Summary
هنا، نقدم بروتوكول لتحديد باستمرار عمليات التصاق الخلايا وإزالة الالتصاق مع القرار الزماني عالية بطريقة غير الغازية التي كتبها مقاومة الخلايا الركيزة والتصوير الخلية الحية تحلل. هذه المقاربات تكشف ديناميات العمليات التصاق الخلية / دي التصاق الناجمة عن تعديل مصفوفة وعلاقتها الزمنية للأحداث الإشارات التي تعتمد على الالتصاق.
Abstract
خلية مصفوفة التصاق يلعب دورا رئيسيا في السيطرة على مورفولوجيا الخلايا والإشارة. وتورط المحفزات التي تعطل التصاق خلايا المصفوفة (على سبيل المثال، الميلوبيروكسيداز وغيرها من تأكسد-تعديل مصفوفة / الإنزيمات صدر خلال الالتهاب) في إحداث تغيرات مرضية في وظيفة الخلوي، والنمط الظاهري وقدرتها على البقاء في عدد من الأمراض. هنا، نحن تصف كيفية مقاومة خلايا الركيزة والنهج التصوير الخلية الحية يمكن استخدامه بسهولة للقياس بدقة التغييرات في الوقت الحقيقي في التصاق الخلايا وإزالة التصاق الناجمة عن تعديل المصفوفة (باستخدام الخلايا البطانية والميلوبيروكسيداز باعتباره المرضية في جسم المريض، تعديل مصفوفة الحوافز) مع القرار الزماني عالية وبطريقة غير الغازية. الخلية الركيزة نظام مقاومة xCELLigence الكمي بشكل مستمر مجال خلية مصفوفة التصاق عن طريق قياس مقاومة الكهربائية في واجهة خلية الركيزة في الخلايا المزروعة في صفائف مسرى مكروي الذهب. تحليل الصور من الوقت الفاصل بين مختلفاللمحاكمة الأفلام التدخل النقيض الكمي التغييرات في المنطقة المعروضة من الخلايا الفردية على مر الزمن، تمثل التغيرات في مجال خلايا مصفوفة للإتصال به. كلا تقنيات قياس بدقة التغيرات السريعة لعمليات التصاق الخلايا وإزالة الالتصاق. مقاومة الخلايا الركيزة على صفائف مسرى مكروي جهاز الاستشعار البيولوجي توفر منبرا للقياسات قوية، عالية الإنتاجية. يحلل تصوير الخلايا الحية تقديم تفاصيل إضافية بشأن طبيعة وديناميات التغيرات المورفولوجية كميا بواسطة القياسات مقاومة الخلايا الركيزة. وتوفر هذه المناهج التكميلية رؤى جديدة قيمة حول كيفية المحفز الميلوبيروكسيداز تعديل الأكسدة من التحت خلوية مكونات المصفوفة خارج الخلية يؤدي التغيرات السريعة في التصاق الخلية، مورفولوجيا ويشير في الخلايا البطانية. هذه الأساليب قابلة للتطبيق لدراسة ديناميات التصاق الخلوية ردا على غيرها من المحفزات-تعديل مصفوفة وخلايا ملتصقة ذات الصلة (مثل الخلايا الظهارية) أيضا.
Introduction
ويلزم الاتصالات لاصقة مستقرة بين الخلايا والمحيطة مصفوفة من خارج الخلية لصيانة توازن الأنسجة. على سبيل المثال، التصاق الخلايا البطانية لمصفوفة تحت البطانة في الأوعية الدموية تلعب دورا حاسما في الحفاظ على سلامة طبقة بطانة الأوعية الدموية وظيفة التماثل الساكن بوصفها التنظيمي، شبه منفذ الأوعية الدموية حاجز 1. ويقترن الهيكل الخلوي الأكتين ميكانيكيا لاصقة جزيئات المصفوفة في مواقع التصاق خلايا المصفوفة والاتصالات لاصقة في واجهة خلية مصفوفة تلعب دورا هاما في تحديد موقف من غشاء الخلية عن طريق مقاومة الموجهة مركزيا القوات الشد أكتوميوزين. المحفزات خارج الخلية التي تغير خلية مصفوفة التصاق يغير بالضرورة ميزان القوى في واجهة خلية مصفوفة، وهو الحدث الذي غير وجه السرعة "لمست من خلال البروتينات مما يشير الحساسة للوالميكانيكية، مما أدى إلى تنبيغ" خارج في الإشارات ". هذا الرهان عبر الحديثخلايا وين والمحيطة المصفوفة خارج الخلية التي تلعب دورا رئيسيا في التحكم في شكل الخلية، حركية، وظيفة، والانتشار والبقاء على قيد الحياة 2.
