Summary
Qui, vi presentiamo un protocollo per quantificare continuamente i processi di adesione cellulare e de-adesione con alta risoluzione temporale in modo non invasivo per impedenza cellule-substrato e imaging cellulare dal vivo analisi. Questi approcci rivelano le dinamiche dei processi di adesione cellulare / de-adesione innescato da modifica della matrice e la loro relazione temporale con gli eventi di segnalazione adesione-dipendente.
Abstract
Adesione cellulare matrice gioca un ruolo chiave nel controllo della morfologia cellulare e di segnalazione. Stimoli che sconvolgono l'adesione cellula-matrice (ad esempio, la mieloperossidasi e altri ossidanti matrice-modifica / enzimi rilasciati durante l'infiammazione) sono implicati nella innescare cambiamenti patologici in funzione cellulare, fenotipo e la vitalità in una serie di malattie. Qui, descriviamo come impedenza cell-substrato e approcci di imaging cellulare dal vivo possono essere facilmente impiegati per quantificare con precisione i cambiamenti in tempo reale di adesione cellulare e de-adesione indotta da modifiche alla matrice (utilizzando cellule endoteliali e la mieloperossidasi come stimolo matrice modificando fisiopatologico) con alta risoluzione temporale e in modo non invasivo. Il sistema di impedenza della cella-substrato xCELLigence quantifica continuamente la zona di adesione cellula-matrice misurando l'impedenza elettrica all'interfaccia cellula-substrato in cellule cresciute su array di microelettrodi oro. L'analisi delle immagini di time-lapse differenziale film contrasto interferenze quantifica variazione dell'area proiettata di singole cellule nel tempo, rappresentano variazioni dell'area di contatto cellula-matrice. Entrambe le tecniche quantificare con precisione rapidi cambiamenti dei processi di adesione cellulare e de-adesione. Impedenza Cell-substrato su array microelettrodo biosensori fornisce una piattaforma per le misure robusta, ad alta produttività. Imaging cellulare dal vivo analizza fornire ulteriori dettagli circa la natura e la dinamica dei cambiamenti morfologici quantificati da misure di impedenza cella-substrato. Questi approcci complementari forniscono nuove preziose intuizioni come mieloperossidasi-catalizzata ossidativo modifica dei componenti della matrice extracellulare subcellulari innesca rapidi cambiamenti di adesione cellulare, la morfologia e di segnalazione nelle cellule endoteliali. Questi approcci sono applicabili per studiare dinamiche di adesione cellulare in risposta ad altri stimoli matrice modificanti e in cellule aderenti correlate (ad esempio, cellule epiteliali) anche.
Introduction
Contatti adesivi stabili tra le cellule e la loro matrice extracellulare che circonda sono necessari per mantenere l'omeostasi tissutale. Per esempio, l'adesione delle cellule endoteliali alla matrice sottoendoteliale nei vasi sanguigni gioca un ruolo critico nel mantenere l'integrità dello strato endoteliale e la sua funzione omeostatica come normativo, semi-permeabile barriera vascolare 1. Il citoscheletro actina è accoppiato meccanicamente ad adesivo molecole della matrice in siti di adesione cellula-matrice e contatti adesivo all'interfaccia cellula-matrice svolgere un ruolo importante nel determinare la posizione della membrana cellulare resistendo centralmente dirette forze di trazione actomiosina. Stimoli extracellulari che alterano l'adesione cellula-matrice necessariamente alterare l'equilibrio delle forze all'interfaccia cellula-matrice, un evento che è rapidamente 'percepite' di proteine di segnalazione meccano-sensibili, causando la trasduzione di "outside-in di segnalazione". Questa scommessa cross-talkcellule Ween e la loro matrice extracellulare che circonda svolge un ruolo chiave nel controllo la forma delle cellule, la motilità, la funzione, la proliferazione e la sopravvivenza 2.
