Abstract
La membrana corioalantoidea de pollo (CAM) comienza a desarrollarse el día 7 después de la fecundación y madura por día 12. El CAM es naturalmente inmunodeficientes y altamente vascularizado, por lo que es un sistema ideal para la implantación del tumor. Además, la CAM contiene proteínas de matriz extracelular tales como fibronectina, laminina, colágeno, la integrina alfa (v) beta3, y MMP-2, por lo que es un modelo atractivo para estudiar la invasión tumoral y la metástasis. Los científicos han tardado mucho provecho de la fisiología de la CAM utilizando como modelo de la angiogénesis. Más recientemente, el ensayo de CAM se ha modificado para que funcione como un sistema modelo de xenoinjerto in vivo para varios tipos de cáncer que sirve de puente entre el trabajo básico in vitro y modelos animales de cáncer más complejos. El ensayo de CAM permite el estudio del crecimiento del tumor, las terapias anti-tumorales, y pro-tumorales vías moleculares en un sistema biológicamente relevante que es a la vez en tiempo y costo efectiva. Aquí se describe el desarrollo de la CAM xenograft modelo de carcinoma hepatocelular (HCC) con tasas de supervivencia de embriones de hasta 93% y tumor fiable tomar conduce al crecimiento de los tumores en tres dimensiones, vascularizados.
Introduction
El carcinoma hepatocelular (CHC) es la 3ª causa de mortalidad por cáncer en el mundo 1. Actualmente sólo el 30% de los pacientes con HCC son elegibles para los tratamientos quirúrgicos potencialmente curativos 2, y la quimioterapia sistémica no es eficaz 3. Por lo tanto, hay una necesidad apremiante insatisfecha clínico para nuevas terapias HCC, y el desarrollo de sistemas de modelos adecuados para la prueba eficiente de nuevos agentes. La membrana corioalantoidea (CAM) de ensayo polluelo proporciona un método reproducible y rentable, y rápido rendimiento medio de probar posibles fármacos anti-tumorales in vivo.
El ensayo de CAM se ha utilizado ampliamente para estudiar la angiogénesis 4. También se ha desarrollado con éxito en un modelo de xenoinjerto de tumor de cánceres, incluyendo glioblastoma 5, el cáncer de páncreas 6, melanoma 7-9, y osteosarcoma 10-11. Tanto in ovo 12 y ex ovo13 técnicas se han utilizado en la literatura, con detalles que varían de un protocolo a otro. Un gran desafío para el modelo de xenoinjerto CAM es la relativamente alta incidencia de muerte embrionaria después de la manipulación del huevo, con tasas de mortalidad de embriones de pollo publicados que van desde 25 hasta 50 por ciento de 11 a 14.
En este artículo se describe el desarrollo de un modelo de xenoinjerto in ovo de CHC que produce de forma fiable el crecimiento de tumores vascularizados tridimensionales que histológicamente se asemejan a HCC indiferenciado. Hemos adaptado un protocolo descrito por primera Ossowski et. Al 14 y han logrado de embriones de pollo tasas de supervivencia de hasta el 93% con extremadamente alta injerto tumor.
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Protocol
La incubación 1. Huevo
- Obtener 8 días de edad huevos embrionados libres de patógenos específicos.
- Coloque los huevos en rotación bandeja de huevos, extremos estampadas hacia arriba y coloque la bandeja giratoria dentro de una incubadora de huevos. Incubar los huevos durante 48 horas a 36 ° C y 50% de humedad.
2. Dejar caer la CAM y la apertura de los huevos
- Recoger los huevos de la incubadora. Coloque los huevos en la canasta de huevos, estampadas hacia arriba, y llevar ante la campana de flujo laminar.
- Apague las luces de la sala y la capilla.
- Mantenga el extremo sellado del huevo ligeramente a la candler huevo para exponer la vasculatura de la CAM, así como el saco de aire.
NOTA: El candler huevo es una fuente de luz que se utiliza para visualizar el desarrollo del embrión y el saco de aire asociado y la vasculatura. - Coloque una marca de lápiz a entre dos grandes vasos sanguíneos.
- Encienda las luces y usar un alfiler estéril para hacer un agujero en la punta del huevo por encima de la salida de aire (extremo sellado) y un agujero en el PEmarca NCIL. No empuje el pasador de empuje hasta el final; un agujero de unos 3 mm de profundidad suele ser suficiente.
- Apagar las luces. Apriete la bombilla de seguridad, presionando firmemente el extremo abierto contra el agujero por encima de la bolsa de aire. Aplicar succión para extraer el aire en el agujero en la marca de lápiz, haciendo que la CAM caiga fuera de la concha en la marca de lápiz.