وتتميز عمليات patho الفسيولوجية المختلفة (التطور الجنيني، والتهاب، الجروح إصلاح والانبثاث سرطان) من خلال إعادة عرض ديناميكية من ركائز مصفوفة لاصقة من قبل تأكسد مصفوفة المهينة و / أو الإنزيمات 3،4. على سبيل المثال، لاصق البروتينات مصفوفة تحت البطانة في الأوعية الدموية (على سبيل المثال، فبرونيكتين) وتورط كأهداف رئيسية للتعديل أو تدهور في الأمراض الالتهابية الإنسان بسبب إنتاج المترجمة من تأكسد رد الفعل (على سبيل المثال، حمض تحت الكلور، HOCL) بواسطة انزيم المستمدة من الكريات البيض الميلوبيروكسيديز (MPO)، الذي يتراكم داخل تحت البطانة أثناء أمراض الأوعية الدموية التهابات (الشكل 1) 5-9. التغيرات في خلايا مصفوفة التصاق الناجم عن الأكسدة MPO المشتقة وغيرها من المحفزات-تعديل المصفوفة هي شابهاعل للعب أدوارا هامة في تغيير التوازن الأوعية الدموية خلال مجموعة متنوعة من العمليات المرضية؛ على سبيل المثال، عن طريق تغيير إشارات الخلية البطانية، مورفولوجيا وقدرتها على البقاء، وهذا بدوره يشوش ظيفة بطانة الأوعية الدموية وسلامة الحاجز. ومع ذلك، فإن الاستجابات يشير المورفولوجية وخلية من الخلايا الملتصقة على التعديلات المصفوفة خارج الخلية يست سوى بداية ليكون مفهوما.
لفهم كيفية تعديلات مصفوفة بالسيارة التغيرات في ديناميكية التصاق الخلية والخلية مسارات الإشارات التي تعتمد على الالتصاق، يطلب من التقنيات التي قياس بدقة التغيرات في خلايا مصفوفة التصاق في الوقت الحقيقي، مع القرار الزماني عالية. هنا، نحن تصف تكميلية مقاومة الخلايا الركيزة وتقنيات التصوير الخلية الحية التي تلبي هذه المعايير وتوفير منصة لتحديد التصاق الخلايا والعمليات دي التصاق بطريقة غير الغازية.
وتبين لنا كيف أن هذه مقاومة الخلايا الركيزة الحية وAPPRO التصوير الخليةآلام يمكن استخدامها بسهولة إلى (ط) مراقبة ديناميات مرفق الخلية ونشر (أي دي نوفو خلية التصاق) على ركائز مصفوفة الأم وتعديلها و (ثانيا) لقياس ديناميكية خلية مصفوفة مفرزة (أي دي-التصاق ) عن طريق الخلايا الملتصقة يتعرض للمؤثرات-تعديل مصفوفة. ويوفر النظام xCELLigence خلية الركيزة مقاومة جهاز الاستشعار البيولوجي والقياس المستمر من مساحة خلية مصفوفة الاتصال عن طريق قياس مقاومة الكهربائية على سطح 96-جيدا صفائف مسرى مكروي الذهب ويعبر عن هذه القياسات معاوقة باسم 'مؤشر الخلية "، وهي القيمة التي أبعاد غير متناسبة إلى حد كبير في مجال الخلايا الركيزة اتصال 10 (الشكل 2)، في حين يجري أيضا حساسة للتغيرات في متوسط المسافة بين (العازلة) غشاء الخلية وسطح القطب 11. وتحققت زيادة أخرى في قيم مؤشر الخلية أيضا على تشكيل ضيق الاتصالات خلية خلية ثار تقييد التدفقات الحالية paracellular، 11 الظروف التي لا تسود داخل التجارب الموضحة في هذه الدراسة. قياس مجال المتوقعة من الخلايا الفردية على مر الزمن من خلال تحليل الصور من الوقت الفاصل بين تدخل الفرق النقيض (DIC) الأفلام توفر تدبير مكمل للتغيرات في مجال الخلايا الركيزة الاتصال ويوفر معلومات إضافية بشأن طبيعة ودينامية الدقيقة لل التغيرات المورفولوجية كميا من قبل نهج مقاومة الخلايا الركيزة.
على وجه التحديد، وصفنا تطبيق هذه المناهج لمراقبة كيفية أكسدة البروتينات مصفوفة لاصقة تحت البطانة (على سبيل المثال، فبرونيكتين) (ط) MPO بوساطة يقلل من التصاق دي نوفو من الخلايا البطانية علقت على فبرونيكتين تنقيته و (ثانيا) يطلق خلية مصفوفة دي -adhesion في الخلايا البطانية مع التصاق أنشئت في فبرونيكتين. عن طريق أداء الخلايا مما يشير الى موازية يحلل بمرور الوقت باستخدام الكيميائية الحيوية ذات الصلةيمكن تحديد المقايسات كال (على سبيل المثال، النشاف الغربي)، والعلاقات الزمانية والسببية بين العمليات التصاق / دي التصاق والتغيرات المرتبطة بها في الخلية إشارات الأحداث التي تعتمد على الالتصاق.
وقد استخدمت هذه النهج في الآونة الأخيرة لإثبات أن الأكسدة المصفوفة خارج الخلية يحفزه الودائع تحت البطانة من MPO يتسبب في فقدان سريع في خلايا مصفوفة التصاق الخلايا البطانية التي يقودها قوات أكتوميوزين مقلص الموجودة من قبل 9. الأهم من ذلك، من خلال تمكين العلاقة الزمنية بين التغيرات في كل من التصاق الخلية والخلية التصاق التي تعتمد يشير إلى أن تحدد، هذه النهج حددت أن MPO التي يسببها تعديل مصفوفة والخلوية دي التصاق يؤدي تغيرات في الخلايا مسارات إشارات تعتمد على الالتصاق الهامة بما في ذلك SRC كيناز معتمد على الفسفرة paxillin والضوء ميوسين سلسلة II الفسفرة (الشكل 1) 9. هذا النمط من الأكسدة التي تعتمد على الإشارات، الجردolving تفعيل الأحداث الإشارات بين الخلايا من خلال ردود الفعل الأكسدة خارج الخلية التي تعطل خلية مصفوفة التصاق، يمثل وضع رواية من خلية اشارة صفتهم "خارج في الأكسدة الإشارات" (الشكل 1) 9.
