Summary
Hier präsentieren wir ein Protokoll, um kontinuierlich zu quantifizieren Zelladhäsion und de-Klebeprozesse mit hoher zeitlicher Auflösung in eine nicht-invasive Weise durch Zell-Substrat-Impedanz und Live Cell Imaging analysiert. Diese Ansätze zeigen die Dynamik der Zelladhäsion / de-Klebeverfahren durch Matrixmodifikation und ihre zeitliche Beziehung, um die Haftung abhängige Signalereignisse ausgelöst.
Abstract
Zell-Matrix-Adhäsion spielt eine wichtige Rolle bei der Kontrolle der Zellmorphologie und Signalisierung. Reize, Zellmatrixadhäsion (zB Myeloperoxidase und anderen Matrix modifizierende Oxidantien / Enzyme während der Entzündung freigesetzt) stören an der Auslösung pathologischen Veränderungen der zellulären Funktion, Phänotyp und Lebensfähigkeit in einer Reihe von Krankheiten in Verbindung gebracht. Hier beschreiben wir, wie Zell-Substrat-Impedanz und Live Cell Imaging Ansätze kann leicht verwendet werden, um Echtzeit-Änderungen der Zelladhäsion und de-Haftung durch Matrixmodifikation induzierte genau zu quantifizieren (unter Verwendung von Endothelzellen und Myeloperoxidase als pathophysiologische Matrix-modifizierende Stimulus) mit hoher zeitlicher Auflösung und in einer nicht-invasiven Weise. Die xCELLigence Zell-Substrat-Impedanzsystem kontinuierlich quantifiziert den Bereich der Zell-Matrix-Adhäsion durch die Messung der elektrischen Impedanz bei der Zell-Substrat-Grenzfläche in den Zellen auf Goldmikroelektrodenarrays gezüchtet. Bildanalyse von Zeitraffer-differenTiAl-Interferenzkontrastfilme quantifiziert Veränderungen der projizierten Fläche der einzelnen Zellen über die Zeit, die Änderungen im Bereich der Zellenmatrix-Kontakt. Beide Techniken genau zu quantifizieren schnelle Änderungen an der Zelladhäsion und de-Klebeverfahren. Zell-Substrat-Impedanz auf Mikroelektroden-Biosensor-Arrays liefert eine robuste Plattform für Hochdurchsatz-Messungen. Live Cell Imaging Analysen liefern zusätzliche Details über die Art und Dynamik der morphologischen Veränderungen von Zell-Substrat-Impedanzmessungen quantifiziert. Diese komplementäre Ansätze liefern wertvolle neue Einblicke in die Myeloperoxidase oxidative Veränderung der subzellulären extrazelluläre Matrixkomponenten löst schnellen Veränderungen bei der Zelladhäsion, Morphologie und Signalübertragung in Endothelzellen. Diese Ansätze sind auch anwendbar für die Untersuchung der zellulären Adhäsion Dynamik in Abhängigkeit von einer anderen Matrix-modifizierenden Stimuli und den damit verbundenen anhaftenden Zellen (beispielsweise Epithelzellen).
Introduction
Für die Wartung der Gewebshomöostase sind stabile Klebe Kontakte zwischen Zellen und ihrer Umgebung extrazellulären Matrix erforderlich. Sie spielt beispielsweise endothelialen Zelladhäsion an der subendothelialen Matrix, in die Blutgefäße eine kritische Rolle bei der Aufrechterhaltung der Integrität der endothelialen Schicht und ihre homöostatischen Funktion als Regelungs semipermeable Gefäßschranke 1. Aktinzytoskeletts mechanisch gekoppelt Matrixmoleküle an Stellen von Zell-Matrix-Haftung und eine Kontakten an der Zellmatrix-Grenzflächenkleber spielen eine wichtige Rolle bei der Bestimmung der Position der Zellmembran durch Widerstand zentral gerichteten Actomyosin Zugkräfte. Extrazelluläre Stimuli Zellmatrixadhäsion verändern das Gleichgewicht der Kräfte an der Zell-Matrix-Schnittstelle, ein Ereignis, das schnell ist notwendigerweise verändern '' erfaßt durch mechanosensitive Signalproteine, was bei der Übertragung von "außen nach innen Signalisieren". Das Übersprechen Wetteween Zellen und ihre umgebenden extrazellulären Matrix spielt eine Schlüsselrolle bei der Kontrolle der Zellform, Motilität, Funktion, Proliferation und Überleben 2.
