मैट्रिक्स संशोधन द्वारा प्रेरित सेलुलर आसंजन और डी-आसंजन में वास्तविक समय परिवर्तन को मापने के लिए सेल सब्सट्रेट प्रतिबाधा और लाइव सेल इमेजिंग का उपयोग
Summary
यहाँ, हम लगातार सेल सब्सट्रेट प्रतिबाधा और लाइव सेल इमेजिंग विश्लेषण करती द्वारा एक गैर-आक्रामक ढंग से उच्च अस्थायी समाधान के साथ सेल आसंजन और डे-आसंजन प्रक्रियाओं यों के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। इन तरीकों मैट्रिक्स संशोधन और आसंजन पर निर्भर संकेतन घटनाओं के लिए उनके अस्थायी रिश्ते से चालू होने वाले कोशिका आसंजन / डी आसंजन प्रक्रियाओं की गतिशीलता प्रकट करते हैं।
Abstract
सेल-मैट्रिक्स आसंजन सेल आकृति विज्ञान को नियंत्रित करने और संकेत में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। सेल-मैट्रिक्स आसंजन (जैसे, myeloperoxidase और अन्य मैट्रिक्स संशोधित oxidants / सूजन के दौरान जारी एंजाइमों) को बाधित उत्तेजनाओं कि रोगों की संख्या में सेलुलर समारोह, फेनोटाइप और व्यवहार्यता में रोग परिवर्तन ट्रिगर में फंसा रहे हैं। यहाँ, हम (एक pathophysiological मैट्रिक्स संशोधित प्रोत्साहन के रूप में endothelial कोशिकाओं और myeloperoxidase का उपयोग) सेल सब्सट्रेट प्रतिबाधा और लाइव सेल इमेजिंग दृष्टिकोण आसानी से सही रूप में कोशिका आसंजन और मैट्रिक्स संशोधन द्वारा प्रेरित डे-आसंजन में वास्तविक समय में परिवर्तन यों के लिए नियोजित किया जा सकता वर्णन कैसे उच्च अस्थायी समाधान के साथ और एक गैर-आक्रामक तरीके से। xCELLigence सेल सब्सट्रेट प्रतिबाधा प्रणाली लगातार सोने microelectrode सरणियों पर विकसित कोशिकाओं में कोशिका-सब्सट्रेट इंटरफेस में बिजली प्रतिबाधा को मापने के द्वारा कोशिका-मैट्रिक्स आसंजन के क्षेत्र quantifies। की छवि विश्लेषण समय व्यतीत एडवेंचर्सTiAl हस्तक्षेप विपरीत फिल्मों सेल-मैट्रिक्स संपर्क के क्षेत्र में परिवर्तन का प्रतिनिधित्व करने, समय के साथ व्यक्ति की कोशिकाओं की अनुमानित क्षेत्र में परिवर्तन quantifies। दोनों तकनीकों सही रूप में सेलुलर आसंजन और डे-आसंजन प्रक्रियाओं के लिए तेजी से बदलाव यों। Microelectrode biosensor सरणियों पर सेल सब्सट्रेट प्रतिबाधा मजबूत, उच्च throughput मापन के लिए एक मंच प्रदान करता है। लाइव सेल इमेजिंग सेल सब्सट्रेट प्रतिबाधा माप द्वारा मात्रा morphological परिवर्तन की प्रकृति और गतिशीलता के बारे में अतिरिक्त विस्तार प्रदान विश्लेषण करती है। इन पूरक दृष्टिकोण subcellular बाह्य मैट्रिक्स घटकों के myeloperoxidase उत्प्रेरित ऑक्सीडेटिव संशोधन तेजी से सेल आसंजन, आकृति विज्ञान में परिवर्तन और endothelial कोशिकाओं में संकेत चलाता है कि कैसे में बहुमूल्य नए अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं। इन तरीकों को भी अन्य मैट्रिक्स संशोधित उत्तेजनाओं को और संबंधित पक्षपाती कोशिकाओं (जैसे, उपकला कोशिकाओं) में प्रतिक्रिया में सेलुलर आसंजन गतिशीलता के अध्ययन के लिए लागू कर रहे हैं।
Introduction
