Abstract
Dama chorioallantoic membran (CAM) begynner å utvikle seg etter dag 7 etter befruktning og modnes etter dag 12. CAM er naturlig immunodeficient og svært vascularized, noe som gjør det til et ideelt system for tumorimplantering. Videre inneholder CAM ekstracellulære matriseproteiner slik som fibronectin, laminin, kollagen, integrin alpha (v) beta3, og MMP-2, noe som gjør den til en attraktiv modell for å studere tumorinvasjon og metastase. Forskere har lenge benyttet seg av fysiologi av CAM ved å bruke det som en modell av angiogenese. Mer nylig har CAM-testen blitt modifisert for å virke som en in vivo-xenograft modellsystem for ulike kreftformer som bygger bro mellom grunn in vitro arbeid og mer komplekse dyrekreftmodeller. CAM-testen gjør det mulig for studiet av tumorvekst, anti-tumor terapi, og pro-tumor molekylære reaksjonsveier i et biologisk relevant system som er både kostnads- og tidseffektiv. Her beskriver vi utviklingen av CAM Xenograft modell av leverkreft (HCC) med embryonale overlevelse på opp til 93% og pålitelig svulst tar fører til vekst av tredimensjonale, vaskulariserte svulster.
Introduction
Leverkreft (HCC) er den 3. største årsaken til kreftdødelighet i verden en. Foreløpig bare 30% av HCC pasienter er kvalifisert for potensielt kurativ kirurgisk behandling 2, og systemisk kjemoterapi er ikke effektiv tre. Derfor er det et presser udekket klinisk behov for nye terapier HCC, og utvikling av modellsystemer som er egnet for effektiv testing av nye midler. Dama chorioallantoic membran (CAM) assay tilveiebringer en reproduserbar, kostnadseffektiv, og rask medium-throughput fremgangsmåte for å teste potensielle anti-tumor medikamenter in vivo.
CAM-testen har blitt brukt mye til å studere angiogenese 4. Det har også blitt utviklet til en tumor xenograft modell av kreft, inkludert glioblastom 5, 6 bukspyttkjertelkreft, melanom 7-9, og osteosarkom 10-11. Både i ovo 12 og ex ovo13 teknikker har blitt anvendt i litteraturen, med detaljer som varierer fra protokollen til protokollen. En stor utfordring for CAM xenotransplantat modellen er den relativt høye forekomsten av embryonale død etter manipulasjon av egg, med publiserte chick dødelighets embryo priser som spenner 25-50 prosent 11-14.
I denne artikkelen beskriver vi å utvikle en in ovo xenograft modell av HCC som på en pålitelig måte frembringer vekst av tredimensjonale, vaskulariserte tumorer som histologisk ligner udifferensiert HCC. Vi har tilpasset en protokoll først beskrevet av Ossowski et al 14. Og har oppnådd chick embryonale overlevelse på opp til 93% med ekstremt høy tumor engraftment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Egg Inkubasjon
- Skaff 8 dager gamle patogenfrie embryon egg.
- Plasser egg i roterende egg skuff, stemplet ender vendt oppover, og plasser den roterende skuffen inni et egg inkubator. Inkuber egg i 48 timer ved 36 ° C og 50% luftfuktighet.
2. Slippe CAM og Åpne Eggs
- Samle egg fra inkubator. Plasser egg i egget rack, stemplet siden opp og bringe til laminær hette.
- Slå av rommet og hette lys.
- Hold i stemplet enden av egget forsiktig til egget Candler å eksponere vaskulaturen av CAM, så vel som luftsekken.
MERK: egg Candler er en lyskilde som brukes til å visualisere utvikling av embryo og tilhørende luftsekken og blodkar. - Plasser en blyantstrek i mellom to store blodårer.
- Slå på lysene og bruke en steril knappenålen å lage ett hull på tuppen av egget over luftsekken (stemplet slutten), og ett hull i pencil mark. Ikke skyv knappenålen hele veien gjennom; et hull rundt 3 mm dyp vil vanligvis være tilstrekkelig.