بشكل عام، يجب أن تكون هذه مكملة جهاز الاستشعار البيولوجي مقاومة الخلايا الركيزة والنهج التصوير الخلية الحية قيمة في الكشف عن مدى اختلاف المحفزات-تعديل مصفوفة أو وكلاء بالسيارة التغيرات في ديناميكية التصاق الخلية، مورفولوجيا ويشير في مختلف ملتصقة الخلية أنواع تخضع لمجموعة واسعة من إعدادات التجريبية.
يصف بروتوكول التالية كيفية قياس أثر MPO بوساطة الأكسدة مصفوفة على دي نوفو التصاق بطانة الخلية (تجربة 1) والبطانية خلية دي التصاق (تجربة 2) العمليات. MPO يربط بشوق إلى فبرونيكتين وغيرها تحت البطانة البروتينات المصفوفة خارج الخلية لاصقة ولناوفاق بيروكسيد الهيدروجين (H 2 O 2) لتحويل أيونات الكلوريد (الكلور -) إلى شديدة التفاعل الكلورة أكسدة حمض تحت الكلور (HOCL)، الذي يتفاعل محليا مع هذه البروتينات المصفوفة ويعطل ممتلكاتهم لاصقة الخلية (الشكل 1) 8،9، 12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. عامة غشائي خلية ثقافة
- ثقافة الخلايا البطانية الأبقار الأبهر (الممرات 4-9) في قوارير زراعة الأنسجة المغلفة الجيلاتين (معطف سطح زراعة الأنسجة مع 0.1٪ ث / ت الجيلاتين في برنامج تلفزيوني في RT لمدة 15 دقيقة) في EGM-2 وسائل الإعلام (مع الرصاصة EGM-2 مجموعة تحتوي على 5٪ مصل بقري جنيني، عوامل النمو وجميع المكملات الغذائية المقدمة من قبل الشركة المصنعة، باستثناء الهيدروكورتيزون).
- عندما تكون الخلايا شبه متموجة (حوالي 3 أيام بعد البذر بعد 1: انقسام 4)، وخلايا الحصاد عن طريق العلاج مع 0.05٪ ث / ت التربسين / 0.02٪ ث / ت EDTA في برنامج تلفزيوني في 37 ° C. بعد غالبية خلايا ومنفصلة، إضافة كاملة EGM-2 وسائل الاعلام لإرواء التربسين ثم الطرد المركزي (100 x ج، 5 دقائق).
- إعداد خلايا للدراسات على التصاق دي نوفو من الخلايا البطانية لفبرونيكتين (تجربة 1: القسم 2) واللاحقة دي التصاق الخلايا البطانية مع التصاق أنشئت على هذا الركيزة (تجربة 2: القسم 3).
- غسل تحصدخلايا مرة واحدة مع المصل خالية المتوسطة 199 التي تحتوي على 1٪ ث / ت ألبومين المصل البقري (BSA) وإعادة الطرد المركزي (100 x ج، 5 دقائق).
- اعادة تعليق الخلايا في المصل خالية متوسطة 199 التي تحتوي على 1٪ ث / ت BSA عند 2.5 × 10 5 خلية / مل (القياسات مقاومة الخلايا الركيزة) أو 5 × 10 5 خلية / مل (يحلل تصوير الخلايا الحية) والحفاظ على 37 ° C قبل استخدامها.
ملاحظة: الردود التصاق خلايا حساسة للغاية لالاختلافات في درجة الحرارة (على سبيل المثال، وذلك بسبب الآثار الحراري) لذلك يجب أن تبقى جميع المعدات والحلول المستخدمة في التعامل معها وعلاج الخلايا خلال البروتوكولات التالية في درجة حرارة ثابتة من 37 درجة مئوية.
2. تجربة 1: تحديد مقدار دي نوفو غشائي التصاق الخلايا على فيبرونكتين] الأصليين وMPO المؤكسد (الخلوي الركيزة الممانعة)
ملاحظة: تجربة 1 وتبحث الدرجة التي تتوسط MPO للأكسدة من فبرونيكتين يضعف قدرته على دعم من جديد
- معطف فبرونيكتين على 96-جيدا الذهب خلية الركيزة صفائف مقاومة مسرى مكروي. إضافة 80 ميكرولتر / بئر تنقية فبرونيكتين الأبقار في 5 ميكروغرام / مل في برنامج تلفزيوني، واحتضان لمدة 2 ساعة على 37 درجة مئوية وإزالة الحل.
- احتضان الأسطح المغلفة فبرونيكتين مع MPO للسماح للربط MPO إلى السطح ملزمة فبرونيكتين. إضافة 80 ميكرولتر / جيد من النقاء MPO العدلات الإنسان في 20 نانومتر في محلول ملحي متوازن هانك (HBSS) واحتضان لمدة 0.5 ساعة عند 37 ° C.
- يغسل السطوح مرتين مع HBSS لإزالة أي MPO غير منضم.
- إضافة H 2 O 2 (0-10 ميكرومتر تركيز النهائي) إلى الآبار من لوحة مجموعة مسرى مكروي تحتوي على 80 ميكرولتر / جيد HBSS لبدء MPO المحفزة، والأكسدة فبرونيكتين HOCL التي تعتمد على واحتضان لمدة ساعة 0.5 آخر عند 37 درجة مئوية.