Processi patofisiologici Varie (sviluppo embrionale, infiammazione, riparazione delle ferite e le metastasi del cancro) sono caratterizzati da rimodellamento dinamico di substrati matrice adesivo ossidanti e / o enzimi 3,4 matrice-degradanti. Ad esempio, proteine della matrice adesiva subendoteliali nei vasi sanguigni (es, fibronectina) sono implicati come obiettivi principali per la modifica o la degradazione in malattie infiammatorie umane a causa della produzione localizzata di ossidanti reattivi (per esempio, acido ipocloroso, HOCl) dall'enzima leucociti derivato mieloperossidasi (MPO), che si accumula all'interno del subendothelium durante malattia vascolare infiammatoria (Figura 1) 5-9. Variazioni di adesione cellula-matrice indotte da ossidanti MPO-derivati e altri stimoli matrice-modifica sono likely a giocare un ruolo importante nel modificare l'omeostasi vascolare durante una varietà di processi patologici, ad esempio, alterando la segnalazione delle cellule endoteliali, la morfologia e la vitalità, che a sua volta perturba funzione endoteliale e integrità della barriera. Tuttavia, le risposte di segnalazione morfologiche e cellulari delle cellule aderenti a modifiche della matrice extracellulare stanno solo iniziando a essere capito.
Per capire come le modifiche di matrice auto cambiamenti nelle dinamiche di adesione cellulare e delle cellule vie di segnalazione di adesione-dipendente, le tecniche, sono necessari a quantificare con precisione i cambiamenti in adesione cellula-matrice in tempo reale, con alta risoluzione temporale. Qui, descriviamo complementare impedenza cell-substrato e tecniche di imaging cellulare dal vivo che soddisfano questi criteri e fornire una piattaforma per quantificare l'adesione delle cellule e dei processi di de-adesione in modo non invasivo.
Mostriamo come questi impedenza della cella-substrato e vivo appro imaging cellularedolori possono essere facilmente impiegati per (i) monitorare le dinamiche di attaccamento cellulare e diffusione (cioè, de novo adesione cellulare) su substrati matrice nativi e modificati e (ii) per misurare le dinamiche di distacco cellula-matrice (cioè, de-aderenza ) da parte delle cellule aderenti esposte a stimoli matrice-modifica. Il sistema xCELLigence cellula-substrato biosensore impedenza fornisce una misurazione continua della superficie di contatto cellula-matrice quantificando impedenza elettrica alla superficie 96 pozzetti array oro microelettrodi ed esprime queste misurazioni dell'impedenza elettrici come 'indice di cellule', un valore adimensionale che è sostanzialmente proporzionale all'area di cellula-substrato contatto 10 (figura 2), mentre anche essendo sensibile alle variazioni della distanza media tra la (isolante) membrana cellulare e la superficie dell'elettrodo 11. Un ulteriore aumento dei valori di indice cella è ottenuta anche sulla formazione di stretto contatto cellula-cellula that limitare i flussi di corrente paracellulare, 11 condizioni che non prevalgono nei esperimenti descritti in questo studio. Misurazione della superficie proiettata delle singole cellule nel tempo per l'analisi delle immagini di time-lapse contrasto di interferenza differenziale (DIC) film fornisce una misura complementare di variazioni dell'area di contatto cellula-substrato e fornisce ulteriori informazioni sulla natura esatta e la dinamica del cambiamenti morfologici quantificati dall'approccio impedenza cellula-substrato.
In particolare, si descrive l'applicazione di questi approcci per monitorare come ossidazione delle proteine della matrice subendoteliale adesivi (ad esempio, fibronectina) (i) MPO-mediata riduce l'adesione de novo di cellule endoteliali sospese su fibronectina purificato e (ii) innesca cellula-matrice de -adhesion in cellule endoteliali, con l'adesione stabilito sulla fibronectina. Eseguendo segnalazione cellulare parallela analisi nel tempo utilizzando biochem rilevantesaggi iCal (ad esempio, blotting occidentale), le relazioni temporali e causali tra i processi di adesione / de-adesione e cambiamenti associati nella segnalazione cellulare eventi adesione-dipendente può essere determinato.
Questi approcci sono stati recentemente utilizzati per dimostrare che l'ossidazione della matrice extracellulare catalizzata da depositi subendoteliali di MPO innesca una rapida perdita di adesione cellula-matrice delle cellule endoteliali che è guidato da preesistenti forze actomiosina contrattili 9. È importante sottolineare che, consentendo la relazione temporale tra cambiamenti sia adesione delle cellule e delle cellule di adesione-dipendente di segnalazione da stabilirsi, questi approcci identificati che modifica matrice MPO-indotta e cellulare de-adesione innesca cambiamenti di importanti vie di segnalazione delle cellule adesione-dipendente tra cui Src chinasi -dipendente fosforilazione paxillina e leggera della miosina catena II fosforilazione (Figura 1) 9. Questa modalità di segnalazione redox-dipendente, involving l'attivazione di eventi di segnalazione intracellulare da reazioni ossidative extracellulari che inficiano l'adesione cellula-matrice, rappresenta una nuova modalità di segnalazione cellulare denominato "fuori-nella segnalazione redox" (Figura 1) 9.