Diverse pathophysiologischen Prozessen (embryonalen Entwicklung, Entzündung, Wundheilung und Krebsmetastasen) durch dynamische Umgestaltung der Klebermatrix Substraten durch Matrix-abbauenden Oxidationsmittel und / oder Enzyme 3,4 gekennzeichnet. Zum Beispiel, Klebe subendothelialen Matrix Proteine in den Blutgefäßen (zB Fibronektin) werden als Hauptziele für eine Änderung oder Abbau im menschlichen entzündlichen Erkrankungen aufgrund der lokalisierten Produktion von reaktiven Oxidantien beteiligt (zB Hypochlorsäure, HOCl) durch die Leukozyten stammende Enzym Myeloperoxidase (MPO), das innerhalb des Subendothel bei entzündlichen Gefäßerkrankungen (Abbildung 1) 5-9 ansammelt. Veränderungen Zellmatrixadhäsion von MPO abgeleiteten Oxidationsmitteln und anderen Matrix modifizierende Stimuli induziert werden likEly wichtige Rollen in Ändern vaskulären Homöostase bei einer Vielzahl von pathologischen Prozessen spielen, zB durch Verändern endothelialen Zellsignalisierung, Morphologie und Lebensfähigkeit, was wiederum stört Endothelfunktion und Barrierenintegrität. Jedoch werden die morphologischen und Zellsignalantworten der adhärenten Zellen an extrazelluläre Matrix-Änderungen erst beginnt zu verstehen.
Um zu verstehen wie Matrix Änderungen treiben Veränderungen in Zelladhäsion Dynamik und Haftung abhängigen Zelle Signalwege, sind Techniken erforderlich, dass Veränderungen in der Zell-Matrix-Adhäsion in Echtzeit genau zu quantifizieren, mit hoher zeitlicher Auflösung. Hier beschreiben wir komplementären Zell-Substrat-Impedanz und lebenden Zellen Techniken, die diese Kriterien erfüllen, und eine Plattform, um die Zellhaftung und de-Adhäsionsvorgänge in einer nicht-invasiven Weise zu quantifizieren.
Wir zeigen, wie diese Zell-Substrat-Impedanz und Live Cell Imaging approSchmerzen können leicht zu (i) verwendet werden, die Dynamik der Zellhaftung zu überwachen und zu verbreiten (dh De-novo-Zell-Adhäsion) auf native und modifizierte Matrix Substraten und (ii), die Dynamik der Zell-Matrix-Ablösung zu messen (dh de-Haftung ) von anhaftenden Zellen zu Matrix-modifizierende Reizen ausgesetzt. Das xCELLigence Zell-Substrat-Impedanz-Biosensor-System bietet eine kontinuierliche Messung der Bereich der Zell-Matrix-Kontakt durch die Quantifizierung der elektrischen Impedanz an der Oberfläche des 96-Loch-Gold-Mikroelektroden-Arrays und drückt diese elektrischen Impedanzmessungen als "Zell Index", ein dimensionsloser Wert, ist weitgehend proportional zu der Fläche der Zell-Substrat-Kontakt 10 (Figur 2), aber doch in der empfindlich gegenüber Änderungen in der durchschnittlichen Entfernung zwischen dem (isolierend) Zellmembran und der Elektrodenoberfläche 11. Ein weiterer Anstieg der Zellenindexwerte ist auch bei der Bildung des engen Zell-Zell-Kontakte erreicht That beschränken para Strom fließt, 11 Bedingungen, die nicht im Rahmen der in dieser Studie beschriebenen Experimente durchsetzen müssen. Messung der projizierten Fläche der einzelnen Zellen über die Zeit durch Bildanalyse von Zeitraffer Differential-Interferenz-Kontrast (DIC) Filme eine komplementäre Messung der Veränderungen im Bereich der Zell-Substrat-Kontakt und stellt zusätzliche Informationen über die genaue Art und Dynamik der morphologische Veränderungen durch die Zell-Substrat-Impedanz Ansatz quantifiziert.
Genauer gesagt, die Anwendung dieser Methoden zu überwachen, wie MPO-vermittelten Oxidation von Klebstoff subendothelialen Matrix Proteine (zB Fibronektin) (i) reduziert die de novo Adhäsion der suspendierten Endothelzellen auf gereinigtes Fibronectin und (ii) auslöst Zell-Matrix de beschreiben wir -adhesion in Endothelzellen mit etablierten Haftung auf Fibronektin. Durch die Ausführung parallel Zellsignalanalysen im Laufe der Zeit mit relevanten biochemchemischen Assays (zB Western-Blotting), der zeitlichen und kausalen Beziehungen zwischen Adhäsion / Enthaftung Verfahren und damit verbundenen Änderungen der Adhäsion abhängigen Zellsignalisierungsereignisse bestimmt werden.
Diese Ansätze wurden kürzlich verwendet, um zu zeigen, dass die extrazelluläre Matrix, die Oxidation durch subendotheliale Ablagerungen von MPO katalysierten löst einen schnellen Verlust in Zell-Matrix-Adhäsion von Endothelzellen, die von bereits existierenden Actomyosin Kontraktionskräfte 9 angetrieben wird. Wichtig ist, indem die zeitliche Beziehung zwischen den Veränderungen in beiden Zell-Adhäsion und Haftung abhängige Zell-Signal ermittelt werden, diese Ansätze identifiziert, die MPO-induzierte Matrixmodifikation und zellulären de-Haftung löst Veränderungen in wichtigen Haftung abhängigen Zelle Signalwege einschließlich Src-Kinase -abhängigen Paxillin-Phosphorylierung und Myosin Light Chain II-Phosphorylierung (Abbildung 1) 9. Diese Art der redox-abhängige Signal, involving die Aktivierung intrazellulärer Signalwege durch extrazelluläre oxidative Reaktionen, die Zell-Matrix-Adhäsion zu stören, stellt eine neue Art der Zellsignalisierung "outside-in Redox-Signalisierung" (Abbildung 1) bezeichnet 9.