- Slå av lysene. Klem sikkerhet pære, trykke den åpne enden fast mot hullet over luftsekken. Påfør sug for å trekke luft inn i hullet på blyantstreken, slik at CAM å slippe vekk fra skallet på blyant mark.
- Sjekk at luftsekken har flyttet fra stemplet enden av egget til blyant-merket hull med Candler. Hvis det ikke har, kan du bruke knappenålen til å gjøre begge hull litt dypere og deretter søke på suge bruker sikkerhets pære.
- Skru på lysene. Holder egget i den ene hånden, slå på dremel multiverktøy med en 15/16 tommers cut-off hjul festet og lage to tverrgående kutt bare dypt nok til å skjære gjennom skallet, men ikke dypt nok til å kutte helt ned til den deprimerte CAM. Gjør kuttene rundt 2 cm i lengde og 1 cm fra hverandre. Foreta kutt bred nok slik at et silikon-ring 1 cm i diameter kan passere igjennommen tynnere enn bredden av standard scotch tape.
- Deretter må en langsgående kutt mellom og ved endene av de to tverrgående snitt ved lett berøring av kappeskiven til skallet.
- Skyv steril pinsett under skallet stykket og parallelt til skallet. Grab skallet stykke med pinsett og fjerne hele stykket renslig.
- Plasser scotch tape over den nyåpnede vinduet, og pass på å kaste den ene enden over på seg selv for å lette fjerning.
- Plasser egg tilbake i inkubatoren i egget skuffen (ikke i de roterende egg racks) inntil tidspunktet for vaksinasjon.
3. Inoculation
- Hold basalmembranproteinblandingen, slik som Matrigel, på is (for å forhindre polymerisering) og plasser i hetten.
- Bruk 2 mM EDTA for å løsne cellene (4 - 5 ml pr T75-kolbe) og plassere kolber i vevskultur-inkubator i 5 min.
- Suspender frittliggende cellene i media og telle ved hjelp av en hemocytometer og trypanblått. Bruke mellom 500 000 to 2.000.000 celler for poding på CAM, avhengig av cellelinjen. Optimalisere riktig antall i gangsetting.
- Måle volumet som kreves for passende cellenummer og sentrifuger ved 500 xg i 5 min.
- Fjern supernatant og resuspender deretter cellepelleten i 40 μ l PBS ++ og 20 μ l av basalmembran-blanding.
MERK: På dette punkt celler kan behandles med medikamenter eller andre testmidlene som trengs for eksperimenter ved resuspendering i cellen / basalmembranen blanding suspensjon. Alternativt kan midler være pipettert på celle / basalmembranen blanding suspensjon etter poding. - Hente egg rack med egg fra inkubatoren og plass i laminær hette.
- Peel tape ut av vinduet, hente en 1 mm silikon ring fra korken av en kryogenisk hette bruker sterilisert pinsett, og slippe ringen gjennom vinduet.
- Pipette 60 μ l celle løsning av PBS ++ og basalmembran MIXTURe direkte inn i sentrum av silikon ringen hviler på CAM.
- Re-tape vinduet og flytte egg stativet tilbake til inkubatoren. På dette punktet, må du være forsiktig når du flytter eggene som ringen og cellesuspensjonen kan lett bli forskjøvet.
- La svulster vokse i 5 til 7 dager.
4. Høsting Svulster
- Sett under-pad i hette. Forbered 35 x 10 mm plater og paraformaldehyd beholdere som er nødvendig for histologi. Sett 1 ml PBS ++ i hvert 35 x 10 mm plate.
- Plasser biohazard bag i hette. Ta sterile disseksjon saks og sett den spisse enden inn i egget ved hullet nær stemplet slutten.
- Skjær rundt hele egget i lengderetningen.
MERK: CAM og svulsten med ringen bør holde seg til den øverste halvdelen av skallet med vinduet. - Ved hjelp av disseksjon saks og pinsett, dissekere svulsten bort fra CAM og plasser svulst i 35 x 10 mm plate. Måle og veie svulster. Faste svulster i paraformaldehyde og deretter parafin legge dem for bruk i histologiske og immunhistokjemi eksperimenter.