In generale, questi complementare biosensore impedenza cell-substrato e approcci di imaging cellulare dal vivo dovrebbero essere utili nel rivelare come i diversi stimoli o agenti matrice-modificando auto cambiamenti nelle dinamiche di adesione cellulare, morfologia e segnalazione all'interno di diversi tipi di cellule aderenti soggette a una vasta gamma di impostazioni sperimentali.
Il protocollo segue descrive come quantificare l'impatto di ossidazione matrice MPO-mediata su de novo di adesione delle cellule endoteliali (Esperimento 1) e cellule endoteliali de-adesione (Esperimento 2) processi. MPO lega avidamente alla fibronectina e altre proteine della matrice extracellulare subendoteliali adesivi e cies perossido di idrogeno (H 2 O 2) per convertire ioni cloruro (Cl -) al altamente reattivo clorurante ossidante acido ipocloroso (HOCl), che reagisce localmente con queste proteine della matrice e disturba le loro proprietà adesive delle cellule (Figura 1) 8,9, 12.
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Protocol
1. Generale Endothelial Cell Culture
- Culture bovina cellule endoteliali aortiche (passaggi 4-9) su gelatina rivestita fiasche di coltura tissutale (rivestimento superficiale coltura tissutale con 0,1% w / v di gelatina in PBS a temperatura ambiente per 15 min) in EGM-2 supporti (con l'EGM-2 proiettile kit contenente siero bovino fetale 5%, fattori di crescita e tutti gli integratori fornite dal produttore, tranne idrocortisone).
- Quando le cellule sono quasi confluenti (circa 3 giorni dopo la semina dopo un 1: 4 split), cellule raccolto mediante trattamento con 0,05% w / v tripsina / 0.02% w / v EDTA in PBS a 37 ° C. Dopo la maggioranza delle cellule sono distaccato, aggiungere completi EGM-2 supporti per placare la tripsina e centrifugare (100 xg, 5 min).
- Preparare cellule per studi sull'adesione de novo di cellule endoteliali a fibronectina (Esperimento 1: Sezione 2) e la successiva de-adesione delle cellule endoteliali con adesione stabilita su tale substrato (Esperimento 2: Sezione 3).
- Lavare raccoltecellule una volta con senza siero Medium 199 contenente 1% w / v di albumina sierica bovina (BSA) e ri-centrifuga (100 xg, 5 min).
- Risospendere le cellule in senza siero Medium 199 contenente 1% w / v BSA a 2,5 x 10 5 cellule / ml (misure di impedenza cell-substrato) o 5 x 10 5 cellule / ml (analisi di imaging cellulare dal vivo) e mantenere a 37 ° C prima dell'uso.
NOTA: Le risposte adesione delle cellule sono molto sensibili alle differenze di temperatura (ad esempio, a causa di effetti di convezione) così tutte le apparecchiature e le soluzioni utilizzati per gestire e trattare cellule durante i seguenti protocolli devono essere mantenuti ad una temperatura costante di 37 ° C.
2. Esperimento 1: Quantificare De Novo endoteliale Adesione cellulare su Native e MPO-ossidato fibronectina (impedenza Cell-substrato)
NOTA: Esperimento 1 esamina il grado di MPO-mediata ossidazione della fibronectina compromette la capacità di supportare de novo
- Cappotto fibronectina su 96 pozzetti cell-substrato matrici di microelettrodi impedenza oro. Aggiungere 80 ml / pozzetto di purificata bovina fibronectina a 5 ug / ml in PBS, incubare per 2 ore a 37 ° C e rimuovere la soluzione.
- Incubare superfici fibronectina rivestite con MPO per consentire il legame di MPO alla fibronectina superficiale legata. Aggiungere 80 ml / pozzetto di purificato MPO neutrofili umani a 20 nM in soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) e incubare per 0,5 ore a 37 ° C.
- Lavare superfici due volte con HBSS per rimuovere non legato MPO.
- Aggiungere H 2 O 2 (0-10 mM concentrazione finale) per i pozzetti della piastra matrice microelettrodo contenente 80 microlitri / pozzetto HBSS di avviare MPO-catalizzata, HOCl-dipendente fibronectina ossidazione e incubare per altri 0,5 ore a 37 ° C.
- Per esaminare l'effetto degli inibitori rilevanti o modulatori di reazioni MPO-catalizzate (ad esempio, alternativa MPO enzimisubstrati, inibitori enzimatici o antiossidanti; vedi 9 per i dettagli), aggiungerli al HBSS immediatamente prima H 2 O 2 aggiunta.