- Compruebe que la bolsa de aire se ha movido desde el extremo sellado del huevo al agujero lápiz marcada con el Candler. Si no es así, utilice el alfiler para hacer dos agujeros un poco más profundo y luego volver a aplicar el vacío utilizando la bombilla seguridad.
- Enciende las luces. Sostener el huevo en una mano, active la herramienta rotativa Dremel con un disco de corte 15/16 pulgadas conectado y crea dos cortes transversales lo suficiente profundo para cortar a través de la cáscara, pero no lo suficientemente profundo para cortar todo el camino a la depresión CAM. Haga los cortes alrededor de 2 cm de longitud y 1 cm de distancia entre sí. Haga los cortes lo suficientemente amplia como para que un anillo de silicona de 1 cm de diámetro puede pasar a través depero más delgado que la anchura de cinta adhesiva estándar.
- A continuación, hacer 1 corte longitudinal entre y en los extremos de los dos cortes transversales tocando ligeramente la rueda de corte a la cáscara.
- Deslice pinzas estériles debajo de la pieza de shell y paralelo a la cáscara. Coge la pieza de concha con las pinzas y quitar toda la pieza limpiamente.
- Coloque cinta adhesiva sobre la nueva ventana abierta, por lo que asegúrese de doblar un extremo sobre sí misma para facilitar su extracción.
- Coloque los huevos de vuelta en la incubadora en la bandeja de huevos (NO en los bastidores de huevo rotativas) hasta el momento de la inoculación.
3. Inoculación
- Mantenga sótano mezcla de proteínas de membrana, como matrigel, en hielo (para evitar la polimerización) y el lugar en el capó.
- Utilice EDTA 2 mM para desprender las células (4 - 5 ml por matraz T75) y matraces de cultivo de tejidos en lugar incubadora durante 5 min.
- Resuspender las células desprendidas en los medios de comunicación y contar utilizando un hemocitómetro y azul de tripano. Usar entre 500.000 to 2.000.000 de células de injerto sobre la CAM, dependiendo de la línea celular. Optimizar el número apropiado en experimentos preliminares.
- Medir el volumen requerido para el número de células apropiadas y centrifugar a 500 xg durante 5 min.
- Desechar el sobrenadante y resuspender a continuación, sedimento celular en 40 μ l de PBS ++ y 20 μ l de mezcla de membrana basal.
NOTA: En este punto, las células puede ser tratada con fármacos u otros agentes de prueba según sea necesario para los experimentos mediante la resuspensión en la célula / sótano suspensión mezcla de membrana. Alternativamente, los agentes se pueden pipeta en la célula / sótano suspensión mezcla de membrana después del injerto. - Recuperar estante huevo con huevos de la incubadora y lugar en la campana de flujo laminar.
- Cinta Despegue de la ventana, recuperar un anillo de silicona 1 mm de la tapa de un vial criogénico utilizando pinzas esterilizadas, y colocar el anillo a través de la ventana.
- Pipetear la solución l celular 60 μ de PBS ++ y membrana basal Mixture directamente en el centro del anillo de silicona que descansa sobre la CAM.
- Re-cinta de la ventana y mover estante huevo de nuevo a la incubadora. En este punto, tenga cuidado al mover los huevos como el anillo y la suspensión celular fácilmente pueden quedar desplazados.
- Permitir que los tumores crezcan durante 5 a 7 días.
4. Recolección de Tumores
- Coloque bajo-pad en la capucha. Preparar 35 x 10 mm platos y recipientes paraformaldehído según sea necesario para la histología. Ponga 1 ml de PBS ++ en cada placa de 35 mm x 10.
- Coloque la bolsa de riesgo biológico en el capó. Tome las tijeras de disección estéril e introduzca el extremo puntiagudo en el huevo en el agujero cerca del extremo sellado.
- Corte alrededor de todo el huevo longitudinalmente.
NOTA: la CAM y el tumor con el anillo deben atenerse a la mitad superior de la carcasa con la ventana. - Con unas tijeras de disección y pinzas, diseccionar el tumor fuera de la CAM y el lugar del tumor en la placa de 35 mm x 10. Medir y pesar tumores. Tumores fijos en paraformaldehyellos incrustar en parafina de y para su uso en histología e inmunohistoquímica experimentos.
5. (Opcional): Disociación Celular Tumoral
- Con unas tijeras de disección para picar el tumor en la placa de 35 mm x 10. Vierta tumor picada en un tubo de centrífuga de 15 ml y eliminar la mayor cantidad de PBS ++ como sea posible a través de la pipeta.
