매트릭스 수정에 의해 유도 된 세포 접착 및 탈 부착의 실시간 변화를 측정 셀 기판 임피던스와 라이브 세포 이미징을 사용하여
Summary
여기서, 우리는 지속적으로 셀 기판 임피던스와 생균 영상 분석에 의해 비 침습성 방식으로 높은 시간 해상도를 가진 세포 부착 및 디 – 접착 공정을 정량화하는 프로토콜을 제시한다. 이러한 접근은 매트릭스 수정 및 접착 의존성 시그널링 이벤트들이 시간적인 관계에 의해 트리거 세포 접착 / 디 접착 공정의 역학을 보여준다.
Abstract
셀 매트릭스 접착 세포 형태를 제어 및 시그널링에 중요한 역할을한다. 세포 접착 매트릭스 (예, 마이 엘 로퍼 옥시 다제 및 다른 매트릭스 – 수정 산화제 / 염증 동안 방출 효소)를 방해 자극 질환의 수가 세포 기능, 표현형과 생존의 병리학 적 변화를 유발에 관여된다. 여기서는 (병리 생리 매트릭스 수정 자극으로 내피 세포 및 마이 엘 로퍼 옥시 다제를 사용하여) 셀 기판 임피던스와 생균 촬상 접근 용이 정확하게 세포 부착 및 매트릭스 변형에 의해 유도 된 디 밀착성 실시간 변화를 정량화하기 위해 이용 될 수있는 방법을 설명하는 높은 시간 해상도와 비 침습적 방법. xCELLigence 셀 기판 임피던스 시스템은 연속적으로 금 미세 전극 배열상에서 성장한 세포에서 세포 – 기판 계면에서 임피던스를 측정함으로써 세포 매트릭스의 접착 면적을 정량화한다. 의 이미지 분석 시간 경과 differen간섭은 최초 콘트라스트 영화 셀 매트릭스의 접촉 면적의 변화를 나타내는, 시간이 지남에 따라 각 셀의 투영 면적의 변화를 정량화한다. 두 기술은 정확하게 세포 접착 및 탈 부착 프로세스에 급격한 변화를 정량화. 미세 바이오 센서 어레이에 관한 셀 기판 임피던스는 견고한 높은 처리량 측정 용 플랫폼을 제공한다. 라이브 세포 이미징은 세포 기질 임피던스 측정에 의해 정량 형태 학적 변화의 특성과 역학에 대한 추가 세부 사항을 제공 분석한다. 이러한 접근법은 상보 세포 내 세포 외 기질 성분의 myeloperoxidase가 촉매 작용 산화가 빠르게 변형 세포 부착, 형태 변화 및 내피 세포에서 트리거 시그널링 방법에 유용한 새로운 통찰력을 제공한다. 이러한 접근은 다른 매트릭스 수정 자극 및 관련 자기편 세포 (예를 들면, 상피 세포)에 대한 응답으로 세포 접착 역학 연구를위한 적용 할 수 있습니다.
Introduction
세포와 그 주변의 세포 외 기질 간의 안정적인 접착 접촉은 조직의 항상성의 유지 보수를 위해 필요합니다. 예를 들어, 혈관 내 피하 매트릭스 내피 세포 유착은 내피 층의 무결성 및 규제 반투과성 한 혈관 장벽으로서의 기능 항상성을 유지하는데 중요한 역할을한다. 액틴 세포 골격 기계적 중앙 관한 액토 마이 오신의 인장력에 저항하여 세포막의 위치를 결정하는데 중요한 역할을하는 세포 – 매트릭스 계면에서 세포 – 매트릭스 부착 및 접착제 접점 부위에서 매트릭스 분자 접착에 결합된다. 반드시 세포 – 매트릭스 계면에서의 힘의 균형이 급속히 인 사건 변경 셀 매트릭스 밀착성을 변경 세포 외 자극은 "외기 시그널링"의 전달의 결과로, 메카 성 신호 전달 단백질에 의해 "감지". 이 크로스 토크 내기싸우는 세포 및 주변 세포 외 기질은 세포의 모양, 운동성, 함수, 증식 및 생존을 조절이 중요한 역할을한다.
