğu'nda bir Hole Making Candler, (B), (C) Doğal olarak meydana gelen hava Sac at Hole uygulama Emme kullanarak, (D) görselleştirme uzak Shell CAM Başarılı Bırakma gösteriliyor Air Bubble, (E - F). Dremel Rotary Aracı'nı kullanarak Kabuğu'nda bir Penceresini Açma Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2. CAM Üç boyutlu Büyüme, Vaskülarize Tümörler o Histolojik Farklılaşmamış HCC Benzemez destekler. CAM modeli, Huh7 hücreleri, 5 gün sonra (A - B) tümör büyümesi (500,000 hücre tohumlanmış) (ölçek çubuk = 1 cm), (Cı - D) CAM modelinde 5 gün sonra tümör büyümesi, PLC / PRF / 5 Hücreler (500.000 Hücreler) (ölçek bar = 1 cm), Huh7 ve PLC (E-F) Histoloji / PRF / 5, sırasıyla tümörler (ölçek bar = 100 μ m) bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız .
Hücre Sayımı. Tümör ağırlığı vs Tümör Ağırlık Şekil 3. Plot yüksek kollajenaz sonra total tümör hücre sayısı ile ilişkilidire ayrışma.
| Yumurta sayısı | Civciv embriyo sağkalım yumurta Yüzde | Tümörün Oranı kalan embriyolar ile yumurta almak | |
| Huh7 | 27 | % 92.6 (25/27), | 100 (% 25/25) |
| PLC / PRF / 5 | 6 | % 83.3 (06/05) | 100 (% 05/05) |
| Tüm | 33 | % 90.9 (30/33) | 100 (% 30/30) |
Tümör Tablo 1. Embriyonik Survival Oranları ve Oranlar İki İnsan HCC hücre hatları kullanılarak CAM Model atın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol Çeşitli önemli adımlar büyük olasılıkla gelişmiş embriyonik hayatta yanı sıra tümör büyümesi artan güvenilirlik oluşturmaktadır. Hava kesesi için emme uygulayarak uzak kabuk CAM Damlama (yumurta, künt diseksiyon, vb albümin kaldırmak için bir iğne kullanarak) diğer mevcut yöntemlere göre daha az invaziv. Bu yöntem için gerekli olan iki küçük delik oluşturmak için steril bir itme pimi kullanılarak protokolünün en zor kısmıdır. Çok fazla güç kullanarak raptiye ile aşırı penetrasyon yoluyla CAM ve damarsal hasara neden olabilir, hatta çatlama veya yumurta yok neden olabilir. Hands-on pratik bir itme pimi kullanılarak CAM bırakarak ilk girişimi sırasında yapılan hatalar en aza indirebilirsiniz olmayan döllenmiş, bakkal-satın yumurta küçük delikler yapmak. Bundan başka, etanol ya da kabuk temizlenmesi için diğer dezenfektan çözeltilerinin kullanımı embriyonik canlılığını azaltır ve kaçınılmalıdır. Son olarak, steril silikon halkasını kullanarak için &# 8220; "corral tümörün yüksek oranda tümör büyümesinde asist tohumlama ve katkı sonra belirli bir yerde tümör hücreleri bizim protokolde görülen take.
Farklı hücre hatları ve / veya ilaçlar ile çalışırken protokol kritik bazı adımlar optimizasyonu muhtemelen gerekli olacaktır. Tohum hücrelerin önerilen sayısı 0,5 ve 2 milyon arasında değişen, ama bazı hücre çizgileri iyi bir üç boyutlu bir tümör oluşturmak amacıyla daha yüksek ya da daha düşük tohum yoğunluğu gerektirebilir. Çok fazla hücre aşılama tümör tüm silikon halkasını kaplar idealdir daha düz ve daha az üç boyutlu hale gelir ve halka sınırını kaçabileceği tümör aşırı büyüme neden olurken çok az hücre aşılama, kötü tümör oluşumuna neden olabilir . Biz herhangi bir hücre hattı için optimum hücre ekim yoğunluğu belirlemek için bir ön deney kurma öneririz. Ayrıca, nitro ilaç konsantrasyonları standart bazı ayar yapılmasını gerektirmektedird. Bu CAM (60 ul) üzerinde tohumlanır toplam hacme atıfta bulunmak sureti ile ilaç konsantrasyonlarının hesaplanması, ama in vitro olarak paralel deneylerde kullanılan daha bazen "yüksek" ilaç konsantrasyonları, muhtemelen nedeniyle, tümör büyümesi üzerindeki etkilerini görmek için gerekli olan yumurta kalanına CAM ve ilacın yayılması yoluyla emilim.