- Añadir 2 ml de colagenasa (1 mg / ml en PBS ++), gire tubo varias veces, y se incuba el tubo a 37 ° C durante al menos 30 min (hasta varias horas).
- Añadir 5 ml de medio a cada tubo y resuspender a fondo por pipeteando arriba y abajo 20 - 40x. Pipeteado a fondo es crítico para la disociación celular completa.
- Deje que el sedimento se asiente, y transferir el sobrenadante a un tubo nuevo. Centrifugar a 500 xg durante 5 min. Aspirar el sobrenadante, dejando tras de sedimento celular disociada.
NOTA: En este punto, los sedimentos celulares se pueden utilizar para diversos experimentos (citometría de flujo, la lisis para su uso en la transferencia Western, aislamiento de ARN, etc). Recuento total de células tumorales también se puede obtener usando un hemocitómetro y tinción con azul de tripano. Tenga en cuenta que, células de forma ovalada más pequeñas son las células de pollo de la CAM y no deben ser considerados como células tumorales. Debe haber un número mínimo de contaminación de las células no tumorales (CAM) si el tumor se diseca lejos de la CAM con cuidado.
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Representative Results
Imágenes representativas de los pasos clave en el protocolo se muestran aquí. Figura 1A muestra el uso de la candler visualizar el embrión en desarrollo, el saco de aire, y la vasculatura de la CAM. Figura 1B-1C muestran el proceso de abandonar la CAM al hacer los dos orificios y luego aplicando presión negativa utilizando la bombilla de seguridad, y la Figura 1d muestra una eliminado satisfactoriamente CAM con una gran burbuja de aire bajo el orificio de lápiz marcada. Figura 1E y la Figura 1F demuestran el uso de la herramienta rotativa Dremel para hacer la necesaria cortes en la cáscara por encima de la burbuja de aire y la ventana abierta en la cáscara con la CAM vascularizado expuesta dentro.
Tumores tridimensional, vascularizados fueron cultivadas con éxito utilizando las líneas celulares de HCC humano Huh7 (Figura 2A-2B) y PLC / PRF / 5 (Figura 2C-2D). Los tumores que crecen a partir HUH7 y PLC / PRF 5 células / histologically asemejarse HCC indiferenciada (Figura 2E-2F) y también se asemejan HUH7 y PLC / PRF / 5 tumores que crecen en los modelos de xenoinjertos de ratón 15,16. Además, el uso de peso del tumor fue validado como una medida del tamaño del tumor mediante la demostración de que el peso del tumor fue altamente correlacionado con el recuento total de células tumorales obtenido después de la disociación completa de los tumores utilizando colagenasa (Figura 3).
Usando este protocolo, se alcanzaron tasas de supervivencia de embriones de hasta 93% (Tabla 1). La Tabla 1 muestra los datos agregados a partir de tres experimentos separados HCC en el modelo de xenoinjerto de CAM. De un total de 33 huevos que fueron injertados con éxito con 500.000 células tumorales (Huh7 o PLC / PRF5), a sólo 3 huevos resultaron en embrión de pollo de la muerte, una tasa de supervivencia general de 90,9%. Además, los tumores fueron crecido muy fiable después de 5 días, ya que el 100% (30/30) de los huevos con embriones sobreviven tenido éxito la formación de tumores.
Figura 1. Caída de la CAM y de apertura de una ventana en el Shell. (A) Identificación de Embriones (flecha azul) y la vasculatura (Negro Arrow) utilizando el Candler, (B) Hacer un agujero en el Shell, (C) La aplicación de succión al agujero en el origen natural Aire Sac, (D) Visualización la burbuja de aire Mostrando caída exitosa de la CAM lejos de la Shell, (E - F). La apertura de una ventana en el Shell de uso de la herramienta rotativa Dremel Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. La CAM apoya el crecimiento de tres dimensiones, vascularizados tumores que Histológicamente se asemeja a HCC indiferenciado. (A - B) El crecimiento del tumor después de 5 días en el modelo de CAM, las células Huh7 (500.000 células sembradas) (barras de escala = 1 cm), (C - D) El crecimiento del tumor después de 5 días en el modelo de CAM, PLC / PRF / 5 células (500.000 células sembradas) (barras de escala = 1 cm), (E-F) Histología de HUH7 y PLC / PRF / 5 tumores, respectivamente (barras de escala = 100 μ m) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura .
Figura 3. Parcela de tumor Peso vs. recuento de células. El peso del tumor está altamente correlacionado con el recuento total de células tumorales después collagenase disociación.
| Número total de huevos | Porcentaje de huevos con la supervivencia del embrión de pollo | Tasa de tumor tomar en huevos con embriones que sobreviven | |
| HUH7 | 27 | 92,6% (25/27) | 100% (25/25) |
| PLC / PRF / 5 | 6 | 83,3% (5/6) | 100% (5/5) |
| En general | 33 | 90,9% (30/33) | 100% (30/30) |
Tabla 1. embrionarias supervivencia Precios y Tarifas de tumor Tome en la CAM Modelo usando Dos HCC humano líneas celulares.
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Discussion
Varios pasos clave en este protocolo muy probablemente explican la mejora de la supervivencia embrionaria, así como una mayor fiabilidad de crecimiento del tumor. Dejar caer la CAM alejado de la cáscara aplicando succión a la bolsa de aire es menos invasivo que otros métodos existentes (utilizando una aguja para extraer la albúmina del huevo, disección roma, etc.). El uso de un alfiler estéril para crear los dos pequeños agujeros necesarios para este método es la parte más difícil del protocolo. El uso de una fuerza excesiva puede resultar en daños a la CAM y su vasculatura a través de más penetración con el pasador de empuje o incluso puede causar grietas o destruir el huevo. Manos a la práctica utilizando un alfiler para hacer pequeños agujeros en, huevos comestibles comprados no fertilizados pueden minimizar los errores cometidos durante el primer intento de dejar caer la CAM. Además, el uso de etanol o de otras soluciones desinfectantes para limpiar la cáscara disminuye la viabilidad embrionaria, y debe ser evitado. Por último, mediante el anillo de silicona estéril a &# 8220; corral "las células tumorales en un lugar específico después de la siembra asistencias en el crecimiento del tumor y contribuye a la alta tasa de tumor tomar visto en nuestro protocolo.
Lo más probable es que se requiere una optimización de los pasos críticos en el protocolo cuando se trabaja con diferentes líneas celulares y / o drogas. El número sugerido de células para la siembra está entre 0,5 y 2 millones, pero algunas líneas celulares puede requerir densidades de siembra mayores o menores para formar un tumor agradable, tridimensional. El injerto muy pocas células puede resultar en la formación de tumores pobres, mientras que el injerto de demasiadas células puede resultar en crecimiento excesivo del tumor en el que el tumor ocupa todo el anillo de silicona, se hace más plana y menos tridimensional que es ideal, y puede escapar el límite del anillo . Se recomienda la creación de un experimento preliminar para determinar la densidad de siembra de células óptima para cualquier línea celular particular. Por otra parte, un cierto ajuste a la norma en las concentraciones de fármaco in vitro se puede requiered. Calculamos las concentraciones de fármaco en relación con el volumen total que se sembraron en la CAM (60 l), pero a veces se requiere concentraciones de fármaco "superiores" que las utilizadas en experimentos paralelos in vitro con el fin de ver los efectos sobre el crecimiento del tumor, presumiblemente debido a absorción a través de la CAM y la dispersión de fármaco al resto del huevo.
Después de la optimización exitosa del protocolo para las líneas celulares y fármacos específicos, el modelo de xenoinjerto de CAM se puede utilizar para investigar una amplia variedad de propiedades y mecanismos celulares tumorales. El crecimiento del tumor se puede evaluar a través de mediciones de peso y talla, así como el recuento total de células tumorales. Los tumores pueden ser fijos y se sometieron a inmunohistoquímica para manchar para los marcadores tumorales o proteínas específicas de interés. La angiogénesis puede ser evaluada por tinción para SNA1, que tiñe específicamente las células endoteliales de pollo 17. Las células tumorales pueden ser lisadas para la interrogación de las vías moleculares. Como paso intermedio en la reducción de puros en el trabajo in vitro con más modelos complejos de cáncer, tales como modelos animales ortotópico, el modelo de xenoinjerto CAM es una manera rentable de obtener rápidamente los datos en un entorno que es biológicamente más relevante que las células cultivadas en la cultura.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Premium incubated eggs | Charles River | N/A | http://www.criver.com/files/pdfs/avian/av_c_spf_egg_price_list.aspx |
| Egg incubators | GQF | Hova-Bator 2362N | |
| Rotating egg trays | GQF | 1611 Automatic Egg Turner | |
| Egg candler | Lyon | Hi-Power 950-070 | |
| Dremel 100 rotary tool with 15/16 cut-off wheel | Dremel | 100-N/7 | |
| Sterile forceps, push pin, dissection scissors, Scotch tape | |||
| Matrigel | BD Biosciences | 356234 | |
| Cryogenic vials, external thread with silicone washer | Corning | 430659 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma | C9891 |
References
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