- لدراسة تأثير مثبطات أو جهري من ردود الفعل MPO المحفزة ذات الصلة (على سبيل المثال، بديل انزيم MPOركائز، ومثبطات الإنزيم أو المواد المضادة للاكسدة. الاطلاع على 9 للحصول على التفاصيل)، إضافة إلى هذه HBSS مباشرة قبل H 2 O 2 بالإضافة.
- بعد 0.5 ساعة، وعلاج الأسطح مع ميثيونين لإرواء المتبقية المؤكسدة الأنواع سطح ملزمة، أي الكلورامينات بروتين محدد رد الفعل، والتي قد تمارس الأنشطة الخلوية التباس. إضافة 10 ملي ميثيونين في 80 ميكرولتر HBSS لكل بئر واحتضان لمدة 10 دقيقة عند 37 ° C.
- كتلة السطوح مع BSA. إضافة 80 ميكرولتر / بئر BSA عند 0.2٪ ث / ت في برنامج تلفزيوني، واحتضان لمدة 2 ساعة على 37 درجة مئوية وإزالة الحل.
ملاحظة: سوف المناطق السطحية غير المصقول المتبقية دعم التصاق الخلية وحظر هذه مع بروتين غير لاصقة (أي BSA) يضمن أن الاستجابات التصاق الخلوية تعتمد بشكل صارم على مصفوفة الخلايا لاصقة النقاء المستخدمة، في هذه الحالة فبرونيكتين. - يغسل السطوح مرتين مع HBSS.
ملاحظة: أي من المعالجات السطحية السابقة يؤثر بشكل ملحوظ خلية الركيزة readinع. - بذور الخلايا البطانية مع وقف التنفيذ (إضافة 200 ميكرولتر / جيد في كاليفورنيا. 2.5 × 10 5 خلية / مل، الذي أعد في المصل خالية متوسطة 199 التي تحتوي على 1٪ BSA؛ انظر 1.3) على فبرونيكتين المغلفة السطوح الأم أو MPO المؤكسد.
- مباشرة بعد البذر الخلايا (أي قبل أي مرفق الخلية والانتشار)، جبل لوحة مجموعة مسرى مكروي على ميناء حاضنة (يضم في الحاضنة 37 درجة مئوية في وجود 5٪ CO 2).
- باستخدام برنامج أداة تتخذ فورا "فارغة" قراءة لتطبيع اللاحقة مقاومة الخلايا الركيزة ('مؤشر الخلية') القيم إلى القيم الأساسية الأولية التي تم الحصول عليها في حالة عدم وجود خلية التصاق.
- بدء الحصول على بيانات مؤشر الخلية مستمرة (الحد الأدنى من خلية واحدة مؤشر القراءة / دقيقة).
- احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 لمدة 2 ساعة، وهي الفترة الزمنية التي مرفق الخلية القصوى ونشر يتحقق. وهذا ما يعكسهوplateauing من القيم مؤشر الخلية (انظر الشكل 3A).
ملاحظة: التجربة السابقة (تجربة 1) يدرس كيف الأولية الأكسدة MPO بوساطة من فبرونيكتين يحد من قدرة الخلايا البطانية لإنشاء التصاق الخلايا على هذه الركيزة. التجربة التالية (تجربة 2) يدرس كيف MPO بوساطة الأكسدة فبرونيكتين يعزز انخفاض في التصاق خلايا المصفوفة (أي دي-الالتصاق) في الخلايا البطانية مع التصاق أنشئت على هذا الركيزة. العلاجات في هذه التجارب اثنين متطابقة في جوهرها، باستثناء توقيت الأكسدة MPO بوساطة فبرونيكتين (أي قبل التصاق الخلايا - تجربة 1، وبعد التصاق الخلايا - تجربة 2).
3. تجربة 2: تحديد مقدار الخلايا البطانية دي التصاق من فيبرونكتين] ردا على MPO بوساطة [فيبرونكتين الأكسدة (الممانعة الخلوي الركيزة ويعيش التصوير خلية)
- معطف فبرونيكتين على 96-جيدا مسرى مكروي الذهبrrays لقياس مقاومة الخلية الركيزة (إضافة 80 ميكرولتر / جيد من فبرونيكتين في 5 ميكروغرام / مل في برنامج تلفزيوني واحتضان لمدة 2 ساعة على 37 درجة مئوية) أو أطباق زراعة الخلايا ذات القاع الزجاجي 35 ملم لتحليل التصوير الخلية الحية (إضافة 2 مل / طبق من فبرونيكتين في 5 ميكروغرام / مل في برنامج تلفزيوني واحتضان لمدة 2 ساعة على 37 درجة مئوية).
- كتلة السطوح مع BSA. إضافة BSA عند 0.2٪ ث / ت في برنامج تلفزيوني في أحجام مبين في 3.1 واحتضان لمدة 2 ساعة على 37 درجة مئوية.
- احتضان الأسطح مع MPO للسماح للربط MPO إلى فبرونيكتين. إضافة 20 نانومتر تنقية MPO الإنسان في HBSS في أحجام مبين في 3.1 واحتضان لمدة 0.5 ساعة عند 37 ° C.
- يغسل السطوح مرتين مع HBSS لإزالة أي MPO غير منضم.
- بذور الخلايا البطانية مع وقف التنفيذ (المعد في المتوسطة 199 التي تحتوي على 1٪ ث / ت BSA خالية من المصل؛ انظر 1.3) على فبرونيكتين الأسطح المطلية الأم أو MPO الحاملة.