- Dopo 0,5 ore, il trattamento di superfici con metionina per placare residue specie ossidanti superficie-bound, cioè, clorammine legati alle proteine reattive, che possono esercitare attività cellulari confondenti. Aggiungi metionina 10 mm di 80 microlitri HBSS per pozzetto e incubare per 10 min a 37 ° C.
- Block superfici con BSA. Aggiungere 80 ml / pozzetto di BSA allo 0,2% w / v in PBS, incubare per 2 ore a 37 ° C e rimuovere la soluzione.
NOTA: regioni superficiali non rivestite residui sosterrà l'adesione cellulare e bloccando questi con una proteina non adesivo (cioè, BSA) assicura che le risposte adesione cellulare strettamente dipendono dalla matrice di celle adesivo purificato impiegato, in questo caso fibronectina. - Lavare superfici due volte con HBSS.
NOTA: Nessuno dei trattamenti superficiali precedenti influisce sensibilmente cellula-substrato readings. - Seed cellule endoteliali in sospensione (aggiungere 200 microlitri / bene a circa 2,5 x 10 5 cellule / ml, preparati in senza siero Medium 199 contenente BSA 1%; vedere 1.3) sulle superfici fibronectina rivestite nativi o MPO-ossidati.
- Immediatamente dopo la semina di cellule (cioè, prima di qualsiasi attaccamento cellulare e diffusione), montare la piastra matrice microelettrodo sulla porta incubatore (ospitato in un 37 ° C incubatore in presenza di 2 5% CO).
- Utilizzando il software dello strumento prendere immediatamente un 'blank' lettura per normalizzare successiva impedenza cellula-substrato ('index cell') valori ai valori iniziali di fondo ottenuti in assenza di cellula-aderenza.
- Avviare l'acquisizione dei dati di indice delle cellule continue (minimo di una cella dell'indice di lettura / min).
- Incubare le cellule a 37 ° C e 5% CO 2 per 2 ore, un periodo di tempo durante il quale l'adesione cellulare e la massima diffusione è realizzato; questo si rifletteun plateauing dei valori di indice cella (si veda la Figura 3A).
NOTA: L'esperimento precedente (Esperimento 1) esamina come iniziale ossidazione MPO-mediata della fibronectina limita la capacità delle cellule endoteliali a stabilire l'adesione cellulare su questo substrato. Il seguente esperimento (Esperimento 2) esamina come MPO-mediata ossidazione fibronectina promuove diminuzioni adesione cellula-matrice (cioè de-adesione) in cellule endoteliali, con l'adesione stabilito su questo substrato. I trattamenti in questi due esperimenti sono essenzialmente identici, eccetto per i tempi di ossidazione MPO-mediata fibronectina (cioè prima adesione cellulare - Esperimento 1, dopo l'adesione cellulare - Esperimento 2).
3. Esperimento 2: Quantificare cellule endoteliali De-adesione da fibronectina in risposta a MPO-mediata fibronectina ossidazione (impedenza Cell-substrato e Imaging Live Cell)
- Cappotto fibronectina su 96 pozzetti oro microelettrodo unrrays per misure di impedenza cell-substrato (aggiungere 80 ml / pozzetto di fibronectina a 5 mg / ml in PBS e incubare per 2 ore a 37 ° C) o 35 millimetri dal fondo di vetro piatti di coltura cellulare per le analisi di imaging cellulare dal vivo (aggiungere 2 ml / piatto di fibronectina a 5 ug / ml in PBS ed incubare per 2 ore a 37 ° C).
- Block superfici con BSA. Aggiungere BSA allo 0,2% w / v in PBS a volumi indicati in 3.1 e incubare per 2 ore a 37 ° C.
- Incubare superfici con MPO per consentire il legame di MPO alla fibronectina. Aggiungere 20 nM purificato MPO umana in HBSS ai volumi indicati in 3.1 e incubare per 0,5 ore a 37 ° C.
- Lavare superfici due volte con HBSS per rimuovere non legato MPO.
- Seed cellule endoteliali in sospensione (preparati in Medium 199 contenente 1% w / v BSA senza siero, vedi 1.3) sulle superfici rivestite fibronectina nativi o MPO-cuscinetto.
