Använda Cell-substrat Impedans och levande cell imaging att mäta Realtids Förändringar i Cellular Adhesion och De-vidhäftning inducerad av Matrix Ändring
Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att kontinuerligt kvantifiera cellvidhäftnings och de-vidhäftnings processer med hög tidsupplösning på ett icke-invasivt sätt genom cellsubstrat impedans och levande cell imaging analyser. Dessa tillvägagångssätt avslöjar dynamik celladhesion / de-adhesionsprocesser utlöses av matrismodifiering och deras tidsmässigt samband med vidhäftningsberoende signalhändelser.
Abstract
Cell-matrix vidhäftning spelar en nyckelroll i att kontrollera cell morfologi och signalering. Stimuli som stör cellmatris vidhäftning (t.ex. myeloperoxidas och andra matris modifierande oxidanter / enzymer frigörs vid inflammation) är inblandade i att utlösa patologiska förändringar i cellulär funktion, fenotyp och livskraft i ett antal sjukdomar. Här beskriver vi hur cellsubstrat impedans och levande cell imaging metoder kan lätt användas för att exakt kvantifiera realtid förändringar i celladhesion och de-vidhäftning inducerad av matris modifiering (med hjälp av endotelceller och myeloperoxidas som en patofysiologisk matris modifiera stimulus) med hög tidsupplösning och på ett icke-invasivt sätt. Den xCELLigence cellsubstrat impedans systemet kvantifierar kontinuerligt området för cellmatrix adhesion genom mätning av den elektriska impedansen vid cellsubstratgränssnitt i celler odlade på guldmikroelektrod arrayer. Bildanalys av tidsförlopp differenTiAl interferenskontrast filmer kvantifierar förändringar i den projicerade ytan av enskilda celler med tiden, som representerar förändringar i området för cellmatrix kontakt. Båda teknikerna exakt kvantifiera snabba förändringar cellulär adhesion och de-vidhäftningsprocesser. Cell-substrat impedans på mikroelektrod biosensor arrayer ger en plattform för robust, hög kapacitet mätningar. Levande cell imaging analyser ge ytterligare detaljer när det gäller typen och dynamiken på de morfologiska förändringarna kvantifieras genom cellsubstrat impedansmätningar. Dessa kompletterande metoder ger nya värdefulla insikter i hur myeloperoxidas-oxidativ modifiering av subcellulära extracellulära matrixkomponenter utlöser snabba förändringar i celladhesion, morfologi och signalering i endotelceller. Dessa metoder är också tillämpliga för att studera cellulära vidhäftningsdynamik som svar på andra matris modifiera stimuli och i relaterade vidhäftande celler (t.ex. epitelceller).
Introduction
Stabila självhäftande kontakter mellan celler och deras omgivande extracellulär matrix krävs för underhåll av vävnad homeostas. Till exempel, endotelceller vidhäftning till subendoteliala matrisen i blodkärl spelar en avgörande roll för att upprätthålla integriteten i endotelskiktet och dess homeostatiska funktion som en reglerande, semipermeabelt vaskulär barriär 1. Den aktin cytoskelettet är mekaniskt kopplad till limmatris molekyler vid platserna för cellmatris vidhäftning och vidhäftnings kontakter på cellmatrisgränssnitt spelar en viktig roll för att bestämma positionen av cellmembranet genom att motstå centralt riktade aktomyosin dragkrafter. Extracellulära stimuli som förändrar cellmatris vidhäftning nödvändigtvis förändrar styrke vid cellmatrisgränssnitt, en händelse som är snabbt "anade" av mekano känsliga signalproteiner, vilket resulterar i transduktion av "utanför-in signalering". Denna överhörning satsninglan celler och deras omgivande extracellulär matrix spelar en nyckelroll i att kontrollera cellform, motilitet, funktion, spridning och överlevnad 2.
Diverse patofysiologiska processer (embryonalutveckling, inflammation, sårläkning och cancermetastas) kännetecknas av dynamisk ombyggnad av klistermatrissubstrat genom matris förnedrande oxidanter och / eller enzymer 3,4. Exempelvis adhesiva subendoteliala matrixproteiner i blodkärlen (t.ex. fibronektin) är inblandade som viktiga mål för modifiering eller nedbrytning i humana inflammatoriska sjukdomar på grund av den lokaliserad produktion av reaktiva oxidanter (t.ex., hypoklorsyra, HOCl) av leukocyt-härledda enzymet myeloperoxidas (MPO), som ackumuleras inom subendotelet under inflammatorisk kärlsjukdom (Figur 1) 5-9. Förändringar i cell-matrix adhesion induceras av MPO-härledda oxidanter och andra matris modifiera stimuli är likely att spela viktiga roller i att ändra vaskulär homeostas under en mängd olika patologiska processer; t.ex., genom att förändra endotel cellsignalering, morfologi och livskraft, vilket i sin tur stör endotelfunktion och barriärintegritet. Men de morfologiska och cellsignalering svar vidhäftande celler till extracellulära matrix modifieringar bara börjat att förstå.
