Brug af Cell-substrat Impedans og levende celler Imaging at måle realtid Ændringer i cellulær adhæsion og De-vedhæftning induceret af Matrix Ændring
Summary
Her præsenterer vi en protokol til løbende kvantificere celleadhæsion og de-adhæsionsprocesser med høj tidsmæssig opløsning på en ikke-invasiv måde ved celle-substrat impedans og live cell imaging analyser. Disse metoder afslører dynamikken af celleadhæsion / de-adhæsionsprocesser udløst af matrix modifikation og deres tidsmæssige forhold til adhæsionsafhængige signal- begivenheder.
Abstract
Cell-matrix adhæsion spiller en vigtig rolle i kontrollen cellemorfologi og signalering. Stimuli, der forstyrrer celle-matrix adhæsion (f.eks myeloperoxidase og andre matrix-modificerende oxidanter / enzymer frigives under inflammation) er impliceret i at udløse patologiske ændringer i cellulær funktion, fænotype og levedygtigheden i en række sygdomme. Her beskriver vi, hvordan celle-substrat impedans og levende celle billedteknik kan let anvendes til nøjagtigt at kvantificere realtid ændringer i celleadhæsion og de-vedhæftning induceret af matrix modifikation (ved hjælp af endotelceller og myeloperoxidase som et patofysiologisk matrix-modificerende stimulus) med høj tidsmæssig opløsning og i en ikke-invasiv måde. Den xCELLigence celle-substrat impedans systemet kontinuerligt kvantificerer området celle-matrix adhæsion ved at måle den elektriske impedans ved celle-substrat-grænsefladen i celler dyrket på guld mikroelektrode arrays. Billedanalyse af time-lapse differenoplys- kontrast interferens film kvantificerer ændringer i det projicerede område af individuelle celler over tid, der repræsenterer ændringer i området cellematrixkonstruktion kontakt. Begge teknikker præcist tal på hurtige ændringer i cellulær adhæsion og de-adhæsionsprocesser. Cell-substrat impedans på mikroelektrode biosensor arrays giver en platform for robust, high-throughput målinger. Live-cell imaging analyser give yderligere detaljer vedrørende arten af og dynamikken i de morfologiske ændringer kvantificeret ved celle-substrat impedansmålinger. Disse komplementære metoder giver værdifuld ny indsigt i, hvordan myeloperoxidase-katalyseret oxidativ modifikation af subcellulære ekstracellulære matrixkomponenter udløser hurtige ændringer i celleadhæsion, morfologi og signalering i endotelceller. Disse metoder kan også anvendes til at studere cellulær adhæsion dynamik som svar på andre matrix-modificerende stimuli og i relaterede adhærerende celler (f.eks epitelceller).
Introduction
Stabile klæbende kontakt mellem celler og deres omgivende ekstracellulære matrix er nødvendige for vedligeholdelse af væv homeostase. For eksempel endotelcelleadhæsion til subendoteliale matrix i blodkar spiller en kritisk rolle i at opretholde integriteten af endothellaget og homeostatiske funktion som regulerende, semipermeabel vaskulære barriere 1. Aktincytoskelettet er mekanisk koblet til klæbende matrix-molekyler på steder med celle-matrix adhæsion og klæbende kontakter på celle-matrix-grænsefladen spille en vigtig rolle i bestemmelse af positionen af cellemembranen ved at modstå centralt rettede actomyosin trækkræfter. Ekstracellulære stimuli, der ændrer celle-matrix adhæsion nødvendigvis ændre magtbalancen på celle-matrix interface, en begivenhed, der er hurtigt "fornemmede 'ved mekanisk-sensitive signalproteiner, hvilket resulterer i transduktion af" outside-in signaler ". Denne krydstale between celler og deres omgivende ekstracellulære matrix spiller en central rolle i at kontrollere celle form, motilitet, funktion, spredning og overlevelse 2.
Diverse patofysiologiske processer (fosterudvikling, inflammation, sårheling og cancer metastase) er karakteriseret ved dynamiske omformning af klæbende matrix substrater ved matrix-nedbrydende oxidanter og / eller enzymer 3,4. For eksempel, klæbende subendotele matrixproteiner i blodkar (f.eks fibronectin) er impliceret som vigtige mål for modifikation eller nedbrydning i humane inflammatoriske sygdomme som følge af lokaliseret produktion af reaktive oxidanter (f.eks hypochlorsyrling, HOCl) af leukocytafledte enzym myeloperoxidase (MPO), der akkumuleres i subendotel under inflammatoriske vaskulær sygdom (figur 1) 5-9. Ændringer i celle-matrix adhæsion induceret af MPO-afledte oxidanter og andre matrix-modificerende stimuli er likely at spille vigtige roller i ændring vaskulær homeostase i en række patologiske processer, fx ved at ændre endotelcelle signalering, morfologi og levedygtighed, som igen forstyrrer endotelfunktion og barriere integritet. Imidlertid er de morfologiske og cellesignalering reaktioner adhærente celler til ekstracellulære matrix ændringer kun begynder at blive forstået.