कोशिकाओं और उनके आसपास के बाह्य मैट्रिक्स के बीच स्थिर चिपकने वाला संपर्कों ऊतक homeostasis के रखरखाव के लिए आवश्यक हैं। उदाहरण के लिए, रक्त वाहिकाओं में subendothelial मैट्रिक्स को endothelial सेल आसंजन endothelial परत की अखंडता और एक नियामक, अर्द्ध पारगम्य संवहनी बाधा एक के रूप में अपनी समस्थिति समारोह को बनाए रखने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। actin cytoskeleton यंत्रवत् केंद्रीय रूप से निर्देशित actomyosin तन्य बलों विरोध द्वारा कोशिका झिल्ली की स्थिति का निर्धारण करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा सेल-मैट्रिक्स इंटरफेस में सेल-मैट्रिक्स आसंजन और चिपकने वाला संपर्कों के स्थलों पर मैट्रिक्स अणुओं चिपकने वाला युग्मित है। जरूरी सेल-मैट्रिक्स इंटरफेस पर बलों की शेष है, तेजी से है कि एक घटना को बदल सेल-मैट्रिक्स आसंजन बदल कि कोशिकी उत्तेजनाओं "बाहर में संकेत" के पारगमन, जिसके परिणामस्वरूप Mechano के प्रति संवेदनशील संकेत प्रोटीन द्वारा 'लगा'। इस पार बात शर्तसमझना कोशिकाओं और उनके आसपास के बाह्य मैट्रिक्स सेल आकार, गतिशीलता, समारोह, प्रसार और अस्तित्व दो को नियंत्रित करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है।
विविध Patho-शारीरिक प्रक्रियाओं (भ्रूण के विकास, सूजन, घाव की मरम्मत और कैंसर मेटास्टेसिस) मैट्रिक्स अपमानजनक oxidants और / या एंजाइमों 3,4 से चिपकने वाला मैट्रिक्स substrates के गतिशील remodeling के द्वारा विशेषता है। उदाहरण के लिए, रक्त वाहिकाओं में subendothelial मैट्रिक्स प्रोटीन चिपकने वाला (जैसे, फ़ाइब्रोनेक्टिन) के कारण प्रतिक्रियाशील oxidants के स्थानीयकृत उत्पादन करने के लिए मानव भड़काऊ रोगों में संशोधन या गिरावट के लिए प्रमुख लक्ष्य के रूप में फंसा रहे हैं (उदाहरण के लिए, हाइपोक्लोरस एसिड, HOCL) ल्युकोसैट व्युत्पन्न एंजाइम द्वारा भड़काऊ रोग (चित्रा 1) 5-9 दौरान subendothelium भीतर जम जाता है, जो myeloperoxidase (MPO),। MPO व्युत्पन्न oxidants और अन्य मैट्रिक्स संशोधित उत्तेजनाओं से प्रेरित सेल-मैट्रिक्स आसंजन में परिवर्तन lik हैंबदले में endothelial समारोह और बाधा अखंडता perturbs जो endothelial सेल संकेतन, आकृति विज्ञान और व्यवहार्यता, बदलकर, जैसे, इली रोग प्रक्रियाओं की एक किस्म के दौरान संवहनी समस्थिति फेरबदल में महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के लिए। हालांकि, बाह्य मैट्रिक्स संशोधनों को पक्षपाती कोशिकाओं की रूपात्मक और सेल संकेतन प्रतिक्रियाएं ही समझा जाना शुरू हो गए हैं।
मैट्रिक्स संशोधनों कोशिका आसंजन गतिशीलता और आसंजन पर निर्भर सेल संकेत दे रास्ते में परिवर्तन कैसे ड्राइव को समझने के लिए, तकनीक सही रूप में उच्च अस्थायी समाधान के साथ वास्तविक समय में सेल-मैट्रिक्स आसंजन में परिवर्तन यों कि आवश्यक हैं। यहाँ, हम पूरक सेल सब्सट्रेट प्रतिबाधा और इन मानदंडों को पूरा करने और एक गैर-आक्रामक ढंग से कोशिका आसंजन और डे-आसंजन प्रक्रियाओं यों के लिए एक मंच प्रदान करना है कि जीना सेल इमेजिंग तकनीक का वर्णन है।