- Aggiungere 200 microlitri / pozzetto di 2,5 x 10 5 cellule / ml a 96 e cellula-substrato array di microelettrodi impedenza. <li> Aggiungi 2 ml / piatto a 5 x 10 5 cellule / ml a 35 millimetri di vetro piatti di coltura cellulare fondo.
- Mount 96 pozzetti di matrice microelettrodo sul porto incubatore impedenza cell-substrato (ospitato in un 37 ° C incubatore in presenza del 5% 2 CO) e le letture "in bianco" per avviare l'acquisizione continua di dati di indice delle cellule (cf. Sezione 2.10 ).
- Trasferimento 35 millimetri fondo di vetro piatti di coltura cellulare ad un 37 ° C incubatore in presenza di 5% CO 2.
NOTA: HBSS viene impiegato quando si studia MPO-catalizzate reazioni ossidative invece di terreni di coltura completo come quest'ultimo contiene specie ossidabili che interferiscono con le reazioni di ossidazione.
NOTA: dopo 0,5 ore equilibrio in HBSS, valori di indice cella si stabilizzano su valori leggermente inferiori; quando pre-incubando le cellule con i substrati di enzimi, enzimi e gli inibitori di segnalazione cellulare o antiossidanti, prima assicurarsi che these non incidono in modo significativo i valori ottenuti dopo il raggiungimento dell'equilibrio.
- Per gli studi di impedenza cellulari utilizzando 96 e piastre di matrice microelettrodi:
- Rimuovere la piastra matrice microelettrodo dal termostato e mettere in pausa le misurazioni dell'indice cellulare.
- Aggiungi H 2 O 2 (concentrazione finale di 0-10 micron) per la HBSS e mescolare delicatamente pipettando ripetute.
- Immediatamente, ri-montare la matrice microelettrodo indietro sulla C porto incubatore 37 ° e ri-iniziare l'acquisizione di letture indice cellulare.
- Per gli studi di imaging cellulare dal vivo con piastra da 35 mm con fondo trasparente coltura cellulare:
- Rimuovere il piatto cultura dal termostato e montare su un C palco riscaldato di un microscopio confocale invertito dotato di una lente obiettivo 63X acqua con ottica DIC adatti per la registrazione di filmati cellule vive 37 °.
- Concentrarsi sulle cellule eottimizzare ottica DIC (illuminazione Köhler, ritardo pregiudizi e fotocamera offset / guadagno, per i dettagli, vedi 13).
- Avviare film DIC e registrare le letture di base di cellule non trattate per 1 min.
- Aggiungi H 2 O 2 (concentrazione finale di 0-10 micron) e mescolare delicatamente pipettando ripetute. Rimettere a fuoco il microscopio (se necessario) e continuare la registrazione DIC filmati delle cellule trattate per il periodo di tempo richiesto.
4. Analisi dei dati e presentazione
- Dati impedenza Cell-substrato
- Esportazione dati grezzi (indice rispetto al tempo delle cellule) in un foglio di calcolo.
- Per gli studi di cellule de-adesione (Esperimento 2: Sezione 3), normalizzare i dati impostando valori registrati immediatamente prima dell'inizio della MPO-mediata ossidazione fibronectina per un valore di 1 (vale a dire, immediatamente prima dell'aggiunta di H 2 O 2 a 3.11 .1.1).
NOTA: Questo assicura che relativacambiamenti nei valori di indice delle cellule indotte da MPO-mediata ossidazione fibronectina non vengono mascherati da piccole differenze iniziali nei valori tra pozzi di indice cella assoluti.- I dati attuali come trame di indice normalizzato cellulare (asse y) in funzione del tempo (asse x).
- Dati di imaging cellulare dal vivo (studi delle cellule de-adesione in Esperimento 2: Sezione 3)
- Aprire DIC vivono film di imaging cellulare registrati immediatamente prima e dopo l'apertura di MPO-mediata ossidazione fibronectina in un programma di analisi di immagine standard (ad esempio, il software ImageJ).
- In almeno due film separati DIC casualmente selezionare più celle e misurare la loro area proiettata in fotogrammi in sequenza (ad esempio, a intervalli di 1 min) tracciando manualmente il loro vantaggio a membrana e quantificare il numero di pixel chiusi.
- Esportazione dati grezzi (area di cella proiettata rispetto al tempo) di un foglio di calcolo Excel e normalizzare dati dell'area cella impostando valori registrati immediatamente primal'apertura di MPO-mediata ossidazione fibronectina ad un valore di 1 (cioè, immediatamente prima dell'aggiunta di H 2 O 2 in 3.11.2.3).