For at forstå, hvordan matrix modifikationer drev ændringer i celleadhæsion dynamik og adhæsionsafhængige celle signalveje, er teknikker, der kræves der nøjagtigt kvantificere ændringer i celle-matrix adhæsion i realtid med høj tidsmæssig opløsning. Her beskriver vi komplementær celle-substrat impedans og levende celle billeddannende teknikker, som opfylder disse kriterier, og tilvejebringer en platform til at kvantificere celleadhæsion og de-adhæsionsprocesser i en ikke-invasiv måde.
Vi viser, hvordan disse celle-substrat impedans og live cell imaging hensigtsømhed kan let anvendes til (i) overvåge dynamikken i cellebinding og spredning (dvs. de novo celleadhæsion) på native og modificerede matrixsubstrater og (ii) til at måle dynamikken i celle-matrix løsrivelse (dvs. de-adhæsion ) af adhærente celler udsat for matrix-modificerende stimuli. Den xCELLigence celle-substrat impedans biosensor system giver en kontinuerlig måling af området med celle-matrix kontakt ved at kvantificere elektriske impedans på overfladen af 96 brønde guld mikroelektrode arrays og udtrykker disse elektriske impedansmålinger som »cell indeks, en dimensionsløs størrelse, som er stort set proportional med arealet af celle-substrat kontakt 10 (figur 2), samtidig med at være følsomme over for ændringer i den gennemsnitlige afstand mellem (isolerende) cellemembranen og elektroden overflade 11. En yderligere stigning i celle indeksværdier opnås også ved dannelse af en stram celle-celle-kontakter that begrænse paracellulære aktuelle strømme 11 betingelser, der ikke er fremherskende inden for de eksperimenter, der er beskrevet i denne undersøgelse. Måling af det projicerede areal af de enkelte celler over tid ved billedanalyse af time-lapse kontrast differential interferens (DIC) film giver en supplerende foranstaltning til ændringer inden for celle-substrat kontakt og giver yderligere oplysninger om den præcise karakter og dynamik i morfologiske ændringer kvantificeres ved celle-substrat impedans fremgangsmåde.
Specifikt beskriver vi anvendelsen af disse metoder til at overvåge, hvordan MPO-medieret oxidation af klæbende subendotel matrixproteiner (f.eks fibronectin) (I) reducerer de novo adhæsion af suspenderede endotelceller på oprenset fibronectin og (ii) udløser cellematrixkonstruktion de -adhesion i endotelceller med etableret vedhæftning på fibronectin. Ved at udføre parallel cellesignalering analyser over tid ved hjælp af relevant BiochemiCal assays (f.eks, Western blotting), de tidsmæssige og årsagssammenhængen mellem vedhæftning / de-adhæsionsprocesser og tilhørende ændringer i adhæsionsafhængige celle signalering begivenheder kan bestemmes.
Disse metoder blev for nylig anvendt til at vise, at ekstracellulær matrix oxidation katalyseres af subendotele aflejringer af MPO udløser en hurtig tab af celle-matrix adhæsion af endothelceller, som er drevet af allerede eksisterende actomyosin kontraktile kræfter 9. Vigtigt er det, ved at give den tidsmæssige sammenhæng mellem ændringer i både celleadhæsion og adhæsionsafhængige celle signalering, der skal fastlægges, disse tilgange identificeret at MPO-induceret matrixmodifikationen og cellulær de-adhæsion udløser ændringer i vigtige adhæsionsafhængige celle signalveje herunder Src kinase -afhængig paxillin phosphorylering og myosin let kæde II phosphorylering (figur 1) 9. Denne tilstand af redox-afhængig signalering, invOlving aktivering af intracellulære signaleringsbegivenheder af ekstracellulær oxidative reaktioner, som forstyrrer celle-matrix adhæsion, repræsenterer en ny tilstand af cellesignalering betegnet "outside-in redox signalering" (figur 1) 9.
Generelt bør disse supplerende celle-substrat impedans biosensor og levende celle billedteknik være værdifulde i at afsløre, hvordan forskellige matrix-modificerende stimuli eller agenter drive forandringer i celle adhæsion dynamik, morfologi og signaler inden for forskellige vedhængende celletyper underlagt en lang række eksperimentelle indstillinger.