हम बताते हैं कि कैसे इन सेल सब्सट्रेट प्रतिबाधा और लाइव सेल इमेजिंग approदर्द आसानी से सेल लगाव की गतिशीलता पर नजर रखने और देशी और संशोधित मैट्रिक्स substrates पर (यानी, डी नोवो कोशिका आसंजन) के प्रसार और (ii) (यानी, डे-आसंजन सेल-मैट्रिक्स टुकड़ी की गतिशीलता को मापने के लिए (मैं) करने के लिए नियोजित किया जा सकता है ) मैट्रिक्स संशोधित उत्तेजनाओं से अवगत कराया पक्षपाती कोशिकाओं द्वारा। xCELLigence सेल सब्सट्रेट प्रतिबाधा biosensor प्रणाली 96 अच्छी तरह से सोने microelectrode सरणियों की सतह पर विद्युत प्रतिबाधा बढ़ाता द्वारा कोशिका-मैट्रिक्स संपर्क के क्षेत्र की एक सतत माप प्रदान करता है और 'सेल सूचकांक', एक आयामरहित मूल्य के रूप में इन बिजली प्रतिबाधा माप व्यक्त करता है कि यह भी (इन्सुलेट) कोशिका झिल्ली और इलेक्ट्रोड सतह से 11 के बीच औसत दूरी में परिवर्तन के प्रति संवेदनशील होने के नाते, जबकि सेल सब्सट्रेट संपर्क 10 (चित्रा 2) के क्षेत्र के लिए काफी हद तक आनुपातिक है। सेल सूचकांक मूल्यों में एक और वृद्धि भी तंग सेल सेल संपर्कों था के गठन पर हासिल की हैटी, इस अध्ययन में वर्णित प्रयोगों के भीतर प्रबल नहीं है कि 11 शर्तों paracellular वर्तमान प्रवाह सीमित। समय चूक अंतर हस्तक्षेप विपरीत की छवि विश्लेषण से समय के साथ व्यक्ति की कोशिकाओं की अनुमानित क्षेत्र के मापन (डीआईसी) फिल्मों सेल सब्सट्रेट संपर्क के क्षेत्र में परिवर्तन का एक पूरक उपाय प्रदान करता है और सटीक प्रकृति और गतिशीलता के बारे में अतिरिक्त जानकारी प्रदान करता है सेल सब्सट्रेट प्रतिबाधा दृष्टिकोण द्वारा मात्रा morphological परिवर्तन।
विशेष रूप से, हम (जैसे, फ़ाइब्रोनेक्टिन) (मैं) चिपकने वाला subendothelial मैट्रिक्स प्रोटीन के ऑक्सीकरण MPO की मध्यस्थता निगरानी कैसे शुद्ध फ़ाइब्रोनेक्टिन और (ii) चलाता है सेल-मैट्रिक्स डे पर निलंबित endothelial कोशिकाओं के डी नोवो आसंजन कम कर देता है के लिए इन तरीकों के आवेदन का वर्णन फ़ाइब्रोनेक्टिन पर स्थापित आसंजन के साथ endothelial कोशिकाओं में -adhesion। समानांतर सेल संकेतन प्रदर्शन कर प्रासंगिक बायोकेम का उपयोग करते हुए समय के साथ विश्लेषण करती तकराजनैतिक assays के (जैसे, पश्चिमी सोख्ता), आसंजन पर निर्भर सेल संकेत घटनाओं में आसंजन / डी आसंजन प्रक्रियाओं और एसोसिएटेड परिवर्तन के बीच लौकिक और कारण रिश्तों को निर्धारित किया जा सकता है।
इन तरीकों हाल ही में MPO की subendothelial जमाओं द्वारा उत्प्रेरित बाह्य मैट्रिक्स ऑक्सीकरण पूर्व मौजूदा actomyosin सिकुड़ा बलों 9 से प्रेरित है कि endothelial कोशिकाओं की कोशिका-मैट्रिक्स आसंजन में एक तेजी से नुकसान से चलाता है कि प्रदर्शन करने के लिए इस्तेमाल किया गया। महत्वपूर्ण बात है, दोनों कोशिका आसंजन में परिवर्तन और निर्धारित किया है संकेत आसंजन पर निर्भर सेल के बीच अस्थायी रिश्ते को सक्षम करने से, इन तरीकों MPO प्रेरित मैट्रिक्स संशोधन और सेलुलर डे-आसंजन एसआरसी काइनेज सहित महत्वपूर्ण आसंजन पर निर्भर सेल संकेत दे रास्ते में परिवर्तन से चलाता है कि पहचान निर्भर paxillin फास्फारिलीकरण और मायोसिन प्रकाश श्रृंखला द्वितीय फास्फारिलीकरण (चित्रा 1) 9। रेडॉक्स निर्भर संकेतन, निवेश संबंधी निर्णय की यह विधासेल-मैट्रिक्स आसंजन को बाधित कि कोशिकी ऑक्सीडेटिव प्रतिक्रियाओं द्वारा intracellular संकेतन घटनाओं की सक्रियता olving, सेल के एक उपन्यास मोड "के बाहर-इन रेडॉक्स संकेतन" (चित्रा 1) करार दिया संकेत का प्रतिनिधित्व करता है 9।