In der Regel sollten diese komplementären Zell-Substrat-Impedanz-Biosensor-und Live Cell Imaging Ansätze wertvoll bei der Aufdeckung, wie verschiedene Matrix-modifizierende Reize oder Agenten fahren Veränderungen der Zelladhäsion Dynamik, Morphologie und Signal innerhalb verschiedener adhärenten Zelltypen unterliegen einer Vielzahl von sein Versuchsanordnungen.
Das folgende Protokoll beschreibt, wie die Auswirkungen der MPO-vermittelte Matrix Oxidation auf De-novo-Endothelzelladhäsion (Experiment 1) und Endothelzellen de-Haftung (Experiment 2) Prozesse zu quantifizieren. MPO bindet sich begierig an Fibronektin und andere Klebe subendothelialen extrazellulären Matrixproteinen und unses Wasserstoffperoxid (H 2 O 2), um Chloridionen (Cl -) umzuwandeln, um das hochreaktive chlorierenden Oxidationsmittel Hypochlorsäure (HOCl), welche lokal mit diesen Matrixproteinen reagiert und stört deren Zellhaftfähigkeit (1) 8,9, 12.
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Protocol
1. Allgemeine Endothelial Cell Culture
- Kultur Endothelzellen der Rinderaorta (Gänge 4-9) auf Gelatine-beschichteten Gewebekulturflaschen (coat-Zellkulturoberfläche mit 0,1% w / v Gelatine in PBS bei RT für 15 min) in EGM-2-Medien (mit dem EGM-2 kugel Kit, enthaltend 5% fötales Rinderserum, Wachstumsfaktoren und alle Ergänzungen durch den Hersteller zur Verfügung gestellt, mit Ausnahme von Hydrocortison).
- Wenn die Zellen nahezu konfluent (ca. 3 Tage nach der Aussaat nach einer 1: 4-split), Ernten der Zellen durch Behandlung mit 0,05% w / v Trypsin / 0,02% w / v EDTA in PBS bei 37 ° C. Nachdem der Großteil der Zellen gelöst, fügen komplette EGM-2-Medien, um das Trypsin und dann Zentrifuge (100 · g, 5 min) zu löschen.
- Vorbereitung der Zellen für Untersuchungen über die de novo Adhäsion von endothelialen Zellen an Fibronektin (Experiment 1: Teil 2) und der anschließenden de-Adhäsion von Endothelzellen mit etablierten Haftung auf diesem Substrat (Experiment 2: Abschnitt 3).
- Waschen geerntetZellen wurden einmal mit serumfreiem Medium 199, das 1% w / v Rinderserumalbumin (BSA) und Re-Zentrifuge (100 × g, 5 min).
- Resuspendieren Zellen in serumfreiem Medium 199, das 1% w / v BSA auf 2,5 x 10 5 Zellen / ml (Zell-Substrat-Impedanzmessungen) oder 5 × 10 5 Zellen / ml (Abbildung lebender Zellen analysiert) und Aufrechterhaltung bei 37 ° C vor der Verwendung.
HINWEIS: Die Haft Antworten von Zellen sehr empfindlich auf Temperaturunterschiede (beispielsweise aufgrund von Konvektion Effekte), so dass alle Geräte und Lösungen verwendet werden, um während der folgenden Protokolle verarbeiten und zu behandeln Zellen sollten bei einer konstanten Temperatur von 37 ° C gehalten werden.
2. Experiment 1: Quantifizierung De Novo Endothelzelladhäsion auf Einheimische und MPO-oxidiert Fibronectin (Zell-Substrat-Impedanz)
HINWEIS: Experiment 1 untersucht, in welchem Maße MPO-vermittelten Oxidation von Fibronektin beeinträchtigt ihre Fähigkeit zur Unterstützung de novo
- Coat Fibronektin auf 96-Loch-Gold Zell-Substrat-Impedanz Mikroelektroden-Arrays. In 80 ul / Vertiefung gereinigtes Rinder Fibronektin bei 5 ug / ml in PBS, Inkubation für 2 Stunden bei 37 ° C, und entfernen Sie die Lösung.
- Inkubieren Fibronektin-beschichteten Oberflächen mit MPO die Bindung von MPO an die Oberfläche gebundenen Fibronectin ermöglichen. Werden 80 ul / Vertiefung von gereinigtem humanen neutrophilen MPO bei 20 nM in Hanks ausgewogener Salzlösung (HBSS) und Inkubation für 0,5 h bei 37 ° C.
- Wash Oberflächen zweimal mit HBSS um ungebundenes MPO entfernen.
- Hinzufügen H 2 O 2 (0-10 uM Endkonzentration) zu den Vertiefungen der Mikroelektroden-Array-Platte, die 80 & mgr; l / Vertiefung HBSS einzuleiten MPO-katalysierte, HOCl-abhängigen Fibronektin Oxidation und Inkubation für weitere 0,5 h bei 37 ° C.