Følgende protokol beskriver, hvordan at kvantificere effekten af MPO-medieret matrix oxidering på de novo endotelcelleadhæsion (forsøg 1) og endotelcelle de-vedhæftning (forsøg 2) processer. MPO binder ivrigt til fibronectin og andre adhæsive subendotele ekstracellulære matrixproteiner og oses hydrogenperoxid (H 2 O 2) til at konvertere chloridioner (Cl -) til det meget reaktive chloreringsmiddel oxidant chlorundersyrling (HOCI), der reagerer lokalt med disse matrixproteiner og forstyrrer deres celle klæbeegenskaber (figur 1) 8,9, 12.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cellematrixkonstruktion vedhæftning og de-adhæsionsprocesser kan kvantificeres præcist i realtid med høj tidsmæssig opløsning ved hjælp af celle-substrat impedans og live cell imaging analyser. Disse realtid tilgange giver en stor fordel i forhold til end-point analyser af celleadhæsion, som giver dårlig tidsmæssig opløsning. Ved præcist at kvantificere hurtige de-vedhæftning reaktioner med høj tidsmæssig opløsning, kan disse analyser giver kritiske indsigt i, hvordan morfologiske reaktioner på matrix ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by a National Health and Medical Research Council (NHMRC) Project Grant 568721 (SRT) and, in part, by a UNSW Faculty of Medicine Faculty Research Grant (MDR).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 96 well gold cell-substrate impedance microelectrode array | ACEA Biosciences / Roche | E-Plate 96 | single-use plate used for performing cell-based assays on the xCELLigence system |
| blebbistatin | Sigma | B0560 | selective inhibitor of non-muscle myosin-II |
| Bovine Aortic Endothelial Cells, cryopreserved | Lonza | BW-6001 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | 05470 | |
| EGM-2 BulletKit | Lonza | CC-3162 | endothelial cell growth media kit |
| Fibronectin, lyophilized powder | Sigma | F-4759 | from bovine plasma |
| Fluorodish 35 mm glass-bottomed cell culture dish | World Precision Instruments | FD35-100 | Cell cuture dish with optical quality glass bottom for imaging |
| Gelatin from bovine skin | Sigma | G9391 | cell culture substratum |
| Hank's Balanced Salt Solution | Life Technologies | 14025076 | |
| Hydrogen peroxide | Merck | 107298 | |
| Medium-199 | Life Technologies | 11150-059 | serum-free cell media |
| Methionine | Sigma | M9500 | quenches chlorinating oxidants generated by myeloperoxidase |
| Myeloperoxidase, Human Polymorphonuclear Leukocytes | Millipore | 475911 | |
| RTCA MP Instrument / xCELLigence cell substrate impedance system | ACEA Biosciences / Roche | – | Consists of RTCA Analyzer, RTCA (Multiple Plate) MP Station and RTCA Control Unit |
| Trypsin-EDTA (0.5%) | Gibco | 15400-054 |
References
- Wu, M. H. Endothelial focal adhesions and barrier function. J Physiol. 569, 359-366 (2005).
- Geiger, B., Yamada, K. M. Molecular architecture and function of matrix adhesions. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3, (2011).
- Rees, M. D., Kennett, E. C., Whitelock, J. M., Davies, M. J. Oxidative damage to extracellular matrix and its role in human pathologies. Free Radic Biol Med. 44, 1973-2001 (2008).
- Cox, T. R., Erler, J. T. Remodeling and homeostasis of the extracellular matrix: implications for fibrotic diseases and cancer. Dis Model Mech. 4, 165-178 (2011).
- Baldus, S., et al. Endothelial transcytosis of myeloperoxidase confers specificity to vascular ECM proteins as targets of tyrosine nitration. J Clin Invest. 108, 1759-1770 (2001).
- Baldus, S., et al. Spatial mapping of pulmonary and vascular nitrotyrosine reveals the pivotal role of myeloperoxidase as a catalyst for tyrosine nitration in inflammatory diseases. Free Radic Biol Med. 33, 1010-1019 (2002).
- Thomas, S. R., Witting, P. K., Drummond, G. R. Redox control of endothelial function and dysfunction: molecular mechanisms and therapeutic opportunities. Antioxid Redox Signal. 10, 1713-1765 (2008).
- Rees, M. D., et al. Myeloperoxidase-derived oxidants selectively disrupt the protein core of the heparan sulfate proteoglycan perlecan. Matrix Biol. 29, 63-73 (2010).
- Rees, M. D., et al. Targeted subendothelial matrix oxidation by myeloperoxidase triggers myosin II-dependent de-adhesion and alters signaling in endothelial cells. Free Radic Biol Med. 53, 2344-2356 (2012).
- Solly, K., Wang, X., Xu, X., Strulovici, B., Zheng, W. Application of real-time cell electronic sensing (RT-CES) technology to cell-based assays. Assay Drug Dev Technol. 2, 363-372 (2004).
- Giaever, I., Keese, C. R. Micromotion of mammalian cells measured electrically. Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 7896-7900 (1991).
- Vissers, M. C., Thomas, C. Hypochlorous acid disrupts the adhesive properties of subendothelial matrix. Free Radic Biol Med. 23, 401-411 (1997).
- Ziv, N. E., Schiller, J. Differential Interference Contrast (DIC) Imaging of Living Cells. CSH Protoc. 2007, (2007).
- Kennett, E. C., et al. Peroxynitrite modifies the structure and function of the extracellular matrix proteoglycan perlecan by reaction with both the protein core and the heparan sulfate chains. Free Radic Biol Med. 49, 282-293 (2010).
- Sen, S., Ng, W. P., Kumar, S. Contractility dominates adhesive ligand density in regulating cellular de-adhesion and retraction kinetics. Ann Biomed Eng. 39, 1163-1173 (2011).
- Wildt, B., Wirtz, D., Searson, P. C. Programmed subcellular release for studying the dynamics of cell detachment. Nat Methods. 6, 211-213 (2009).