- إضافة 200 ميكرولتر / جيد عند 2.5 × 10 5 خلية / مل إلى 96 جيدا خلية الركيزة صفائف مقاومة مسرى مكروي. <لى> إضافة 2 مل / طبق في 5 × 10 5 خلية / مل إلى 35 ملم الزجاج القاع أطباق زراعة الخلايا.
- جبل 96 جيدا لوحات مجموعة مسرى مكروي على خلية الركيزة ميناء مقاومة حاضنة (يضم في الحاضنة 37 درجة مئوية في وجود 5٪ CO 2) وأخذ قراءات "فارغة" لبدء الاستحواذ المستمر للبيانات مؤشر الخلية (القسم راجع 2.10 ).
- القاع نقل 35 ملم الزجاج أطباق زراعة الخلايا إلى الحاضنة 37 درجة مئوية في وجود 5٪ CO 2.
ملاحظة: يعمل HBSS عند دراسة MPO تحفيز تفاعلات الأكسدة بدلا من كامل سائل الإعلام والثقافة لأن الأخير يحتوي على الأنواع القابلة للأكسدة التي تتداخل مع تفاعلات الأكسدة.
ملاحظة: بعد موازنة 0.5 ساعة في HBSS، والقيم مؤشر الخلية تستقر في قيم أقل قليلا؛ عندما خلايا ما قبل احتضان مع ركائز الانزيم، الانزيم وخلية يشير مثبطات أو المواد المضادة للاكسدة، أولا التأكد من أن رذات المناظر لا تؤثر تأثيرا كبيرا على القيم التي تم الحصول عليها بعد موازنة.
- للدراسات مقاومة الخلية باستخدام 96 جيدا لوحات مجموعة مسرى مكروي:
- إزالة لوحة مجموعة مسرى مكروي من الحاضنة وقفة قياسات مؤشر الخلية.
- إضافة H 2 O 2 (تركيز النهائي من 0-10 ميكرومتر) إلى HBSS وتخلط بلطف قبل pipetting المتكررة.
- على الفور، وإعادة جبل لمجموعة مسرى مكروي مرة أخرى إلى 37 درجة مئوية ميناء الحاضنة وإعادة بدء-الحصول على قراءات مؤشر الخلية.
- للدراسات التصوير الخلية الحية باستخدام 35 مم طبق زجاج القاع زراعة الخلايا:
- إزالة الطبق الثقافة من الحاضنة وجبل على 37 درجة مئوية مرحلة ساخنة من مجهر متحد البؤر مقلوب مجهزة عدسة الهدف 63X الماء مع البصريات DIC مناسبة لتسجيل الأفلام الخلية الحية.
- التركيز على الخلايا وتحسين البصريات DIC (كولر الإضاءة، والتخلف التحيز وكاميرا تعويض / ربح، لمزيد من التفاصيل، انظر 13).
- بدء DIC فيلم وتسجيل قراءات أساسية من الخلايا غير المعالجة لمدة 1 دقيقة.
- إضافة H 2 O 2 (تركيز النهائي من 0-10 ميكرومتر) وتخلط بلطف قبل pipetting المتكررة. إعادة تركيز المجهر (إذا لزم الأمر) ومواصلة تسجيل الأفلام DIC من الخلايا المعالجة للفترة الزمنية المطلوبة.
4. تحليل البيانات وعرض
- البيانات مقاومة الخلايا الركيزة
- تصدير البيانات الخام (مؤشر الخلية مقابل الوقت) في جدول بيانات.
- للدراسات خلية دي التصاق (تجربة 2: القسم 3)، وتطبيع البيانات عن طريق وضع القيم المسجلة مباشرة قبل بدء MPO بوساطة الأكسدة فبرونيكتين بقيمة 1 (أي مباشرة قبل إضافة H 2 O 2 في 3.11 .1.1).
ملاحظة: هذا يضمن قريبلا يخفيها التغيرات في قيم مؤشر الخلية التي تسببها MPO بوساطة الأكسدة فبرونيكتين بسبب الخلافات المبدئية صغيرة في قيم مؤشر الخلية المطلقة بين الآبار.- البيانات الحالية كما قطع مؤشر تطبيع الخلية (المحور الصادي) مقابل الوقت (محور س).
- بيانات التصوير الخلية الحية (دراسات الخلية دي التصاق في تجربة 2: القسم 3)
- فتح DIC يعيشون الأفلام التصوير الخلية سجلت مباشرة قبل وبعد الشروع في MPO بوساطة الأكسدة فبرونيكتين في برنامج تحليل الصور القياسية (على سبيل المثال، والبرمجيات يماغيج).
- في اثنين على الأقل الأفلام DIC منفصلة باختيار عشوائي خلايا متعددة وقياس منطقتهم المتوقعة في إطارات متسلسلة (على سبيل المثال، في 1 دقيقة فترات) عن طريق تتبع حافة غشاء الخاصة بهم يدويا وتحديد عدد بكسل المغلقة.
- بيانات منطقة خلية تصدير البيانات الخام (منطقة خلية المتوقعة مقابل الوقت) إلى جداول البيانات إكسل وتطبيع من خلال وضع القيم سجلت سابقة على الفور لبدء MPO بوساطة الأكسدة فبرونيكتين بقيمة 1 (أي مباشرة قبل إضافة H 2 O 2 في 3.11.2.3).