다양한 병태 생리적 과정 (배아 발달, 염증, 상처 복구 및 암전)은 매트릭스 – 산화제 분해 및 / 또는 효소에 의해 3,4- 접착제 매트릭스 기판의 동적 리모델링을 특징으로한다. 예를 들어, 혈관 내 피하 기질 단백질을 접착 (예를 들어, 피브로넥틴은) 때문에 반응 산화제의 국산화에 인간의 염증성 질환에서 수정 또는 변형 주요 대상으로 연루되어있다 (예를 들면, 차아 염소산,의 HOCl) 백혈구 유래 효소에 의해 염증성 혈관 질환 (그림 1) 5-9시 내피 밑층 내에 축적 폐장 내 myeloperoxidase (MPO). MPO 파생 산화제 및 기타 매트릭스 수정 자극에 의해 유도 된 세포 – 매트릭스 접착의 변화는 사장님이다다시 내피 기능과 장벽의 무결성을 교란 내피 세포 신호, 형태와 가능성을 변경하여, 예를 들어, 엘리는 병적 다양한 공정 중에 혈관 항상성 변화에 중요한 역할을합니다. 그러나, 세포 외 기질 수정에 부착 세포의 형태 학적 및 세포 신호 반응은 이해하기 시작했다.
매트릭스 수정 세포 접착 역학 및 접착 의존성 세포 신호 전달 경로의 변화를 운전하는 방법을 이해하기 위해, 기술은 정확하게 높은 시간 해상도로 실시간으로 세포 – 매트릭스 접착의 변화를 정량화하는 것이 필요합니다. 여기서는 상보 셀 기판 임피던스 이러한 기준을 충족하고, 비 침습적 방법으로 세포 부착 및 디 – 접착 공정을 정량화하는 플랫폼을 제공 생균 이미징 기술을 설명한다.
우리는 표시 방법이 셀 기판 임피던스와 라이브 세포 이미징 APPRO통증 용이 세포 부착의 역학을 모니터링하고 네이티브 및 변성 매트릭스 기판 상에 (즉, 새로이 세포 부착) 확산 및 (ii) (즉, 디 – 부착 세포 – 매트릭스 박리 동성을 측정하기 위해 (ⅰ)에 이용 될 수있다 ) 매트릭스 수정 자극에 노출 부착 세포에 의해. xCELLigence 셀 기판 임피던스 바이오 센서 시스템은 96 웰 금 미세 전극 어레이의 표면에 임피던스를 정량함으로써 셀 매트릭스의 접촉 면적의 연속 측정을 제공하고, '셀 인덱스'무 차원 값으로서 이러한 임피던스 측정을 나타낸다고 또한 (절연막) 세포막과 전극면 (11) 사이의 평균 거리의 변화에 민감한 반면, 셀 기판 컨택트 (10) (도 2)의 면적에 거의 비례한다. 셀 인덱스 값에서 추가의 증가는 세포 간 긴밀한 접점 그쪽 형성시 달성t는,이 연구에서 설명하는 실험 내에서 우선하지 않습니다 (11)의 조건을 세포층의 전류 흐름을 제한합니다. 경과 미분 간섭 콘트라스트의 이미지 분석에 의한 시간이 지남에 각 셀의 투영 면적의 측정은 (DIC) 영화 셀 기판의 접촉 면적의 변화의 상보 척도를 제공하고 사람의 정확한 성격과 역학에 관한 추가 정보를 제공한다 세포 기질 임피던스 방식에 의해 정량화 형태 학적 변화.
