باستخدام الممانعة الخلوي الركيزة ويعيش التصوير خلية قياس التغييرات في الوقت الحقيقي في التصاق الخلوية ودي التصاق المستحث بواسطة مصفوفة تعديل
Summary
هنا، نقدم بروتوكول لتحديد باستمرار عمليات التصاق الخلايا وإزالة الالتصاق مع القرار الزماني عالية بطريقة غير الغازية التي كتبها مقاومة الخلايا الركيزة والتصوير الخلية الحية تحلل. هذه المقاربات تكشف ديناميات العمليات التصاق الخلية / دي التصاق الناجمة عن تعديل مصفوفة وعلاقتها الزمنية للأحداث الإشارات التي تعتمد على الالتصاق.
Abstract
خلية مصفوفة التصاق يلعب دورا رئيسيا في السيطرة على مورفولوجيا الخلايا والإشارة. وتورط المحفزات التي تعطل التصاق خلايا المصفوفة (على سبيل المثال، الميلوبيروكسيداز وغيرها من تأكسد-تعديل مصفوفة / الإنزيمات صدر خلال الالتهاب) في إحداث تغيرات مرضية في وظيفة الخلوي، والنمط الظاهري وقدرتها على البقاء في عدد من الأمراض. هنا، نحن تصف كيفية مقاومة خلايا الركيزة والنهج التصوير الخلية الحية يمكن استخدامه بسهولة للقياس بدقة التغييرات في الوقت الحقيقي في التصاق الخلايا وإزالة التصاق الناجمة عن تعديل المصفوفة (باستخدام الخلايا البطانية والميلوبيروكسيداز باعتباره المرضية في جسم المريض، تعديل مصفوفة الحوافز) مع القرار الزماني عالية وبطريقة غير الغازية. الخلية الركيزة نظام مقاومة xCELLigence الكمي بشكل مستمر مجال خلية مصفوفة التصاق عن طريق قياس مقاومة الكهربائية في واجهة خلية الركيزة في الخلايا المزروعة في صفائف مسرى مكروي الذهب. تحليل الصور من الوقت الفاصل بين مختلفاللمحاكمة الأفلام التدخل النقيض الكمي التغييرات في المنطقة المعروضة من الخلايا الفردية على مر الزمن، تمثل التغيرات في مجال خلايا مصفوفة للإتصال به. كلا تقنيات قياس بدقة التغيرات السريعة لعمليات التصاق الخلايا وإزالة الالتصاق. مقاومة الخلايا الركيزة على صفائف مسرى مكروي جهاز الاستشعار البيولوجي توفر منبرا للقياسات قوية، عالية الإنتاجية. يحلل تصوير الخلايا الحية تقديم تفاصيل إضافية بشأن طبيعة وديناميات التغيرات المورفولوجية كميا بواسطة القياسات مقاومة الخلايا الركيزة. وتوفر هذه المناهج التكميلية رؤى جديدة قيمة حول كيفية المحفز الميلوبيروكسيداز تعديل الأكسدة من التحت خلوية مكونات المصفوفة خارج الخلية يؤدي التغيرات السريعة في التصاق الخلية، مورفولوجيا ويشير في الخلايا البطانية. هذه الأساليب قابلة للتطبيق لدراسة ديناميات التصاق الخلوية ردا على غيرها من المحفزات-تعديل مصفوفة وخلايا ملتصقة ذات الصلة (مثل الخلايا الظهارية) أيضا.
Introduction
ويلزم الاتصالات لاصقة مستقرة بين الخلايا والمحيطة مصفوفة من خارج الخلية لصيانة توازن الأنسجة. على سبيل المثال، التصاق الخلايا البطانية لمصفوفة تحت البطانة في الأوعية الدموية تلعب دورا حاسما في الحفاظ على سلامة طبقة بطانة الأوعية الدموية وظيفة التماثل الساكن بوصفها التنظيمي، شبه منفذ الأوعية الدموية حاجز 1. ويقترن الهيكل الخلوي الأكتين ميكانيكيا لاصقة جزيئات المصفوفة في مواقع التصاق خلايا المصفوفة والاتصالات لاصقة في واجهة خلية مصفوفة تلعب دورا هاما في تحديد موقف من غشاء الخلية عن طريق مقاومة الموجهة مركزيا القوات الشد أكتوميوزين. المحفزات خارج الخلية التي تغير خلية مصفوفة التصاق يغير بالضرورة ميزان القوى في واجهة خلية مصفوفة، وهو الحدث الذي غير وجه السرعة "لمست من خلال البروتينات مما يشير الحساسة للوالميكانيكية، مما أدى إلى تنبيغ" خارج في الإشارات ". هذا الرهان عبر الحديثخلايا وين والمحيطة المصفوفة خارج الخلية التي تلعب دورا رئيسيا في التحكم في شكل الخلية، حركية، وظيفة، والانتشار والبقاء على قيد الحياة 2.