För att förstå hur matris modifieringar köra förändringar i cellvidhäftningsdynamik och adhesionsberoende cellsignalvägar är tekniker krävs att exakt kvantifiera förändringar i cellmatrix vidhäftning i realtid, med hög temporal upplösning. Här beskriver vi kompletterande cellsubstrat impedans och levande cellavbildningstekniker som uppfyller dessa kriterier och ge en plattform för att kvantifiera celladhesion och de-adhesionsprocesser på ett icke-invasivt sätt.
Vi visar hur dessa cell-substrat impedans och levande cell imaging lämpvärk kan lätt användas för att (i) övervaka dynamiken i cellvidhäftning och spridning (dvs., de novo celladhesion) på nativa och modifierade matrissubstrat och (ii) att mäta dynamiken i cell-matris avlossning (det vill säga, de-vidhäftning ) genom adherenta celler exponerade för matris-modifierande stimuli. Den xCELLigence cellsubstrat impedans biosensorsystem ger en kontinuerlig mätning av området med cellmatris kontakt genom att kvantifiera elektrisk impedans vid ytan av 96 brunnar guldmikroelektrod arrayer och uttrycker dessa elektriska impedansmätningar som "cell index", ett dimensionslöst värde som är i stort sett proportionell mot arean av cellsubstratkontakt 10 (figur 2), samtidigt som det är känsligt för förändringar i det genomsnittliga avståndet mellan den (isolerande) cellmembran och elektrodytan 11. En ytterligare ökning av cellindexvärden uppnås också vid bildning av tät cell-cellkontakter that begränsa paracellulär ström flyter, 11 förhållanden som inte råda inom de experiment som beskrivs i denna studie. Mätning av den projicerade ytan av enskilda celler över tiden genom bildanalys av tidsförlopp differential interferens kontrast (DIC) filmer ger en kompletterande mått på förändringar i området cellsubstratkontakt och ger ytterligare information om den exakta arten och dynamik morfologiska förändringar kvantifierade av cellsubstrat impedans tillvägagångssätt.
Specifikt beskriver vi tillämpningen av dessa metoder för att övervaka hur MPO-medierad oxidation av självhäftande subendoteliala matrixproteiner (t.ex. fibronektin) (i) minskar vidhäftningen av suspenderade endotelceller de novo på renat fibronektin och (ii) utlöser cellmatris de -adhesion i endotelceller med etablerad vidhäftning på fibronektin. Genom att utföra parallella cellsignalering analyser över tiden med hjälp av relevant biochemical analyser (t.ex., Western blotting), den tidsmässiga och orsakssambanden mellan adhesion / de-vidhäftningsprocesser och tillhörande förändringar i adhesionsberoende cellsignaleringshändelser kan fastställas.
Dessa metoder har nyligen använts för att visa att extracellulärmatrix oxidation katalyseras av subendoteliala fyndigheter av MPO utlöser en snabb förlust i cell-matrix vidhäftning av endotelceller som drivs av redan existerande aktomyosin sammandragande krafter 9. Viktigt genom att tidsförhållandet mellan förändringar i både celladhesion och adhesion beroende cellsignalering som skall fastställas, dessa tillvägagångssätt identifierat att MPO-inducerad matrismodifiering och cellulär de-adhesion utlöser förändringar i viktiga vidhäftningsberoende cellsignalvägar inklusive Src kinas -beroende paxillin fosforylering och myosin lätt kedja II fosforylering (Figur 1) 9. Detta läge av redox-beroende signalering, invOlving aktiveringen av intracellulära signaleringshändelser genom extracellulära oxidativa reaktioner som stör cellmatrisvidhäftning, representerar ett nytt läge av cellsignalering som benämns "utanför-in redox signalering" (fig 1) 9.
I allmänhet bör dessa kompletterande cellsubstrat impedans biosensor och levande cell imaging metoder vara värdefulla i att avslöja hur olika matris modifierande stimuli eller agenter driva förändringar i cellvidhäftningsdynamik, morfologi och signalering inom olika vidhäftande celltyper som omfattas av en mängd olika experimentella inställningar.