- Presentare i dati come un terreno di zona normalizzata cellulare (asse y) in funzione del tempo (asse x).
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Representative Results
In tempo reale quantificazione delle cellule endoteliali de-adesione da fibronectina in risposta ad ossidazione fibronectina MPO-mediata (Esperimento 2). La semina di sospensioni cellulari endoteliali su nativo (MPO gratuito) fibronectina o MPO-cuscinetto risultati fibronectina in allegato cellule massima e la diffusione in 2 ore, come giudicato da un plateauing di valori di indice cella nella misure di impedenza substrato cellulare (Figura 3A). Questa fase iniziale di adesione delle cellule e la diffusione è notevolmente ridotto quando viene avviato MPO-mediata ossidazione fibronectina prima semina delle cellule in esperimenti eseguiti secondo il protocollo dettagliato nel Experiment 1 (dati non mostrati, per dettagli vedere 9). Dopo l'adesione cellulare massimo viene stabilito sulla fibronectina nativo o MPO-cuscinetto, mirato fibronectina ossidazione mediata da MPO catalizzata HOCl (iniziata dall'aggiunta di MPO di co-substrato H 2 O 2) provoca una rapida diminuzione del surarea di fronte a contatto cellula-matrice misurata dalla impedenza cell-substrato (Figura 3A, B) e l'imaging cellulare dal vivo (Figura 3C, per un rappresentante di film DIC, vedere film 1; indice cella o dell'area cella perdite dopo H 2 O 2, oltre sono minime in assenza di MPO 9). Mentre indice cellulare e dintorni cella cambia durante MPO-indotta de-adesione erano molto simili, le diminuzioni relativamente lenti a valori di indice cellule possono riflettere gli effetti isolanti dei materiali di membrana presenti nelle regioni 'cell-free "alla periferia cellulare durante de- adesione, che non sono quantificati alla proiettate misurazioni dell'area cellulare. La rapida cellulari de-aderenza apparente in cellule endoteliali legate alla fibronectina MPO-cuscinetto in risposta ad H 2 O 2 trattamento è assente nelle cellule trattate con H 2 O 2 da solo (cioè, le cellule che non contengono MPO) (Figura 3A) e è bloccato binibitori dell'enzima y MPO o spazzini HOCl (dati non illustrati; vedi 9 per i dettagli), individuando che questo processo dipende dalla produzione MPO-catalizzata di HOCl (vedi figura 1). L'inibizione della funzione motoria miosina II con blebbistatin inibisce il tasso di cellule endoteliali de-adesione misurata dalla impedenza cell-substrato (Figura 3B) e l'imaging cellulare dal vivo (Figura 3C, Movie 2), individuando che cellulari de-adesione e la contrazione in risposta a MPO-catalizzata ossidazione matrice subcellulare è guidato da forze actomiosina trazione 9.
Figura 1. MPO-mediata ossidazione matrice subcellulare attiva cellula-matrice de-adesione e di segnalazione cellulare. MPO innesca risposte de-adesione rapidi e cambiamenti nella segnalazione di adesione-dipendente mediando o miratassidazione di proteine della matrice subendoteliali adesive, che coinvolgono i seguenti eventi 9: (A) MPO lega avidamente alla matrice sottoendoteliale e utilizza H 2 O 2 per generare l'ossidante altamente reattivo che reagisce HOCl localmente con proteine della matrice (ad esempio, fibronectina) e disturba loro cella proprietà adesive. (B) Questo danno interrompe i contatti adesivo all'interfaccia cellula-matrice, che porta alla retrazione (C) membrana guidata da tensione incontrastato nel citoscheletro e l'alterazione delle cellule vie di segnalazione di adesione-dipendente (riprodotto con il permesso di Rees et al. 9 ). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figure 2. Work-flow e principio di impedenza della cella-substrato analisi per quantificare cellule endoteliali de-adesione da fibronectina in risposta ad ossidazione fibronectina MPO-mediata (Esperimento 2). valori di indice cellulari misurati dal sistema di celle-substrato microarray biosensore impedenza riflettono la capacità della membrana cellulare per limitare correnti ioniche campo indotta sulla superficie dell'elettrodo e sono proporzionali alla zona di cellula-substrato contatto 10. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. tempo reale quantificazione delle cellule endoteliali de-adesione da fibronectina in risposta ad ossidazione fibronectina MPO-mediata (Esperimento 2). Sospensioni di cellule endoteliali (in senza siero Medium 199 contenente 1%BSA) sono state seminate su fibronectina nativo o MPO-cuscinetto (fibronectina rivestite a 5 g / ml, poi incubate in assenza o presenza di 20 nM MPO) in 96 array e microelettrodi (misurazioni di impedenza cellula-substrato) o del 35 millimetri di vetro-bottom piatti di coltura cellulare (analisi imaging cellulare dal vivo). Le cellule sono state poi incubate a 37 ° C per 2 ore per permettere l'adesione delle cellule e la massima diffusione prima equilibrante cellule con HBSS e avviare MPO-mediata ossidazione fibronectina aggiungendo H 2 O 2 (10 mM) (tempo di H 2 O 2 Inoltre fissato a t = 0 min). (A) pieno Tempo portate misurazioni dell'impedenza cellule substrato prima e dopo il trattamento con H 2 O 2 in presenza (+ MPO) e assenza (-MPO) di MPO. (B) misure di impedenza Cell-substrato e (C) Zona cella misure di imaging cellulare dal vivo le analisi, dopo il trattamento di MPO-contenenti cellule con H 2 O 2 in presenza (+ Blebbistatin) e assenza (-blebbistatin) dell'inibitore blebbistatin miosina II (40 micron). Valori di indice cellulare e area cellule sono normalizzati a valori immediatamente prima del momento di H 2 O 2 Inoltre, che sono stati dato un valore di 1. dati di indice cellulare rappresentano la media ± SEM, misurazioni n = 6 replicati da un esperimento rappresentativo. I valori di cella rappresentano la media SEM, n = 10 celle (2 film replicati, 5 celle selezionati in modo casuale per film: vedere film 1 e 2). (Figura 3B, 3C Figura, Movie 1 e Movie 2 vengono riprodotti con il permesso di Rees et al. 9). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Movie 1 . Time lapse DIC microfilm scopia di cellule endoteliali aderito su fibronectina MPO-over cuscinetto 0 - 15 min dopo l'esposizione a H 2 O 2 (10 mM); 1 sec = 3 min.
Film 2 . Tempo film lapse DIC microscopia di cellule endoteliali aderito su fibronectina MPO-over cuscinetto 0 - 15 min dopo l'esposizione a H 2 O 2 (10 mM) in presenza di blebbistatin (40 mM); 1 sec = 3 min.
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Discussion
Adesione cellula-matrice e processi de-adesione possono essere quantificati con precisione in tempo reale ad alta risoluzione temporale con impedenza di cellule-substrato e imaging cellulare dal vivo analisi. Questi approcci in tempo reale forniscono un grande vantaggio rispetto end-point analisi di adesione cellulare, che offrono scarsa risoluzione temporale. Per quantificare con precisione le risposte de-adesione rapide con alta risoluzione temporale, queste analisi possono fornire spunti critici in modalità morfologica risposte a modifiche matrice sono regolamentate e il loro impatto sui processi cellulari segnalazione di adesione-dipendente, misurata in con importanti saggi biochimici paralleli (ad esempio, Western blotting).
In studi recenti, questi approcci sono stati usati per rivelare un nuovo ruolo per l'ossidazione MPO-mediata della matrice sottoendoteliale nell'innescare la de-adesione delle cellule endoteliali e ha mostrato: (i) che il tasso di de-aderenza è criticamente dipendente pre actomiosina esistentecontrattilità (cfr figure 3B e 3C) e (ii) che la perdita di adesione cellula-matrice guidato cambiamenti di importanti vie di segnalazione delle cellule adesione-dipendente tra cui Src-dipendente fosforilazione paxillina e miosina catena leggera II fosforilazione 9 (vedi figura 1). Questi dati hanno importanti implicazioni per la comprensione della funzione endoteliale e l'integrità barriera durante le risposte infiammatorie, dove la matrice extracellulare subendoteliale è implicato come un obiettivo chiave per ossidanti prodotti dai depositi subendoteliali di MPO matrix-bound o altre fonti di ossidanti reattivi 3,5-9, 14.