5. (Valgfritt): Tumor Cell Dissosiasjon
- Bruk disseksjon saks til å hakke svulsten i 35 x 10 mm plate. Hell over hakket tumor i et 15 ml sentrifugerør og fjerne så mye som mulig PBS ++ ved pipettering.
- Tilsett 2 ml kollagenase (1 mg / ml i PBS ++), snu røret over flere ganger, og inkuber rør ved 37 ° C i minst 30 minutter (opp til flere timer).
- Tilsett 5 ml medium til hvert rør og resuspender grundig ved å pipettere opp og ned 20 - 40x. Grundig pipettering er kritisk for fullstendig celle dissosiasjon.
- Tillate sediment å bosette, og overføre supernatanten til et nytt rør. Sentrifuger ved 500 xg i 5 minutter. Fjern supernatant, etterlater dissosierte cellepellet.
MERK: På dette punktet, kan celle-pellets brukes til ulike eksperimenter (flowcytometri, lyse for anvendelse ved Western blotting, RNA isolering, etc). Total tumorceller kan også bli oppnådd ved anvendelse av et hemocytometer og trypanblått-farving. Legg merke til at mindre, ovale celler er kylling celler fra CAM, og bør ikke bli regnet som kreftceller. Det bør være et minimalt antall av kontaminerende ikke-tumor (CAM) hvis celler tumoren ble dissekert vekk fra CAM nøye.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Representative bilder av viktige trinnene i protokollen er vist her. Figur 1A viser bruken av den Candler å visualisere utviklingen av embryo, luftsekken, og vaskulaturen av CAM. Figur 1B-1C viser prosessen med å slippe CAM ved å gjøre de to hull og deretter påføring av negativt trykk ved hjelp av sikkerhets pære, og Figur 1D viser et vellykket falt CAM med en stor luftboble under blyant-merket hullet. Figur 1E og Figur 1F viser bruken av Dremel roterende verktøy for å foreta de nødvendige kutt i skallet over luftboblen og åpne vinduet i skallet med den eksponerte vaskularisert CAM innenfor.
Tredimensjonal, vaskulariserte tumorer ble med hell dyrket ved hjelp av de humane cellelinjer HCC HUH7 (figur 2A-2B) og PLC / PRF / 5 (figur 2C-2D). Svulster vokst fra HUH7 og PLS / PRF / 5 celler histologically likne udifferensiert HCC (figur 2E-2F) og også likne HUH7 og PLS / PRF / 5 svulster dyrket i mus xenograft modeller 15,16. Videre ble ved bruk av tumorvekten validert som en måling av tumorstørrelse ved å vise at tumorvekt var sterkt korrelert med total tumor celletall ble oppnådd etter fullstendig dissosiasjon av tumorer ved hjelp av kollagenase (figur 3).
Ved hjelp av denne protokollen, ble embryonale overlevelse på opp til 93% oppnådd (tabell 1). Tabell 1 viser aggregerte data fra tre separate HCC eksperimenter i CAM xenograft modell. Av totalt 33 egg som ble vellykket podet med 500.000 tumorceller (HUH7 eller PLC / PRF5), bare 3 egg resulterte i kylling embryo død, en total overlevelsesrate på 90,9%. Videre tumorer ble meget pålitelig dyrket etter 5 dager, som 100% (30/30) av egg med embryo overlevende hadde vellykket tumordannelse.
Figur 1. Slippe CAM og åpne et vindu i Shell. (A) Identifikasjon av Embryo (blå pil) og blodkar (svart pil) ved hjelp av Candler, (B) Å gjøre en Hole in the Shell, (C) Søknad Suge til Hole på naturlig forekommende Air Sac, (D) Visualisering Air Bubble Viser Vellykket Dropping av CAM bort fra Shell, (E - F). åpne et vindu i Shell bruker Dremel multiverktøy Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. CAM Støtter Vekst av Tredimensjonal, vaskulariserte Svulster som Histologisk Ligne Undifferentiated HCC. (A - B) Tumorvekst etter 5 dager i CAM-modellen, HUH7-celler (500,000 celler utsådd) (skala barer = 1 cm), (C - D) Tumorvekst etter 5 dager i CAM-modellen, PLC / PRF / 5 celler (500.000 celler seeded) (skala barer = 1 cm), (E-F) Histologi av HUH7 og PLS / PRF / 5 svulster, henholdsvis (skala barer = 100 μ m) Klikk her for å se en større versjon av dette tallet .