- Um die Wirkung der entsprechenden Inhibitoren oder Modulatoren der MPO-katalysierten Reaktionen (zB alternative MPO-Enzym zu untersuchenSubstrate, Enzyminhibitoren oder Antioxidationsmitteln; siehe 9 für Details), fügen Sie diese dem HBSS unmittelbar vor der H 2 O 2 hinaus.
- Nach 0,5 Stunden, behandeln Oberflächen mit Methionin an Restoberflächengebundenen oxidierenden Spezies auslöschen, dh reaktives Protein-gebundenen Chloramine, die verwirrende Zellaktivitäten ausüben kann. Zugabe von 10 mM Methionin in 80 ul HBSS pro Vertiefung und Inkubation für 10 min bei 37 ° C.
- Block-Oberflächen mit BSA. In 80 ul / Vertiefung BSA bei 0,2% w / v in PBS, Inkubation für 2 Stunden bei 37 ° C, und entfernen Sie die Lösung.
HINWEIS: Residual unbeschichteten Oberfläche Regionen Zelladhäsion unterstützen und die Blockierung dieser mit einem nicht-klebenden Proteins (dh BSA) wird sichergestellt, dass die zelluläre Adhäsion Antworten strikt abhängig von der gereinigten Zellklebenden Matrix verwendet, in diesem Fall Fibronektin. - Wash Oberflächen zweimal mit HBSS.
HINWEIS: Keine der vorstehenden Oberflächenbehandlungen spürbar beeinträchtigt Zell-Substrat-readings. - Seed ausgesetzt Endothelzellen (mit 200 ul / Vertiefung bei ca. 2,5 x 10 5 Zellen / ml in serumfreiem Medium 199, das 1% BSA, siehe 1.3) auf die native oder MPO-oxidiert Fibronektin beschichteten Oberflächen.
- Unmittelbar nach der Aussaat Zellen (dh vor jeder Zellhaftung und Verbreitung), montieren Sie die Mikroelektroden-Array Platte auf den Inkubator-Anschluss (in einem 37 ° C Inkubator in Gegenwart von 5% CO 2 untergebracht).
- Mit dem Geräte-Software sofort ein 'blank' lesen, um nachfolgende Zell-Substrat-Impedanz ("Zell Index") zu den ursprünglichen Hintergrundwerte in der Abwesenheit von Zell-Adhäsion erhalten normalisieren Werte.
- Initiieren Erwerb von kontinuierlichen Zellindexdaten (mindestens eine Zelle Index Lesen / min).
- Zellen bei 37 ° C und 5% CO 2 inkubieren 2 Stunden, eine Zeit, während der maximale Zellhaftung und Ausbreitung erzielt wird; dies wird durch reflektierteseine Plateaubildung der Zellenindex-Werte (siehe Figur 3A).
HINWEIS: Die vorhergehenden Versuch (Versuch 1) untersucht, wie anfängliche MPO-vermittelten Oxidation von Fibronektin schränkt die Fähigkeit von Endothelzellen an der Zelladhäsion auf diesem Substrat herzustellen. Das folgende Experiment (Experiment 2) untersucht, wie MPO-vermittelte Oxidation Fibronektin fördert Abnahmen Zellmatrixadhäsion (dh Enthaftung) in Endothelzellen mit etablierten Haftung auf diesem Substrat. Die Behandlungen in diesen beiden Versuchen sind im wesentlichen identisch, mit Ausnahme des Zeitpunkts der MPO-vermittelte Fibronektin Oxidation (dh vor der Zelladhäsion - Experiment 1; nach Zelladhäsion - Experiment 2).
3. Versuch 2: Quantifizierung Endothelzellen De-Adhäsion von Fibronektin in Reaktion auf MPO-vermittelte Oxidation Fibronektin (Cell-Substrat-Impedanz und Live Cell Imaging)
- Coat Fibronektin auf 96-Loch-Goldmikroelektrode einrrays für Zell-Substrat-Impedanzmessungen (Add 80 ul / Vertiefung von Fibronektin an 5 ug / ml in PBS und Inkubation für 2 Stunden bei 37 ° C) oder 35 mm Glasboden-Zellkulturschalen für Live Cell Imaging Analysen (2 ml / Schale von Fibronektin bei 5 ug / ml in PBS und Inkubation für 2 h bei 37 ° C).
- Block-Oberflächen mit BSA. Fügen BSA bei 0,2% w / v in PBS an den in 3.1 angegebenen Mengen und Inkubation für 2 Stunden bei 37 ° C.
- Inkubieren Oberflächen mit MPO die Bindung von MPO an Fibronektin zu ermöglichen. In 20 nM gereinigtem menschlichen MPO in HBSS auf die in 3.1 angegebenen Mengen und Inkubation für 0,5 Stunden bei 37 ° C.
- Wash Oberflächen zweimal mit HBSS um ungebundenes MPO entfernen.
- Seed ausgesetzt Endothelzellen (in Serum-freiem Medium 199, das 1% w / v BSA; siehe 1.3) auf die native oder MPO tragenden Fibronektin beschichteten Oberflächen.