- البيانات الحالية باعتباره مؤامرة من منطقة تطبيع الخلية (المحور الصادي) مقابل الوقت (محور س).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
في الوقت الحقيقي الكمي للخلية البطانية دي التصاق من فبرونيكتين في استجابة للأكسدة فبرونيكتين MPO بوساطة (تجربة 2)، والبذر من الايقاف الخلية البطانية على مواطن (MPO الحرة) فبرونيكتين أو MPO تحمل النتائج فبرونيكتين في مرفق الخلية القصوى ونشر في غضون 2 ساعة، ويحكم من قبل plateauing القيم مؤشر الخلية في قياسات مقاومة الركيزة الخلية (الشكل 3A). يتم تخفيض هذه المرحلة الأولية من مرفق الخلية وتنتشر بشكل ملحوظ عند بدء MPO بوساطة الأكسدة فبرونيكتين قبل البذر الخلايا في تجارب أجريت وفقا لبروتوكول بالتفصيل في تجربة 1 (لا تظهر البيانات؛ لمزيد من التفاصيل انظر 9). وبمجرد إنشاء خلية التصاق القصوى على فبرونيكتين الأم أو MPO الحاملة، استهدفت الأكسدة فبرونيكتين بوساطة MPO المحفزة HOCL (التي بدأها إضافة MPO وشارك في الركيزة H 2 O 2) يؤدي إلى انخفاض سريع في سورمنطقة الوجه للاتصال خلية مصفوفة تقاس مقاومة الخلايا الركيزة (الشكل 3A، B) وتصوير الخلايا الحية (الشكل 3C، لممثل DIC الفيلم، نرى الفيلم 1؛ مؤشر الخلية أو منطقة خلية خسائر بعد H 2 O 2 إضافة هي الحد الأدنى في غياب MPO 9). في حين كانت مؤشر الخلية ومساحة الخلية التغييرات أثناء MPO يسببها دي التصاق متشابهة جدا، قد يعكس انخفاض أبطأ نسبيا في قيم مؤشر الخلية آثار العازلة المواد غشاء الخلية موجودة في مناطق "خالية من الخلايا 'في محيط الخلية خلال اجتثاث التصاق، والتي لا كميا في قياسات منطقة الخلية المتوقعة. على السريع الخلوي دي التصاق واضح في الخلايا البطانية بد أن MPO الحاملة فبرونيكتين ردا على H 2 O 2 العلاج غائب في خلايا تعامل مع H 2 O 2 وحده (أي الخلايا التي لا تحتوي على MPO) (الشكل 3A) و تم حظر بمثبطات أنزيم ذ MPO أو الزبالين HOCL (لا تظهر البيانات؛ انظر 9 للحصول على التفاصيل)، وتحديد أن هذه العملية تعتمد على إنتاج MPO المحفزة لHOCL (راجع الشكل 1). تثبيط ميوسين II ظيفة الحركة مع blebbistatin يمنع معدل البطانية خلية دي التصاق تقاس خلية الركيزة مقاومة (الشكل 3B)، وتصوير الخلايا الحية (الشكل 3C، فيلم 2)، وتحديد التي الخلوي دي التصاق والانكماش في الرد لMPO المحفزة للأكسدة مصفوفة التحت خلوية مدفوعة من قبل قوات أكتوميوزين الشد 9.
الشكل 1. MPO بوساطة الأكسدة مصفوفة التحت خلوية مشغلات خلية مصفوفة دي التصاق وإشارات الخلية. MPO يطلق الردود دي التصاق السريعة والتغيرات في تعتمد على الالتصاق الإشارات التي تتوسط س المستهدفةxidation من مادة لاصقة البروتينات مصفوفة تحت البطانة، التي تنطوي على الأحداث التالية: 9 (A) MPO يربط بشوق إلى مصفوفة تحت البطانة وتستخدم H 2 O 2 لتوليد أكسدة شديدة التفاعل HOCL أن يتفاعل مع البروتينات المصفوفة محليا (على سبيل المثال، فبرونيكتين) ويعطل بها الخلية خصائص لاصقة. (B) هذا الضرر يعطل الاتصالات لاصقة في واجهة خلية مصفوفة، مما أدى إلى تراجع (C) غشاء يقودها التوتر بالتزكية في الهيكل الخلوي الأكتين وتغيير مسارات إشارات الخلية التي تعتمد على الالتصاق (مستنسخة بإذن من ريس وآخرون. 9 ). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