Figur 3. Plot av Tumor Vekt vs. legemer. Tumor vekt er sterkt korrelert med total tumor celletall etter collagenase dissosiasjon.
| Totalt antall egg | Prosent av egg med kyllingembryo overlevelse | Valuta svulst ta i egg med overlevende embryoer | |
| HUH7 | 27 | 92,6% (25/27) | 100% (25/25) |
| PLC / PRF / 5 | 6 | 83,3% (5/6) | 100% (5/5) |
| Samlet | 33 | 90,9% (30/33) | 100% (30/30) |
Tabell 1. overlevelse av embryo priser og priser av Tumor Ta i CAM Model bruker to menneskelige HCC cellelinjer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Flere viktige skritt i denne protokollen mest sannsynlig står for den forbedrede embryonale overlevelse samt økt pålitelighet av tumorvekst. CAM slippe vekk fra skallet ved å påføre sugekraft til luftsekken er mindre inngrep enn andre eksisterende metoder (ved hjelp av en nål for å fjerne albumin fra egget, stump disseksjon, etc.). Ved hjelp av en steril nål for å skape trykk de to små hull som kreves for denne metoden er den mest krevende delen av protokollen. Bruke for mye kraft kan føre til skade på CAM og dens blodkar gjennom over-penetrasjon med knappenålen eller kan til og med føre til sprekkdannelser eller ødelegge egget. Hands-on praksis ved hjelp av en push pin for å lage små hull i ikke-befruktede, dagligvare-kjøpte egg kan minimere feil som blir gjort i løpet av det første forsøket på å slippe CAM. Videre er bruk av etanol eller andre desinfiserende løsninger for å rense skall avtar embryoniske levedyktighet, og bør unngås. Til slutt, ved hjelp av sterilt silikon ring til &# 8220; innhegningen "kreftceller på ett bestemt sted etter seeding bistår i tumorvekst og bidrar til den høye frekvensen av tumor ta sett i vår protokoll.
Noen optimalisering av kritiske trinn i protokollen vil mest sannsynlig være nødvendig når du arbeider med ulike cellelinjer og / eller narkotika. Den foreslåtte antall celler for såing av frø er mellom 0,5 og 2 millioner, men noen cellelinjer kan kreve høyere eller lavere seeding densiteter for å danne en fin, tredimensjonal tumor. Poding for få celler kan føre til dårlig tumordannelsen, samtidig som poding for mange celler kan føre til tumorvekst hvor tumoren opptar hele silikon ring, blir flatere og mindre tredimensjonale enn ideell, og kan unnslippe grensen av ringen . Vi anbefaler å sette opp en foreløpig eksperiment for å bestemme den optimale celle seeding tetthet for en bestemt cellelinje. Videre kan noen justering standard in vitro legemiddelkonsentrasjoner skal kreved. Vi beregner medikamentkonsentrasjoner med henvisning til det totale volum som blir sådd ut på CAM (60 pl), men noen ganger "høyere" medikamentkonsentrasjoner enn de som brukes i parallelle forsøk in vitro er nødvendig for å se effekt på tumorvekst, sannsynligvis på grunn absorpsjon gjennom CAM og spredning av medikamentet til resten av egget.