Özel hücre çizgileri ve ilaçlar için protokol başarılı bir şekilde optimizasyonu sonra CAM ksenograft modeli tümör özellikleri ve hücresel mekanizmalar ve çeşitli araştırmak için kullanılabilir. Tümör büyüme ağırlık ve boyut ölçümlerinin yanı sıra toplam tümör hücre sayımları yoluyla değerlendirilebilir. Tümörler, sabit ve tümör belirteçleri ya da söz konusu spesifik proteinlerin için leke imünohistokimya tabi tutulabilir. Angiogenesis piliç özellikle endotel hücreleri 17 leke SNA1, lekeleme ile tespit edilebilir. Tümör hücreleri moleküler yolların sorgulanmak üzere lize edilebilir. Böyle ortotopik hayvan modellerinde olduğu gibi kanser daha karmaşık modelleri ile in vitro çalışmalarında saf köprü bir ara adım olarak, CAM ksenograft modeli hızla biyolojik olarak daha kültürde yetişen hücrelerden daha uygun bir ortamda veri elde etme maliyet-etkin bir yoludur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Premium incubated eggs | Charles River | N/A | http://www.criver.com/files/pdfs/avian/av_c_spf_egg_price_list.aspx |
| Egg incubators | GQF | Hova-Bator 2362N | |
| Rotating egg trays | GQF | 1611 Automatic Egg Turner | |
| Egg candler | Lyon | Hi-Power 950-070 | |
| Dremel 100 rotary tool with 15/16 cut-off wheel | Dremel | 100-N/7 | |
| Sterile forceps, push pin, dissection scissors, Scotch tape | |||
| Matrigel | BD Biosciences | 356234 | |
| Cryogenic vials, external thread with silicone washer | Corning | 430659 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma | C9891 |
References
- Sangiovanni, A., et al. Increased survival of cirrhotic patients with a hepatocellular carcinoma detected during surveillance. Gastroenterology. 126 (4), 1005-1014 (2004).
- Lopez, P. M., Villanueva, A., Llovet, J. M. Systematic review: evidence-based management of hepatocellular carcinoma--an updated analysis of randomized controlled trials. Aliment Pharmacol Ther. 23 (11), 1535-1547 (2006).
- Llovet, J. M., Burroughs, A., Bruix, J.
- Folkman, J. What is the evidence that tumors are angiogenesis dependent. J Natl Cancer Inst. 82, 4-6 (1990).
- Hagedorn, M., et al. Accessing key steps of human tumor progression in vivo by using an avian embryo model. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (5), 1643-1648 (2005).
- Dumartin, L., et al. Netrin-1 mediates early events in pancreatic adenocarcinoma progression, acting on tumor and endothelial cells. Gastroenterology. 138 (4), 1595-1606 (2010).
- Aguirre-Ghiso, J. A., Estrada, Y., Liu, D., Ossowski, L. ERK(MAPK) activity as a determinant of tumor growth and dormancy; regulation by p38(SAPK). Cancer Res. 63 (7), 1684-1695 (2003).
- Baroni, T. E., et al. Ribonomic and short hairpin RNA gene silencing methods to explore functional gene programs associated with tumor growth arrest. Methods Mol Biol. 383, 227-244 (2007).
- Lopez-Rivera, E., et al. Inducible nitric oxide synthase drives mTOR pathway activation and proliferation of human melanoma by reversible nitrosylation of TSC2. Cancer Res. 74 (4), 1067-1078 (2014).
- Balke, M., et al. A short-term in vivo model for giant cell tumor of bone. BMC Cancer. 11, 241 (2011).
- Balke, M., et al. Morphologic characterization of osteosarcoma growth on the chick chorioallantoic membrane. BMC Res Notes. 3, 58 (2010).
- Sys, G. M., et al. The in ovo CAM-assay as a xenograft model for sarcoma. J Vis Exp. (77), e50522 (2013).
- Dohle, D. S., et al. Chick ex ovo culture and ex ovo CAM assay: how it really works. J Vis Exp. (33), (2009).
- Ossowski, L., Reich, E. Experimental model for quantitative study of metastasis. Cancer Res. 40 (7), 2300-2309 (1980).
- Ghanekar, A., Ahmed, S., Chen, K., Adeyi, O. Endothelial cells do not arise from tumor-initiating cells in human hepatocellular carcinoma. BMC Cancer. 13, 485 (2013).
- Ho, J. W., et al. Effects of a novel immunomodulating agent, FTY720, on tumor growth and angiogenesis in hepatocellular carcinoma. Mol Cancer Ther. 4 (9), 1430-1438 (2005).
- Hagedorn, M., et al. VEGF coordinates interaction of pericytes and endothelial cells during vasculogenesis and experimental angiogenesis. Dev Dyn. 230 (1), 23-33 (2004).