- Nach Zugabe von 200 ul / Vertiefung 2,5 x 10 5 Zellen / ml auf 96 Loch-Zellsubstrat Impedanz Mikroelektrodenarrays. <li> 2 ml / Schale bei 5 x 10 5 Zellen / ml bis 35 mm Glasboden-Zellkulturschalen.
- Berg 96-Loch-Mikroelektroden-Array-Platten auf die Zell-Substrat-Impedanz-Inkubator-Anschluss (in einem 37 ° C Inkubator in Gegenwart von 5% CO 2 untergebracht) und nehmen 'blank' Lesungen die kontinuierliche Erfassung von Zellindexdaten (siehe Abschnitt 2.10 zu starten ).
- Übertragungs 35 mm Glasboden-Zellkulturschalen zu einem 37 ° C Inkubator in Gegenwart von 5% CO 2.
HINWEIS: HBSS verwendet wird, wenn das Studium MPO-katalysierte oxidative Reaktionen statt komplette Kulturmedien wie letztere enthält oxidierbare Spezies, die mit den Oxidationsreaktionen stören.
HINWEIS: Nach 0,5 Stunden Äquilibrierung in HBSS, stabilisieren Zellindexwerte bei etwas niedrigeren Werten; wenn Vorinkubieren Zellen mit Enzymsubstraten, und Zell-Signalschutzmittel oder Antioxidantien, zunächst sicherstellen, dass die tiese keine signifikanten Auswirkungen auf die nach der Gleichgewichtseinstellung erhaltenen Werte.
- Für Zellimpedanz-Studien mit 96-Loch-Mikroelektroden-Array-Platten:
- Entfernen Sie die Mikroelektroden-Array Platte aus dem Inkubator und Pause Zellindex-Messungen.
- Hinzufügen H 2 O 2 (Endkonzentration von 0-10 & mgr; M) zu der HBSS und vorsichtig durch wiederholtes Pipettieren.
- Sofort wieder montieren Mikroelektroden-Array zurück auf die 37 ° C-Inkubator-Port und neu beginnen die Übernahme von Zellindexwerte.
- Für Live Cell Imaging-Studien mit 35 mm Glasbodenzellkulturschale:
- Entfernen Sie die Kulturschale aus dem Inkubator und montieren auf eine 37 ° C erhitzt Bühne eines invertierten konfokalen Mikroskop mit 63X Wasser Objektiv mit geeigneten DIC-Optik für die Aufzeichnung von Live Cell Filme.
- Konzentrieren Sie sich auf Zellen undOptimierung der DIC-Optik (Köhler-Beleuchtung, Bias Retardierung und Kamera Versatz / Verstärkung; Details siehe 13).
- Initiieren DIC Film und notieren Ausgangswerte von unbehandelten Zellen für 1 min.
- Hinzufügen H 2 O 2 (Endkonzentration von 0-10 uM) und vorsichtig durch wiederholtes Pipettieren. Re-Fokussierung des Mikroskops (falls erforderlich) und die Aufnahme fortzusetzen DIC Filme der behandelten Zellen für den erforderlichen Zeitraum.
4. Datenanalyse und Präsentation
- Zell-Substrat-Impedanzdaten
- Export Rohdaten (Zellenindex als Funktion der Zeit) in eine Tabellenkalkulation.
- Für Zell Enthaftung Studien (Experiment 2: Abschnitt 3) normalisieren Daten durch Setzen auf die Einleitung des MPO-vermittelte Fibronektin Oxidations aufgezeichnet unmittelbar vor Werte auf einen Wert von 1 (dh, unmittelbar vor der Zugabe von H 2 O 2 in 3,11 .1.1).
ANMERKUNG: Dies stellt sicher, dass die relativenVeränderungen in der Zellindexwerte von MPO-vermittelte Fibronektin Oxidation hervorgerufen werden durch kleine anfängliche Unterschiede in absoluten Zellindexwerte zwischen Brunnen maskiert.- Vorliegenden Daten als Grund normierte Zellenzahl (y-Achse) gegen die Zeit (x-Achse).
- Live Cell Imaging-Daten (Zelle de-Haft Studien in Versuch 2: Abschnitt 3)
- Öffnen DIC Live Cell Imaging Filme unmittelbar vor und nach dem Beginn der MPO-vermittelte Fibronektin Oxidation in einem Standard-Bildanalyseprogramm (zB ImageJ Software) aufgezeichnet.
- In mindestens zwei getrennten DIC Filme auswählen zufällig mehrere Zellen und messen ihre projizierte Fläche in aufeinanderfolgenden Rahmen (zB bei 1-Minuten-Intervallen) durch ihre Membranrand manuell Verfolgung und indem die Anzahl der eingeschlossenen Bildpunkten.
- Export Rohdaten (projizierte Zellfläche als Funktion der Zeit), um eine Excel-Tabelle und normalisieren Zellenbereich Daten, indem Sie Werte aufgezeichnet unmittelbar vordie Initiierung der MPO-vermittelte Fibronektin Oxidation auf einem Wert von 1 (dh, unmittelbar vor der Zugabe von H 2 O 2 in 3.11.2.3).