وتتميز عمليات patho الفسيولوجية المختلفة (التطور الجنيني، والتهاب، الجروح إصلاح والانبثاث سرطان) من خلال إعادة عرض ديناميكية من ركائز مصفوفة لاصقة من قبل تأكسد مصفوفة المهينة و / أو الإنزيمات 3،4. على سبيل المثال، لاصق البروتينات مصفوفة تحت البطانة في الأوعية الدموية (على سبيل المثال، فبرونيكتين) وتورط كأهداف رئيسية للتعديل أو تدهور في الأمراض الالتهابية الإنسان بسبب إنتاج المترجمة من تأكسد رد الفعل (على سبيل المثال، حمض تحت الكلور، HOCL) بواسطة انزيم المستمدة من الكريات البيض الميلوبيروكسيديز (MPO)، الذي يتراكم داخل تحت البطانة أثناء أمراض الأوعية الدموية التهابات (الشكل 1) 5-9. التغيرات في خلايا مصفوفة التصاق الناجم عن الأكسدة MPO المشتقة وغيرها من المحفزات-تعديل المصفوفة هي شابهاعل للعب أدوارا هامة في تغيير التوازن الأوعية الدموية خلال مجموعة متنوعة من العمليات المرضية؛ على سبيل المثال، عن طريق تغيير إشارات الخلية البطانية، مورفولوجيا وقدرتها على البقاء، وهذا بدوره يشوش ظيفة بطانة الأوعية الدموية وسلامة الحاجز. ومع ذلك، فإن الاستجابات يشير المورفولوجية وخلية من الخلايا الملتصقة على التعديلات المصفوفة خارج الخلية يست سوى بداية ليكون مفهوما.
لفهم كيفية تعديلات مصفوفة بالسيارة التغيرات في ديناميكية التصاق الخلية والخلية مسارات الإشارات التي تعتمد على الالتصاق، يطلب من التقنيات التي قياس بدقة التغيرات في خلايا مصفوفة التصاق في الوقت الحقيقي، مع القرار الزماني عالية. هنا، نحن تصف تكميلية مقاومة الخلايا الركيزة وتقنيات التصوير الخلية الحية التي تلبي هذه المعايير وتوفير منصة لتحديد التصاق الخلايا والعمليات دي التصاق بطريقة غير الغازية.
وتبين لنا كيف أن هذه مقاومة الخلايا الركيزة الحية وAPPRO التصوير الخليةآلام يمكن استخدامها بسهولة إلى (ط) مراقبة ديناميات مرفق الخلية ونشر (أي دي نوفو خلية التصاق) على ركائز مصفوفة الأم وتعديلها و (ثانيا) لقياس ديناميكية خلية مصفوفة مفرزة (أي دي-التصاق ) عن طريق الخلايا الملتصقة يتعرض للمؤثرات-تعديل مصفوفة. ويوفر النظام xCELLigence خلية الركيزة مقاومة جهاز الاستشعار البيولوجي والقياس المستمر من مساحة خلية مصفوفة الاتصال عن طريق قياس مقاومة الكهربائية على سطح 96-جيدا صفائف مسرى مكروي الذهب ويعبر عن هذه القياسات معاوقة باسم 'مؤشر الخلية "، وهي القيمة التي أبعاد غير متناسبة إلى حد كبير في مجال الخلايا الركيزة اتصال 10 (الشكل 2)، في حين يجري أيضا حساسة للتغيرات في متوسط المسافة بين (العازلة) غشاء الخلية وسطح القطب 11. وتحققت زيادة أخرى في قيم مؤشر الخلية أيضا على تشكيل ضيق الاتصالات خلية خلية ثار تقييد التدفقات الحالية paracellular، 11 الظروف التي لا تسود داخل التجارب الموضحة في هذه الدراسة. قياس مجال المتوقعة من الخلايا الفردية على مر الزمن من خلال تحليل الصور من الوقت الفاصل بين تدخل الفرق النقيض (DIC) الأفلام توفر تدبير مكمل للتغيرات في مجال الخلايا الركيزة الاتصال ويوفر معلومات إضافية بشأن طبيعة ودينامية الدقيقة لل التغيرات المورفولوجية كميا من قبل نهج مقاومة الخلايا الركيزة.