सामान्य में, इन पूरक सेल सब्सट्रेट प्रतिबाधा biosensor और लाइव सेल इमेजिंग दृष्टिकोण मैट्रिक्स संशोधित उत्तेजनाओं या एजेंटों कोशिका आसंजन गतिशीलता, आकृति विज्ञान में परिवर्तन कैसे ड्राइव अलग खुलासा और की एक विस्तृत विविधता के अधीन विभिन्न पक्षपाती सेल प्रकार के भीतर संकेत में मूल्यवान होना चाहिए प्रयोगात्मक सेटिंग।
निम्नलिखित प्रोटोकॉल डी नोवो endothelial सेल आसंजन (प्रयोग 1) और endothelial सेल डे-आसंजन (प्रयोग 2) प्रक्रिया पर MPO की मध्यस्थता मैट्रिक्स ऑक्सीकरण के प्रभाव यों के लिए कैसे करें। MPO फ़ाइब्रोनेक्टिन और अन्य चिपकने वाला subendothelial बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन और हमारे लिए उत्सुकतापूर्वक बांधतातों (एच 2 ओ 2) क्लोराइड आयनों (CL -) कन्वर्ट करने के लिए हाइड्रोजन पेरोक्साइड इन मैट्रिक्स प्रोटीन के साथ स्थानीय रूप से प्रतिक्रिया करता है और अपने सेल चिपकने वाला गुण (चित्रा 1) 8,9 बाधित जो उच्च प्रतिक्रियाशील क्लोरीनीकरण ऑक्सीडेंट हाइपोक्लोरस अम्ल (HOCL), को, 12।
Protocol
Representative Results
Discussion
सेल-मैट्रिक्स आसंजन और डे-आसंजन प्रक्रियाओं सेल सब्सट्रेट प्रतिबाधा और लाइव सेल इमेजिंग का विश्लेषण करती है का उपयोग कर उच्च अस्थायी समाधान के साथ वास्तविक समय में सही मात्रा निर्धारित किया जा सकता ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by a National Health and Medical Research Council (NHMRC) Project Grant 568721 (SRT) and, in part, by a UNSW Faculty of Medicine Faculty Research Grant (MDR).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 96 well gold cell-substrate impedance microelectrode array | ACEA Biosciences / Roche | E-Plate 96 | single-use plate used for performing cell-based assays on the xCELLigence system |
| blebbistatin | Sigma | B0560 | selective inhibitor of non-muscle myosin-II |
| Bovine Aortic Endothelial Cells, cryopreserved | Lonza | BW-6001 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | 05470 | |
| EGM-2 BulletKit | Lonza | CC-3162 | endothelial cell growth media kit |
| Fibronectin, lyophilized powder | Sigma | F-4759 | from bovine plasma |
| Fluorodish 35 mm glass-bottomed cell culture dish | World Precision Instruments | FD35-100 | Cell cuture dish with optical quality glass bottom for imaging |
| Gelatin from bovine skin | Sigma | G9391 | cell culture substratum |
| Hank's Balanced Salt Solution | Life Technologies | 14025076 | |
| Hydrogen peroxide | Merck | 107298 | |
| Medium-199 | Life Technologies | 11150-059 | serum-free cell media |
| Methionine | Sigma | M9500 | quenches chlorinating oxidants generated by myeloperoxidase |
| Myeloperoxidase, Human Polymorphonuclear Leukocytes | Millipore | 475911 | |
| RTCA MP Instrument / xCELLigence cell substrate impedance system | ACEA Biosciences / Roche | – | Consists of RTCA Analyzer, RTCA (Multiple Plate) MP Station and RTCA Control Unit |
| Trypsin-EDTA (0.5%) | Gibco | 15400-054 |
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