- Vorliegenden Daten als eine graphische Darstellung der normalisierten Zellenbereich (y-Achse) gegen die Zeit (x-Achse).
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Representative Results
Echtzeit-Quantifizierung von Endothelzellen de-Adhäsion von Fibronektin als Reaktion auf MPO-vermittelte Oxidation Fibronektin (Experiment 2). Die Aussaat der endothelialen Zellsuspensionen auf nativen (MPO kostenlos) Fibronektin oder MPO-Lager Fibronektin ergibt maximale Zellhaftung und die Verbreitung innerhalb von 2 h, wie durch eine Plateaubildung der Zellindexwerte in dem Zellensubstrat Impedanzmessungen (3A) beurteilt. Diese Anfangsphase der Zellhaftung und Ausbreitung deutlich reduziert ist, wenn MPO-vermittelte Fibronektin Oxidation vor der Zellaussaat in den Experimenten durchgeführt nach dem Protokoll in Experiment 1 beschriebenen initiiert (Daten nicht gezeigt; Details siehe 9). Nachdem maximale Zelladhäsion auf nativen oder MPO-Lager Fibronektin fest gezielte Fibronektin Oxidation durch MPO-katalysierte HOCl vermittelte (durch Zugabe von MPO Cosubstrat H initiiert 2 O 2) führt zu einer schnellen Abnahme der surGesichtsbereich von Zell-Matrix-Kontakt von Zell-Substrat-Impedanz (3A, B) und von Live Cell Imaging (3C gemessen, für einen repräsentativen DIC Film finden Film 1; Zellindex oder Zellfläche Verluste nach H 2 O 2 hinaus minimal sind in Abwesenheit von MPO 9). Während Zellzahl und Zellfläche Veränderungen während der MPO-induzierte de-Haftung sehr ähnlich waren, die vergleichsweise langsameren Rückgang der Zellindexwerte kann die isolierende Wirkung von Zellmembran Materialien an der Zellperipherie in "zellfreien" Regionen präsent während Ent- reflektieren Haftung, die nicht in den projizierten Zellenfläche Messungen quantifiziert werden. Die schnelle Mobil Enthaftung ersichtlich in Endothelzellen an MPO-Lager Fibronektin in Reaktion auf H 2 O 2 gebunden Behandlung ist in Zellen, die mit H 2 O 2 allein behandelt fehlt (dh Zellen, die nicht enthalten MPO) (3A) und b ist blockierty MPO-Enzym-Inhibitoren oder HOCl Fänger (Daten nicht gezeigt; siehe 9 für Details), identifiziert, dass dieser Prozess ist abhängig von der MPO-katalysierten Herstellung von HOCl (siehe Abbildung 1). Hemmung der Myosin II Motorik mit blebbistatin hemmt die Rate der Endothelzellen Enthaftung von Zell-Substrat-Impedanz (3B) und von lebenden Zellen (3C, Film 2) gemessen wird, identifiziert, dass zelluläre Enthaftung und Kontraktion als Reaktion bei MPO-katalysierte subzelluläre Matrix Oxidation durch Actomyosin Zugkräfte 9 angetrieben.
Abbildung 1. MPO-vermittelte subzelluläre Matrix Oxidation löst Zell-Matrix-de-Adhäsions- und Zell-Signal. MPO löst schnellen de-Haft Reaktionen und Veränderungen in Haftung abhängige Signalisierung durch Vermittlung gezielte oxidation Klebstoff subendothelialen Matrix Proteine ein, einschließlich die folgenden Ereignisse 9: (A) MPO bindet begierig an der subendothelialen Matrix und verwendet H 2 O 2, um die hochreaktiven Oxidations HOCl, die lokal mit Matrixproteinen (zB Fibronektin) reagiert und stört ihre generieren Zellhafteigenschaften. (B) Dieser Schaden stört Klebe Kontakte an der Zell-Matrix-Grenzfläche, was zu (C) Membran Rückzug durch einstimmig Spannung in der Aktin-Zytoskelett und die Änderung der Haftungsabhängigen Zelle Signalwege (mit Genehmigung nach Rees et al reproduziert angetrieben. 9 ). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Figure 2. Work-Flow und Prinzip der Zell-Substrat-Impedanzanalyse zu Endothelzellen de-Adhäsion von Fibronektin als Reaktion auf MPO-vermittelte Oxidation Fibronektin (Experiment 2). Zelle durch die Zell-Substrat-Mikroarray-Impedanz-Biosensor-System gemessene Indexwerte spiegeln quantifizieren die Fähigkeit der Zellmembran zu feldinduzierte Ionenströme an der Elektrodenoberfläche zu begrenzen und sind proportional zur Fläche von Zell-Substrat-Kontakt 10. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Figur 3 in Echtzeit die Quantifizierung von endothelialen Zell Enthaftung von Fibronektin in Reaktion auf MPO-vermittelte Oxidation Fibronektin (Experiment 2). Endotheliale Zellsuspensionen (in serumfreiem Medium 199, das 1%BSA) wurden auf nativen oder MPO-Lager Fibronektin (Fibronectin bei 5 beschichtet ausgesät g / ml, dann wird in der Abwesenheit oder Gegenwart von 20 nM MPO) in 96-Well-Mikroelektrodenarrays (Zell-Substrat-Impedanzmessungen) oder 35 mm Glasboden inkubiert Zellkulturschalen (Live Cell Imaging-Analysen). Die Zellen wurden dann bei 37 ° C für 2 Stunden inkubiert, um eine maximale Zellhaftung ermöglichen und zu verbreiten, bevor Äquilibrieren Zellen mit HBSS und Initiieren MPO-vermittelte Fibronektin Oxidation durch Zugabe von H 2 O 2 (10 uM) (Zeit der H 2 O 2 -Zugabe zu setzen t = 0 min). (A) Vollzeit-Verlauf der Zell-Substrat-Impedanzmessungen vor und nach der Behandlung mit H 2 O 2 in Gegenwart (+ MPO) und Abwesenheit (-MPO) von MPO. (B) Zellsubstrat Impedanzmessungen und (C) Zellflächenmessungen von lebenden Zellen analysiert, nach der Behandlung der MPO-Zellen enthält, mit H 2 O 2 in Gegenwart (+ Blebbistatin) und Abwesenheit (-blebbistatin) des Myosin II Inhibitor blebbistatin (40 uM). Zellzahl und Zellbereich Werte sind auf Werte unmittelbar vor dem Zeitpunkt der H 2 O 2 -Zugabe, die einen Wert von 1. Zellindexdaten angegeben wurden stellen den Mittelwert ± SEM, n = 6 Wiederholungsmessungen aus einem repräsentativen Experiment. Zellbereich Werte stellen den Mittelwert ± SEM, n = 10 Zellen (2 Wiederholungs Filme, 5 zufällig ausgewählten Zellen pro Film: siehe Filme 1 und 2). (3B, 3C, Film 1 und Video 2 werden mit Erlaubnis von Rees et al. 9 wiedergegeben). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Film 1 . Zeitraffer DIC Mikroscopy Film von Endothelzellen auf MPO-Lager Fibronektin über 0 verklebt - nach Exposition mit H 2 O 2 (10 uM) 15 min; 1 s = 3 min.
Film 2 . Zeitraffer DIC-Mikroskopie Film von Endothelzellen auf MPO-Lager Fibronektin über 0 verklebt - nach Exposition mit H 2 O 2 (10 uM) in Gegenwart von blebbistatin (40 uM) 15 min; 1 s = 3 min.
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Discussion
Zell-Matrix-Adhäsion und de-Klebeprozesse genau und in Echtzeit mit hoher zeitlicher Auflösung unter Verwendung von Zell-Substrat-Impedanz und Live Cell Imaging-Analysen quantifiziert werden. Diese Echtzeit-Ansätze bieten einen großen Vorteil gegenüber Endpunktanalysen der Zelladhäsion, die schlechte zeitliche Auflösung zur Verfügung. Durch die präzise Quantifizierung schnellen de-Haft Reaktionen mit hoher zeitlicher Auflösung kann diese Analysen kritische Einblicke in geben, wie morphologische Reaktionen auf Matrix Änderungen sind geregelt und wie sie sich auf die Haftung abhängigen Zellsignalprozesse, die parallel mit relevanten biochemischen Assays gemessen (zB Western-Blot).
In neueren Studien wurden diese Ansätze verwendet werden, um eine neue Rolle für die MPO-vermittelte Oxidation der subendothelialen Matrix bei der Auslösung der de-Adhäsion von Endothelzellen zeigen und ergeben: (i) dass die Rate der de-Haftung war kritisch von Vor- bestehende ActomyosinKontraktilität (siehe 3B und 3C) und (ii) dass der Verlust der Zell-Matrix-Adhäsion fuhr Veränderungen wichtiger Haftung abhängigen Zelle Signalwege einschließlich Src abhängige Paxillin-Phosphorylierung und Myosin Light Chain II Phosphorylierung 9 (siehe Abbildung 1). Diese Daten haben wichtige Implikationen für das Verständnis der Endothelfunktion und Barriereintegrität während Entzündungsreaktionen, wo der subendothelialen extrazellulären Matrix wird als ein zentrales Ziel für Oxidantien durch Ablagerungen von subendothelialen Matrix-gebundenen MPO oder anderen Quellen von reaktiven Oxidantien 3,5-9 hergestellt verwickelt, 14.