구체적으로, 우리는 (예를 들면, 피브로넥틴) (ⅰ) 접착 피하 기질 단백질의 산화를 MPO 매개 어떻게 모니터링 정제 피브로넥틴 및 (ⅱ) 트리거 셀 매트릭스 드에 현탁 내피 세포의 드 노보 밀착성을 감소하기 위해 이러한 접근법의 적용을 설명 피브로넥틴에 설립 접착 내피 세포에 -adhesion. 병렬 세포 신호를 수행하는 관련 BIOCHEM를 사용하여 시간이 지남에 따라 분석하여분석적인 (예를 들어, 웨스턴 블랏), 접착 의존성 세포 시그널링 이벤트에 접착 / 디 접착 공정과 관련된 변화와의 시간적 인과 관계가 결정될 수있다.
이러한 접근 방식은 최근의 MPO 피하 침착에 의해 촉매 산화 외 매트릭스는 기존 액토 마이 오신의 수축력 (9)에 의해 구동되는 내피 세포의 세포 – 매트릭스 밀착성 급속한 손실을 유발 함을 입증하기 위해 사용되었다. 중요한 것은, 두 세포 접착의 변화 및 결정되는 신호 접착 의존성 세포 사이의 시간적 관계를 가능하게하여, 이러한 방법은 MPO에 의한 매트릭스 수정 및 휴대 탈 부착 값이 SRC 키나아제를 포함한 중요한 접착 의존성 세포 신호 전달 경로의 변화를 트리거 발견 의존성 paxillin 인산화 및 미오신 경쇄 II의 인산화 (그림 1) 9. 산화 환원에 의존 신호, INV의 모드세포 – 매트릭스 접착을 방해 외 산화 반응에 의해 세포 내 신호 이벤트의 활성화를 olving, 셀의 신규 모드 "아웃 사이드 레 독스 신호"(도 1)이라 나타낸다 시그널링 구.
일반적으로, 이러한 상보 셀 기판 임피던스 바이오 센서 및 생균 촬상 방식은 매트릭스 – 수정 자극 또는 대리인이 세포 접착 역학, 형태의 변화를 구동 방법 상이한 드러내는 다양한 적용 상이한 부착 세포 유형 내에서 시그널링 귀중한되어야 실험 설정.
다음 프로토콜은 드 노보 내피 세포 부착 (실험 1) 및 내피 세포의 탈 부착 (실험 2) 프로세스에 MPO 매개 매트릭스 산화의 영향을 정량화하는 방법을 설명합니다. MPO는 피브로넥틴 및 기타 접착제 피하 세포 외 기질 단백질과 우리에게 탐욕스럽게 결합ES (H 2 O 2) 염화물 이온 (CL을 -) 변환 과산화수소 이들 기질 단백질로 국소 반응 및 세포 접착 특성 (도 1) 8,9 방해 반응성 염소 산화제 차아 산 (의 HOCl)에, (12).
Protocol
Representative Results
Discussion
세포 부착 및 매트릭스 탈 접착 공정은 셀 기판 임피던스와 생균 분석 이미징을 사용하여 높은 시간 해상도와 실시간으로 정확하게 정량 할 수있다. 종점이 불량 시간 해상도를 제공 세포 부착, 이러한 분석을 통해 실시간 방식은 중요한 이점을 제공한다. 정확하게 높은 시간 해상도와 빠른 탈 부착 반응을 정량화하여, 이러한 분석은에 중요한 통찰력을 제공 할 수있는 방법 형태 응답 행렬 수정?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by a National Health and Medical Research Council (NHMRC) Project Grant 568721 (SRT) and, in part, by a UNSW Faculty of Medicine Faculty Research Grant (MDR).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 96 well gold cell-substrate impedance microelectrode array | ACEA Biosciences / Roche | E-Plate 96 | single-use plate used for performing cell-based assays on the xCELLigence system |
| blebbistatin | Sigma | B0560 | selective inhibitor of non-muscle myosin-II |
| Bovine Aortic Endothelial Cells, cryopreserved | Lonza | BW-6001 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | 05470 | |
| EGM-2 BulletKit | Lonza | CC-3162 | endothelial cell growth media kit |
| Fibronectin, lyophilized powder | Sigma | F-4759 | from bovine plasma |
| Fluorodish 35 mm glass-bottomed cell culture dish | World Precision Instruments | FD35-100 | Cell cuture dish with optical quality glass bottom for imaging |
| Gelatin from bovine skin | Sigma | G9391 | cell culture substratum |
| Hank's Balanced Salt Solution | Life Technologies | 14025076 | |
| Hydrogen peroxide | Merck | 107298 | |
| Medium-199 | Life Technologies | 11150-059 | serum-free cell media |
| Methionine | Sigma | M9500 | quenches chlorinating oxidants generated by myeloperoxidase |
| Myeloperoxidase, Human Polymorphonuclear Leukocytes | Millipore | 475911 | |
| RTCA MP Instrument / xCELLigence cell substrate impedance system | ACEA Biosciences / Roche | – | Consists of RTCA Analyzer, RTCA (Multiple Plate) MP Station and RTCA Control Unit |
| Trypsin-EDTA (0.5%) | Gibco | 15400-054 |
References
- Wu, M. H. Endothelial focal adhesions and barrier function. J Physiol. 569, 359-366 (2005).