شملت رقمالبريد 2. تدفق العمل ومبدأ مقاومة الخلايا الركيزة يحلل لتحديد البطانية خلية دي التصاق من فبرونيكتين في استجابة للأكسدة فبرونيكتين MPO بوساطة (تجربة 2). القيم مؤشر خلية قياس من قبل نظام خلية الركيزة ميكروأري مقاومة جهاز الاستشعار البيولوجي تعكس قدرة غشاء الخلية للحد من التيارات أيون التي يسببها الميدان على سطح القطب وتكون متناسبة مع مساحة الخلية الركيزة الاتصال 10. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. في الوقت الحقيقي الكمي للخلية البطانية دي التصاق من فبرونيكتين في استجابة للأكسدة فبرونيكتين MPO بوساطة (تجربة 2). تعليق الخلايا البطانية (في المصل خالية المتوسطة 199 التي تحتوي على 1٪BSA) والمصنفة على فبرونيكتين الأم أو MPO الحاملة (فبرونيكتين المغلفة في 5 غ / مل، ثم حضنت في غياب أو وجود 20 نانومتر MPO) في 96 صفائف جيدا مسرى مكروي (القياسات مقاومة الخلايا الركيزة) أو 35 ملم الزجاج السفلي أطباق زراعة الخلايا (يحلل تصوير الخلايا الحية). ثم تم تحضين الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة للسماح مرفق الخلية القصوى ونشر قبل توازنه الخلايا مع HBSS والشروع MPO بوساطة الأكسدة فبرونيكتين بإضافة H 2 O 2 (10 ميكرومتر) (الوقت من H 2 O 2 إضافة مجموعة في ر = 0 دقيقة). (A) كامل الوقت بالطبع من القياسات مقاومة الخلايا الركيزة قبل وبعد العلاج مع H 2 O 2 في وجود (+ MPO) وغياب (-MPO) من MPO. (B) القياسات مقاومة الخلوي الركيزة و(C) مساحة الخلية القياسات بواسطة التصوير الخلية الحية تحلل، وبعد علاج MPO التي تحتوي على الخلايا مع H 2 O 2 في وجود (+ blebbistatin) وغياب (-blebbistatin) من المانع blebbistatin ميوسين II (40 ميكرومتر). مؤشر الخلية ومنطقة خلية القيم هي تطبيع مع القيم مباشرة قبل وقت H 2 O 2 بالإضافة إلى ذلك، التي أعطيت قيمة 1. بيانات مؤشر الخلية تمثل متوسط SEM، والقياسات ن = 6 مكرر من تجربة تمثيلية. قيم مساحة الخلية تمثل متوسط SEM، ن = 10 خلايا (2 الأفلام تكرار، 5 خلايا تم اختيارها عشوائيا في الفيلم: انظر أفلام 1 و 2). (الشكل 3B، وترد الشكل 3C، الفيلم 1 و 2 الفيلم بإذن من ريس وآخرون 9). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
فيلم 1 . الوقت الفاصل بين مدينة دبي للإنترنت الصغيرةفيلم scopy من الخلايا البطانية الالتزام على MPO الحاملة فبرونيكتين خلال 0-15 دقائق بعد التعرض لH 2 O 2 (10 ميكرومتر)؛ 1 ثانية = 3 دقائق.
فيلم 2 . الوقت فيلم مرور DIC المجهري للخلايا البطانية الالتزام على MPO الحاملة فبرونيكتين خلال 0-15 دقائق بعد التعرض لH 2 O 2 (10 ميكرومتر) في وجود blebbistatin (40 ميكرومتر)؛ 1 ثانية = 3 دقائق.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يمكن قياسها كميا التصاق خلايا المصفوفة وعمليات نزع التصاق بدقة في الوقت الحقيقي لقرار زمنية عالية باستخدام مقاومة الخلايا الركيزة والتصوير الخلية الحية يحلل. وتوفر هذه النهج في الوقت الحقيقي ميزة كبيرة على تحليلات نقطة النهاية من التصاق الخلية، والتي توفر ضعف القرار الزماني. عن طريق قياس بدقة الردود دي التصاق السريع لقرار زمنية عالية، يمكن لهذه التحليلات توفر رؤى الحرجة في كيفية الصرفية الردود على التعديلات مصفوفة يتم تنظيم وكيفية تأثيرها على الخلية إشارات العمليات التي تعتمد على الالتصاق، وتقاس في موازية باستخدام فحوصات الكيمياء الحيوية ذات الصلة (على سبيل المثال، النشاف الغربي).
في الدراسات الحديثة، استخدمت هذه الطرق لتكشف عن وجود دور للأكسدة رواية MPO بوساطة من المصفوفة تحت البطانة في التسبب في دي التصاق الخلايا البطانية وأظهر: (ط) أن معدل دي التصاق كان يعتمد بشكل حاسم على ما قبل أكتوميوزين القائمةانقباض (راجع أرقام 3B و 3C) و (ثانيا) أن فقدان خلية مصفوفة التصاق دفعت التغيرات في الخلية مسارات الإشارات التي تعتمد على الالتصاق الهامة بما في ذلك SRC التي تعتمد على الفسفرة paxillin وميوسين ضوء سلسلة II الفسفرة 9 (انظر الشكل 1). هذه البيانات لها آثار هامة لفهم وظيفة بطانة الأوعية الدموية وسلامة الحاجز خلال الاستجابات الالتهابية، حيث تورط المصفوفة خارج الخلية تحت البطانة كهدف رئيسي للتأكسد التي تنتجها الودائع تحت البطانة من محددة مصفوفة MPO أو مصادر أخرى للتأكسد رد الفعل 3،5-9، 14.