على وجه التحديد، وصفنا تطبيق هذه المناهج لمراقبة كيفية أكسدة البروتينات مصفوفة لاصقة تحت البطانة (على سبيل المثال، فبرونيكتين) (ط) MPO بوساطة يقلل من التصاق دي نوفو من الخلايا البطانية علقت على فبرونيكتين تنقيته و (ثانيا) يطلق خلية مصفوفة دي -adhesion في الخلايا البطانية مع التصاق أنشئت في فبرونيكتين. عن طريق أداء الخلايا مما يشير الى موازية يحلل بمرور الوقت باستخدام الكيميائية الحيوية ذات الصلةيمكن تحديد المقايسات كال (على سبيل المثال، النشاف الغربي)، والعلاقات الزمانية والسببية بين العمليات التصاق / دي التصاق والتغيرات المرتبطة بها في الخلية إشارات الأحداث التي تعتمد على الالتصاق.
وقد استخدمت هذه النهج في الآونة الأخيرة لإثبات أن الأكسدة المصفوفة خارج الخلية يحفزه الودائع تحت البطانة من MPO يتسبب في فقدان سريع في خلايا مصفوفة التصاق الخلايا البطانية التي يقودها قوات أكتوميوزين مقلص الموجودة من قبل 9. الأهم من ذلك، من خلال تمكين العلاقة الزمنية بين التغيرات في كل من التصاق الخلية والخلية التصاق التي تعتمد يشير إلى أن تحدد، هذه النهج حددت أن MPO التي يسببها تعديل مصفوفة والخلوية دي التصاق يؤدي تغيرات في الخلايا مسارات إشارات تعتمد على الالتصاق الهامة بما في ذلك SRC كيناز معتمد على الفسفرة paxillin والضوء ميوسين سلسلة II الفسفرة (الشكل 1) 9. هذا النمط من الأكسدة التي تعتمد على الإشارات، الجردolving تفعيل الأحداث الإشارات بين الخلايا من خلال ردود الفعل الأكسدة خارج الخلية التي تعطل خلية مصفوفة التصاق، يمثل وضع رواية من خلية اشارة صفتهم "خارج في الأكسدة الإشارات" (الشكل 1) 9.
بشكل عام، يجب أن تكون هذه مكملة جهاز الاستشعار البيولوجي مقاومة الخلايا الركيزة والنهج التصوير الخلية الحية قيمة في الكشف عن مدى اختلاف المحفزات-تعديل مصفوفة أو وكلاء بالسيارة التغيرات في ديناميكية التصاق الخلية، مورفولوجيا ويشير في مختلف ملتصقة الخلية أنواع تخضع لمجموعة واسعة من إعدادات التجريبية.
يصف بروتوكول التالية كيفية قياس أثر MPO بوساطة الأكسدة مصفوفة على دي نوفو التصاق بطانة الخلية (تجربة 1) والبطانية خلية دي التصاق (تجربة 2) العمليات. MPO يربط بشوق إلى فبرونيكتين وغيرها تحت البطانة البروتينات المصفوفة خارج الخلية لاصقة ولناوفاق بيروكسيد الهيدروجين (H 2 O 2) لتحويل أيونات الكلوريد (الكلور -) إلى شديدة التفاعل الكلورة أكسدة حمض تحت الكلور (HOCL)، الذي يتفاعل محليا مع هذه البروتينات المصفوفة ويعطل ممتلكاتهم لاصقة الخلية (الشكل 1) 8،9، 12.