- Geiger, B., Yamada, K. M. Molecular architecture and function of matrix adhesions. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3, (2011).
- Rees, M. D., Kennett, E. C., Whitelock, J. M., Davies, M. J. Oxidative damage to extracellular matrix and its role in human pathologies. Free Radic Biol Med. 44, 1973-2001 (2008).
- Cox, T. R., Erler, J. T. Remodeling and homeostasis of the extracellular matrix: implications for fibrotic diseases and cancer. Dis Model Mech. 4, 165-178 (2011).
- Baldus, S., et al. Endothelial transcytosis of myeloperoxidase confers specificity to vascular ECM proteins as targets of tyrosine nitration. J Clin Invest. 108, 1759-1770 (2001).
- Baldus, S., et al. Spatial mapping of pulmonary and vascular nitrotyrosine reveals the pivotal role of myeloperoxidase as a catalyst for tyrosine nitration in inflammatory diseases. Free Radic Biol Med. 33, 1010-1019 (2002).
- Thomas, S. R., Witting, P. K., Drummond, G. R. Redox control of endothelial function and dysfunction: molecular mechanisms and therapeutic opportunities. Antioxid Redox Signal. 10, 1713-1765 (2008).
- Rees, M. D., et al. Myeloperoxidase-derived oxidants selectively disrupt the protein core of the heparan sulfate proteoglycan perlecan. Matrix Biol. 29, 63-73 (2010).
- Rees, M. D., et al. Targeted subendothelial matrix oxidation by myeloperoxidase triggers myosin II-dependent de-adhesion and alters signaling in endothelial cells. Free Radic Biol Med. 53, 2344-2356 (2012).
- Solly, K., Wang, X., Xu, X., Strulovici, B., Zheng, W. Application of real-time cell electronic sensing (RT-CES) technology to cell-based assays. Assay Drug Dev Technol. 2, 363-372 (2004).
- Giaever, I., Keese, C. R. Micromotion of mammalian cells measured electrically. Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 7896-7900 (1991).
- Vissers, M. C., Thomas, C. Hypochlorous acid disrupts the adhesive properties of subendothelial matrix. Free Radic Biol Med. 23, 401-411 (1997).
- Ziv, N. E., Schiller, J. Differential Interference Contrast (DIC) Imaging of Living Cells. CSH Protoc. 2007, (2007).
- Kennett, E. C., et al. Peroxynitrite modifies the structure and function of the extracellular matrix proteoglycan perlecan by reaction with both the protein core and the heparan sulfate chains. Free Radic Biol Med. 49, 282-293 (2010).
- Sen, S., Ng, W. P., Kumar, S. Contractility dominates adhesive ligand density in regulating cellular de-adhesion and retraction kinetics. Ann Biomed Eng. 39, 1163-1173 (2011).
- Wildt, B., Wirtz, D., Searson, P. C. Programmed subcellular release for studying the dynamics of cell detachment. Nat Methods. 6, 211-213 (2009).