Die Verwendung eines Microarray-basierte, Zell-Substrat-Impedanz-Biosensor-System bietet eine Plattform für robust, Hochdurchsatz-Zelladhäsion Messungen. Jedes der gut der 96-Loch-Zell-Substrat-Impedanz Mikroelektroden-Arrays hat das Potenzial, gleichzeitig zu analysieren 32 verschiedenen experimentellen Bedingungen (dh 3 Brunnen per Bedingung). Vergleicht man jedoch kleine Änderungen bei der Zelladhäsion, mindestens 4 oder mehr Wells sollte pro Versuchsbedingung verwendet werden. Während der Zellaussaat und anschließende Zellbehandlungen, sollte darauf geachtet werden, um alle Lösungen bei 37 ° C zu halten und minimieren den Zeitaufwand für die Zellen außerhalb des 37 ° C-Inkubator-Umgebung (dies vermeidet potenzielle Temperaturunterschiede über die Mikroelektroden-Array, die die Haftung beeinträchtigen können Antworten zu behandeln ). Bemerkenswert ist, der elektrische Strom an der Zell-Substrat-Oberfläche ist empfindlich auf die Ionenstärke der Zellüberstand 10: folglich Zellen erlaubt werden sollte, nach der Zugabe der neuen Puffer / Medium äquilibriert, um eine stetige Zellenindex-Ansprechverhalten vor der Überwachung der Wirkung zu erzielen des Stimulus von Interesse (siehe 3.10 und 3A). Eine Abnahme des Zellindex kann nicht nur eine Verringerung der durchschnittlichen Fläche von Zell-Matrix-Kontakt beziehen, sondern kann auch eine Verringerung der Zahl der gebundenen Zellen widerspiegeln. Zu unterscheiden,zwischen diesen Möglichkeiten, können Änderungen in der Zahl der gebundenen Zellen auf Mikroelektrodenarrays unmittelbar nach Zell-Substrat-Impedanzmessungen durch Kristallviolett-Färbung dieser Ansatz wurde verwendet, um zu bestätigen, dass MPO-vermittelte Fibronektin Oxidation löst eine rasche Abnahme der durchschnittlichen Fläche von quantifizieren Zell-Matrix-Kontakt, aber keine Zellablösung zu fördern (Details siehe 9).
Eine Begrenzung der Zell-Substrat-Impedanz-Technik ist, dass sie eine mittlere Maß der Adhäsion Veränderungen über alle auf dem Mikroelektrodenoberfläche vorhandenen Zellen und es enthält keine Informationen über die genaue Art der Adhäsion oder morphologischen Veränderungen auf der Ebene einzelner Zellen ergeben. Um diese Einschränkung zu beheben, lebenden Zellen DIC-Mikroskopie und Bildanalyse liefert eine ergänzende Maßnahme der Adhäsion Änderungen und zeigt morphologische Veränderungen einzelner Zellen. Somit nimmt in Zell Index als Reaktion auf MPO-vermittelte Oxidation Fibronektin meavon Zell-Substrat-Impedanz (3A) gut mit den Abnahmen in der projizierten Fläche der Zellen, die durch Live-Bild der Zellanalyse der DIC-Filme (3B) gemessen korrelieren bewertet. Wichtig ist, dass die DIC-Filme zeigen, dass in einzelnen Zellen, MPO-induzierte de-Adhäsion umfasst die schnelle Zurückziehen des peripheren Zellmembran von der Unterlage und benachbarten Zellen und schließlich zu Zellen unter der Annahme einer kompakten "aufgerundet" Morphologie, aber ohne dass in Zellablösung (Film 1). Wie bei Zell-Substrat-Impedanzmessungen, um reproduzierbare Zellreaktionen zu gewährleisten, sollte darauf geachtet werden, Lösungen zu halten 37 ° C vor dem auf Zellen und einer erwärmten Mikroskoptisch (oder gleichwertig Temperaturüberwachungseinrichtung) muss während der lebenden Zellen verwendet werden, zu verwenden Aufnahmen.
Die hier beschriebenen Protokolle können ohne weiteres durch Einsetzen von Fibronektin mit anderen gereinigten Matrixsubstrate (modifiziert werden
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Disclosures
Die Autoren haben keine Angaben zu machen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 well gold cell-substrate impedance microelectrode array | ACEA Biosciences / Roche | E-Plate 96 | single-use plate used for performing cell-based assays on the xCELLigence system |
| blebbistatin | Sigma | B0560 | selective inhibitor of non-muscle myosin-II |
| Bovine Aortic Endothelial Cells, cryopreserved | Lonza | BW-6001 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | 05470 | |
| EGM-2 BulletKit | Lonza | CC-3162 | endothelial cell growth media kit |
| Fibronectin, lyophilized powder | Sigma | F-4759 | from bovine plasma |
| Fluorodish 35 mm glass-bottomed cell culture dish | World Precision Instruments | FD35-100 | Cell cuture dish with optical quality glass bottom for imaging |
| Gelatin from bovine skin | Sigma | G9391 | cell culture substratum |
| Hank's Balanced Salt Solution | Life Technologies | 14025076 | |
| Hydrogen peroxide | Merck | 107298 | |
| Medium-199 | Life Technologies | 11150-059 | serum-free cell media |
| Methionine | Sigma | M9500 | quenches chlorinating oxidants generated by myeloperoxidase |
| Myeloperoxidase, Human Polymorphonuclear Leukocytes | Millipore | 475911 | |
| RTCA MP Instrument / xCELLigence cell substrate impedance system | ACEA Biosciences / Roche | Consists of RTCA Analyzer, RTCA (Multiple Plate) MP Station and RTCA Control Unit | |
| Trypsin-EDTA (0.5%) | Gibco | 15400-054 |
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