Följande protokoll beskriver hur man kvantifiera effekterna av MPO-medierad matris oxidation på de novo endotelcellsadhesion (experiment 1) och endotelceller de-adhesion (Experiment 2) processer. MPO binder glupskt till fibronektin och andra adhesiva subendoteliala extracellulära matrixproteiner och osses väteperoxid (H 2 O 2) att omvandla kloridjoner (Cl -) till den mycket reaktiva klorerings oxidant hypoklorsyra (HOCl), som reagerar lokalt med dessa matrisproteiner och stör deras cellvidhäftningsegenskaper (Figur 1) 8,9, 12.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cell-matrisvidhäftning och de-adhesionsprocesser kan kvantifieras noggrant i realtid med hög temporal upplösning med användning av cell-substrat impedans och levande cell imaging analyser. Dessa realtids metoder ger en stor fördel jämfört med slutpunkten analyser av celladhesion, vilket ger dålig tidsupplösning. Genom att noggrant kvantifiera snabba de-vidhäftnings svar med hög tidsupplösning, kan dessa analyser ger värdefull kunskap om hur morfologiska svar på matris modifieringar regleras och hur de påv…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by a National Health and Medical Research Council (NHMRC) Project Grant 568721 (SRT) and, in part, by a UNSW Faculty of Medicine Faculty Research Grant (MDR).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 96 well gold cell-substrate impedance microelectrode array | ACEA Biosciences / Roche | E-Plate 96 | single-use plate used for performing cell-based assays on the xCELLigence system |
| blebbistatin | Sigma | B0560 | selective inhibitor of non-muscle myosin-II |
| Bovine Aortic Endothelial Cells, cryopreserved | Lonza | BW-6001 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | 05470 | |
| EGM-2 BulletKit | Lonza | CC-3162 | endothelial cell growth media kit |
| Fibronectin, lyophilized powder | Sigma | F-4759 | from bovine plasma |
| Fluorodish 35 mm glass-bottomed cell culture dish | World Precision Instruments | FD35-100 | Cell cuture dish with optical quality glass bottom for imaging |
| Gelatin from bovine skin | Sigma | G9391 | cell culture substratum |
| Hank's Balanced Salt Solution | Life Technologies | 14025076 | |
| Hydrogen peroxide | Merck | 107298 | |
| Medium-199 | Life Technologies | 11150-059 | serum-free cell media |
| Methionine | Sigma | M9500 | quenches chlorinating oxidants generated by myeloperoxidase |
| Myeloperoxidase, Human Polymorphonuclear Leukocytes | Millipore | 475911 | |
| RTCA MP Instrument / xCELLigence cell substrate impedance system | ACEA Biosciences / Roche | – | Consists of RTCA Analyzer, RTCA (Multiple Plate) MP Station and RTCA Control Unit |
| Trypsin-EDTA (0.5%) | Gibco | 15400-054 |
References
- Wu, M. H. Endothelial focal adhesions and barrier function. J Physiol. 569, 359-366 (2005).
- Geiger, B., Yamada, K. M. Molecular architecture and function of matrix adhesions. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3, (2011).
- Rees, M. D., Kennett, E. C., Whitelock, J. M., Davies, M. J. Oxidative damage to extracellular matrix and its role in human pathologies. Free Radic Biol Med. 44, 1973-2001 (2008).
- Cox, T. R., Erler, J. T. Remodeling and homeostasis of the extracellular matrix: implications for fibrotic diseases and cancer. Dis Model Mech. 4, 165-178 (2011).
- Baldus, S., et al. Endothelial transcytosis of myeloperoxidase confers specificity to vascular ECM proteins as targets of tyrosine nitration. J Clin Invest. 108, 1759-1770 (2001).
- Baldus, S., et al. Spatial mapping of pulmonary and vascular nitrotyrosine reveals the pivotal role of myeloperoxidase as a catalyst for tyrosine nitration in inflammatory diseases. Free Radic Biol Med. 33, 1010-1019 (2002).
- Thomas, S. R., Witting, P. K., Drummond, G. R. Redox control of endothelial function and dysfunction: molecular mechanisms and therapeutic opportunities. Antioxid Redox Signal. 10, 1713-1765 (2008).
- Rees, M. D., et al. Myeloperoxidase-derived oxidants selectively disrupt the protein core of the heparan sulfate proteoglycan perlecan. Matrix Biol. 29, 63-73 (2010).
- Rees, M. D., et al. Targeted subendothelial matrix oxidation by myeloperoxidase triggers myosin II-dependent de-adhesion and alters signaling in endothelial cells. Free Radic Biol Med. 53, 2344-2356 (2012).
- Solly, K., Wang, X., Xu, X., Strulovici, B., Zheng, W. Application of real-time cell electronic sensing (RT-CES) technology to cell-based assays. Assay Drug Dev Technol. 2, 363-372 (2004).
- Giaever, I., Keese, C. R. Micromotion of mammalian cells measured electrically. Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 7896-7900 (1991).
- Vissers, M. C., Thomas, C. Hypochlorous acid disrupts the adhesive properties of subendothelial matrix. Free Radic Biol Med. 23, 401-411 (1997).
- Ziv, N. E., Schiller, J. Differential Interference Contrast (DIC) Imaging of Living Cells. CSH Protoc. 2007, (2007).
- Kennett, E. C., et al. Peroxynitrite modifies the structure and function of the extracellular matrix proteoglycan perlecan by reaction with both the protein core and the heparan sulfate chains. Free Radic Biol Med. 49, 282-293 (2010).
- Sen, S., Ng, W. P., Kumar, S. Contractility dominates adhesive ligand density in regulating cellular de-adhesion and retraction kinetics. Ann Biomed Eng. 39, 1163-1173 (2011).
- Wildt, B., Wirtz, D., Searson, P. C. Programmed subcellular release for studying the dynamics of cell detachment. Nat Methods. 6, 211-213 (2009).