L'uso di un sistema biosensore impedenza della cella-substrato a base di microarray fornisce una piattaforma per robusti, high throughput misurazioni di adesione cellulare. Ciascun pozzetto delle 96 e cellula-substrato array di microelettrodi impedenza ha il potenziale per analizzare simultaneamente 32 differenti condizioni sperimentali (cioè, 3 pozzi peCondizioni r). Tuttavia, quando si confrontano le piccole variazioni di adesione cellulare, almeno 4 o più pozzetti dovrebbero essere utilizzati per condizione sperimentale. Durante la semina delle cellule e trattamenti con le cellule successivi, si deve prestare attenzione a mantenere tutte le soluzioni a 37 ° C e ridurre al minimo il tempo necessario per il trattamento di cellule al di fuori della 37 ° C ambiente incubatore (questo evita potenziali differenze di temperatura in tutta la matrice microelettrodi che possono influenzare le risposte di adesione ). In particolare, la corrente elettrica all'interfaccia cellula-substrato è sensibile alla forza ionica del surnatante cella 10: di conseguenza, le cellule devono essere lasciato equilibrare dopo l'aggiunta di nuovi buffer / media per ottenere una risposta indice cella prima costante monitoraggio dell'effetto dello stimolo di interesse (vedi 3.10 e Figura 3A). Diminuisce nell'indice cellulare può non solo riflettere una diminuzione della superficie media di contatto cellula-matrice, ma può anche riflettere una diminuzione del numero di cellule attaccate. Discriminaretra queste possibilità, variazioni nel numero di cellule attaccate su array di microelettrodi possono essere quantificati immediatamente dopo misurazioni dell'impedenza cellula-substrato di cristallo colorazione viola questo approccio è stato utilizzato per confermare che MPO-mediata ossidazione fibronectina innesca una rapida diminuzione della superficie media di contatto cellula-matrice, ma non promuove il distacco delle cellule (per i dettagli, vedi 9).
Una limitazione della tecnica impedenza della cella substrato è che fornisce una misura media di modifiche adesione su tutte le cellule presenti sulla superficie microelettrodo e non dà informazioni sulla natura precisa adesione o cambiamenti morfologici a livello delle singole cellule. Per far fronte a questa limitazione, cellule vive DIC microscopia e analisi di immagine fornisce una misura complementare di cambiamenti di adesione e rivela cambiamenti morfologici delle singole cellule. Così, diminuisce nell'indice cellulare in risposta a MPO mediata mea fibronectina ossidazionesured da impedenza cell-substrato (figura 3A) correlano bene con le diminuzioni l'area proiettata di cellule misurati dal vivo analisi di immagine cella di film DIC (Figura 3B). È importante sottolineare, film DIC rivelano che, in cellule singole, MPO-indotta de-aderenza comporta il rapido svincolo della membrana cellulare periferico dal substrato e celle adiacenti e in definitiva si traduce in cellule assumendo un compatto 'arrotondato-up' morfologia, ma senza risultante nel distacco delle cellule (Video 1). Come con misure di impedenza cellula-substrato, per garantire risposte cellulari riproducibili, si deve prestare attenzione a mantenere le soluzioni a 37 ° C prima di utilizzare su cellule e una fase di microscopio riscaldata (o dispositivo di controllo della temperatura equivalente) devono essere utilizzati durante l'imaging cellulare dal vivo registrazioni.
I protocolli qui descritti possono essere modificati facilmente sostituendo fibronectina con altri substrati matrice purificato (
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Disclosures
Gli autori non hanno informativa da fare.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 well gold cell-substrate impedance microelectrode array | ACEA Biosciences / Roche | E-Plate 96 | single-use plate used for performing cell-based assays on the xCELLigence system |
| blebbistatin | Sigma | B0560 | selective inhibitor of non-muscle myosin-II |
| Bovine Aortic Endothelial Cells, cryopreserved | Lonza | BW-6001 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | 05470 | |
| EGM-2 BulletKit | Lonza | CC-3162 | endothelial cell growth media kit |
| Fibronectin, lyophilized powder | Sigma | F-4759 | from bovine plasma |
| Fluorodish 35 mm glass-bottomed cell culture dish | World Precision Instruments | FD35-100 | Cell cuture dish with optical quality glass bottom for imaging |
| Gelatin from bovine skin | Sigma | G9391 | cell culture substratum |
| Hank's Balanced Salt Solution | Life Technologies | 14025076 | |
| Hydrogen peroxide | Merck | 107298 | |
| Medium-199 | Life Technologies | 11150-059 | serum-free cell media |
| Methionine | Sigma | M9500 | quenches chlorinating oxidants generated by myeloperoxidase |
| Myeloperoxidase, Human Polymorphonuclear Leukocytes | Millipore | 475911 | |
| RTCA MP Instrument / xCELLigence cell substrate impedance system | ACEA Biosciences / Roche | Consists of RTCA Analyzer, RTCA (Multiple Plate) MP Station and RTCA Control Unit | |
| Trypsin-EDTA (0.5%) | Gibco | 15400-054 |
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