Etter vellykket optimalisering av protokollen for spesifikke cellelinjer og medikamenter kan CAM xenograft modell brukes til å undersøke et bredt spekter av tumoregenskaper og cellulære mekanismer. Tumorvekst kan vurderes gjennom vekt og størrelse målinger samt total tumorceller. Svulster kan være fast og utsatt for immunhistokjemi å farge for tumormarkører eller spesifikke proteiner av interesse. Angiogenese kan vurderes ved farging for SNA1, som spesifikt flekker chick endotelceller 17. Tumorceller kan lysert for avhør av molekylære stier. Som et mellomtrinn i å bygge bro ren in vitro arbeid med mer komplekse modeller for kreft som ortotopiske dyremodeller, er CAM xenograft modell en kostnadseffektiv måte å raskt skaffe data i en innstilling som er mer biologisk relevant enn celler dyrket i kultur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Premium incubated eggs | Charles River | N/A | http://www.criver.com/files/pdfs/avian/av_c_spf_egg_price_list.aspx |
| Egg incubators | GQF | Hova-Bator 2362N | |
| Rotating egg trays | GQF | 1611 Automatic Egg Turner | |
| Egg candler | Lyon | Hi-Power 950-070 | |
| Dremel 100 rotary tool with 15/16 cut-off wheel | Dremel | 100-N/7 | |
| Sterile forceps, push pin, dissection scissors, Scotch tape | |||
| Matrigel | BD Biosciences | 356234 | |
| Cryogenic vials, external thread with silicone washer | Corning | 430659 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma | C9891 |
References
- Sangiovanni, A., et al. Increased survival of cirrhotic patients with a hepatocellular carcinoma detected during surveillance. Gastroenterology. 126 (4), 1005-1014 (2004).
- Lopez, P. M., Villanueva, A., Llovet, J. M. Systematic review: evidence-based management of hepatocellular carcinoma--an updated analysis of randomized controlled trials. Aliment Pharmacol Ther. 23 (11), 1535-1547 (2006).
- Llovet, J. M., Burroughs, A., Bruix, J. Hepatocellular carcinoma. Lancet. 362 (9399), 1907-1917 (2003).
- Folkman, J. What is the evidence that tumors are angiogenesis dependent. J Natl Cancer Inst. 82, 4-6 (1990).
- Hagedorn, M., et al. Accessing key steps of human tumor progression in vivo by using an avian embryo model. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (5), 1643-1648 (2005).
- Dumartin, L., et al. Netrin-1 mediates early events in pancreatic adenocarcinoma progression, acting on tumor and endothelial cells. Gastroenterology. 138 (4), 1595-1606 (2010).
- Aguirre-Ghiso, J. A., Estrada, Y., Liu, D., Ossowski, L. ERK(MAPK) activity as a determinant of tumor growth and dormancy; regulation by p38(SAPK). Cancer Res. 63 (7), 1684-1695 (2003).
- Baroni, T. E., et al. Ribonomic and short hairpin RNA gene silencing methods to explore functional gene programs associated with tumor growth arrest. Methods Mol Biol. 383, 227-244 (2007).
- Lopez-Rivera, E., et al. Inducible nitric oxide synthase drives mTOR pathway activation and proliferation of human melanoma by reversible nitrosylation of TSC2. Cancer Res. 74 (4), 1067-1078 (2014).
- Balke, M., et al. A short-term in vivo model for giant cell tumor of bone. BMC Cancer. 11, 241 (2011).
- Balke, M., et al. Morphologic characterization of osteosarcoma growth on the chick chorioallantoic membrane. BMC Res Notes. 3, 58 (2010).
- Sys, G. M., et al. The in ovo CAM-assay as a xenograft model for sarcoma. J Vis Exp. (77), e50522 (2013).
- Dohle, D. S., et al. Chick ex ovo culture and ex ovo CAM assay: how it really works. J Vis Exp. (33), (2009).
- Ossowski, L., Reich, E. Experimental model for quantitative study of metastasis. Cancer Res. 40 (7), 2300-2309 (1980).
- Ghanekar, A., Ahmed, S., Chen, K., Adeyi, O. Endothelial cells do not arise from tumor-initiating cells in human hepatocellular carcinoma. BMC Cancer. 13, 485 (2013).
- Ho, J. W., et al. Effects of a novel immunomodulating agent, FTY720, on tumor growth and angiogenesis in hepatocellular carcinoma. Mol Cancer Ther. 4 (9), 1430-1438 (2005).
- Hagedorn, M., et al. VEGF coordinates interaction of pericytes and endothelial cells during vasculogenesis and experimental angiogenesis. Dev Dyn. 230 (1), 23-33 (2004).