Protocol
Representative Results
Discussion
يمكن قياسها كميا التصاق خلايا المصفوفة وعمليات نزع التصاق بدقة في الوقت الحقيقي لقرار زمنية عالية باستخدام مقاومة الخلايا الركيزة والتصوير الخلية الحية يحلل. وتوفر هذه النهج في الوقت الحقيقي ميزة كبيرة على تحليلات نقطة النهاية من التصاق الخلية، والتي توفر ضعف القر…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by a National Health and Medical Research Council (NHMRC) Project Grant 568721 (SRT) and, in part, by a UNSW Faculty of Medicine Faculty Research Grant (MDR).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 96 well gold cell-substrate impedance microelectrode array | ACEA Biosciences / Roche | E-Plate 96 | single-use plate used for performing cell-based assays on the xCELLigence system |
| blebbistatin | Sigma | B0560 | selective inhibitor of non-muscle myosin-II |
| Bovine Aortic Endothelial Cells, cryopreserved | Lonza | BW-6001 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | 05470 | |
| EGM-2 BulletKit | Lonza | CC-3162 | endothelial cell growth media kit |
| Fibronectin, lyophilized powder | Sigma | F-4759 | from bovine plasma |
| Fluorodish 35 mm glass-bottomed cell culture dish | World Precision Instruments | FD35-100 | Cell cuture dish with optical quality glass bottom for imaging |
| Gelatin from bovine skin | Sigma | G9391 | cell culture substratum |
| Hank's Balanced Salt Solution | Life Technologies | 14025076 | |
| Hydrogen peroxide | Merck | 107298 | |
| Medium-199 | Life Technologies | 11150-059 | serum-free cell media |
| Methionine | Sigma | M9500 | quenches chlorinating oxidants generated by myeloperoxidase |
| Myeloperoxidase, Human Polymorphonuclear Leukocytes | Millipore | 475911 | |
| RTCA MP Instrument / xCELLigence cell substrate impedance system | ACEA Biosciences / Roche | – | Consists of RTCA Analyzer, RTCA (Multiple Plate) MP Station and RTCA Control Unit |
| Trypsin-EDTA (0.5%) | Gibco | 15400-054 |
References
- Wu, M. H. Endothelial focal adhesions and barrier function. J Physiol. 569, 359-366 (2005).
- Geiger, B., Yamada, K. M. Molecular architecture and function of matrix adhesions. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3, (2011).
- Rees, M. D., Kennett, E. C., Whitelock, J. M., Davies, M. J. Oxidative damage to extracellular matrix and its role in human pathologies. Free Radic Biol Med. 44, 1973-2001 (2008).
- Cox, T. R., Erler, J. T. Remodeling and homeostasis of the extracellular matrix: implications for fibrotic diseases and cancer. Dis Model Mech. 4, 165-178 (2011).
- Baldus, S., et al. Endothelial transcytosis of myeloperoxidase confers specificity to vascular ECM proteins as targets of tyrosine nitration. J Clin Invest. 108, 1759-1770 (2001).
- Baldus, S., et al. Spatial mapping of pulmonary and vascular nitrotyrosine reveals the pivotal role of myeloperoxidase as a catalyst for tyrosine nitration in inflammatory diseases. Free Radic Biol Med. 33, 1010-1019 (2002).
- Thomas, S. R., Witting, P. K., Drummond, G. R. Redox control of endothelial function and dysfunction: molecular mechanisms and therapeutic opportunities. Antioxid Redox Signal. 10, 1713-1765 (2008).
- Rees, M. D., et al. Myeloperoxidase-derived oxidants selectively disrupt the protein core of the heparan sulfate proteoglycan perlecan. Matrix Biol. 29, 63-73 (2010).
- Rees, M. D., et al. Targeted subendothelial matrix oxidation by myeloperoxidase triggers myosin II-dependent de-adhesion and alters signaling in endothelial cells. Free Radic Biol Med. 53, 2344-2356 (2012).
- Solly, K., Wang, X., Xu, X., Strulovici, B., Zheng, W. Application of real-time cell electronic sensing (RT-CES) technology to cell-based assays. Assay Drug Dev Technol. 2, 363-372 (2004).
- Giaever, I., Keese, C. R. Micromotion of mammalian cells measured electrically. Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 7896-7900 (1991).
- Vissers, M. C., Thomas, C. Hypochlorous acid disrupts the adhesive properties of subendothelial matrix. Free Radic Biol Med. 23, 401-411 (1997).
- Ziv, N. E., Schiller, J. Differential Interference Contrast (DIC) Imaging of Living Cells. CSH Protoc. 2007, (2007).
- Kennett, E. C., et al. Peroxynitrite modifies the structure and function of the extracellular matrix proteoglycan perlecan by reaction with both the protein core and the heparan sulfate chains. Free Radic Biol Med. 49, 282-293 (2010).
- Sen, S., Ng, W. P., Kumar, S. Contractility dominates adhesive ligand density in regulating cellular de-adhesion and retraction kinetics. Ann Biomed Eng. 39, 1163-1173 (2011).
- Wildt, B., Wirtz, D., Searson, P. C. Programmed subcellular release for studying the dynamics of cell detachment. Nat Methods. 6, 211-213 (2009).