استخدام نظام مقاومة جهاز الاستشعار البيولوجي خلايا الركيزة استنادا ميكروأري-يوفر منبرا للقوة، عالية الإنتاجية القياسات التصاق الخلية. كل بئر من الآبار 96 خلية الركيزة صفائف مقاومة مسرى مكروي لديه القدرة على تحليل في وقت واحد 32 ظروف تجريبية مختلفة (أي 3 آبار المؤسسة العامةحالة ص). ومع ذلك، عند المقارنة بين التغييرات الصغيرة في التصاق الخلية، وينبغي أن تستخدم على الأقل 4 أو أكثر من الآبار في حالة تجريبية. خلال البذر الخلية والعلاج بالخلايا اللاحقة، ينبغي توخي الحذر للحفاظ على كل الحلول عند 37 درجة مئوية، وتقليل الوقت الذي يستغرقه لعلاج الخلايا خارج 37 ° C البيئة الحاضنة (هذا يتجنب الاختلافات في درجة الحرارة المحتملة عبر مجموعة مسرى مكروي التي قد تؤثر على ردود التصاق ). والجدير بالذكر أن التيار الكهربائي في واجهة خلية الركيزة حساس إلى القوة الأيونية من طاف الخلية 10: وبالتالي، ينبغي أن يسمح للخلايا لكي تتوازن بعد إضافة مخازن جديدة / وسائل الإعلام للحصول على استجابة ثابتة مؤشر الخلية قبل رصد تأثير من التحفيز من الفائدة (انظر الشكل 3.10 و3A). انخفاض في مؤشر الخلية قد لا تعكس فقط انخفاضا في متوسط مساحة خلية مصفوفة الاتصال ولكن قد يعكس أيضا انخفاضا في عدد الخلايا المرفقة. تميزبين هذه الاحتمالات، والتغيرات في عدد الخلايا تعلق على صفائف مسرى مكروي يمكن قياسها كميا مباشرة بعد قياسات مقاومة الخلايا الركيزة التي كتبها كريستال البنفسجي تلطيخ وقد استخدم هذا الأسلوب للتأكد من أن MPO بوساطة الأكسدة فبرونيكتين يتسبب في انخفاض سريع في متوسط مساحة خلية مصفوفة الاتصال، ولكن لا يشجع مفرزة الخلية (لمزيد من التفاصيل، انظر 9).
وجود قيود على أسلوب مقاومة الخلايا الركيزة هو أنه يوفر بمتوسط قدر من التغييرات التصاق على جميع الخلايا موجودة على سطح مسرى مكروي وأنها لا تعطي معلومات حول الطبيعة الدقيقة للالتصاق أو التغيرات المورفولوجية على مستوى الخلايا الفردية. لمعالجة هذا القيد، الخلية الحية DIC المجهري وتحليل الصور يوفر تدبير مكمل للتغيرات التصاق ويكشف عن تغيرات شكلية من الخلايا الفردية. وهكذا، وانخفاض في مؤشر الخلية ردا على MPO بوساطة فبرونيكتين الأكسدة الشرق الأوسط وأفريقياقيس من قبل مقاومة الخلايا الركيزة (الشكل 3A) ترتبط بشكل جيد مع انخفاض في المنطقة المعروضة للخلايا الحية تقاس تحليل صورة خلية من الأفلام DIC (الشكل 3B). الأهم من ذلك، تكشف الأفلام DIC أنه في الخلايا الفردية، MPO الناجم عن نزع التصاق ينطوي على التراجع السريع للغشاء الخلية الطرفية من التحتية والخلايا المجاورة ويؤدي في النهاية إلى خلايا افتراض مورفولوجيا المدمجة "تقريب المتابعة"، ولكن من دون ان تسفر في مفرزة الخلية (فيلم 1). كما هو الحال مع قياسات مقاومة الخلايا الركيزة، لضمان الاستجابات الخلوية استنساخه، ينبغي توخي الحذر للحفاظ على الحلول عند 37 درجة مئوية قبل استخدامها على الخلايا ومرحلة المجهر ساخنة (أو ما يعادلها جهاز التحكم في درجة الحرارة) يجب أن تستخدم خلال تصوير الخلايا الحية التسجيلات.
بروتوكولات الموصوفة هنا يمكن تعديلها بسهولة عن طريق استبدال فبرونيكتين مع غيرها من ركائز مصفوفة المنقى (
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم الإفصاحات لجعل.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 well gold cell-substrate impedance microelectrode array | ACEA Biosciences / Roche | E-Plate 96 | single-use plate used for performing cell-based assays on the xCELLigence system |
| blebbistatin | Sigma | B0560 | selective inhibitor of non-muscle myosin-II |
| Bovine Aortic Endothelial Cells, cryopreserved | Lonza | BW-6001 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | 05470 | |
| EGM-2 BulletKit | Lonza | CC-3162 | endothelial cell growth media kit |
| Fibronectin, lyophilized powder | Sigma | F-4759 | from bovine plasma |
| Fluorodish 35 mm glass-bottomed cell culture dish | World Precision Instruments | FD35-100 | Cell cuture dish with optical quality glass bottom for imaging |
| Gelatin from bovine skin | Sigma | G9391 | cell culture substratum |
| Hank's Balanced Salt Solution | Life Technologies | 14025076 | |
| Hydrogen peroxide | Merck | 107298 | |
| Medium-199 | Life Technologies | 11150-059 | serum-free cell media |
| Methionine | Sigma | M9500 | quenches chlorinating oxidants generated by myeloperoxidase |
| Myeloperoxidase, Human Polymorphonuclear Leukocytes | Millipore | 475911 | |
| RTCA MP Instrument / xCELLigence cell substrate impedance system | ACEA Biosciences / Roche | Consists of RTCA Analyzer, RTCA (Multiple Plate) MP Station and RTCA Control Unit | |
| Trypsin-EDTA (0.5%) | Gibco | 15400-054 |
References
- Wu, M. H. Endothelial focal adhesions and barrier function. J Physiol. 569, 359-366 (2005).
- Geiger, B., Yamada, K. M. Molecular architecture and function of matrix adhesions. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3, (2011).
- Rees, M. D., Kennett, E. C., Whitelock, J. M., Davies, M. J. Oxidative damage to extracellular matrix and its role in human pathologies. Free Radic Biol Med. 44, 1973-2001 (2008).
- Cox, T. R., Erler, J. T. Remodeling and homeostasis of the extracellular matrix: implications for fibrotic diseases and cancer. Dis Model Mech. 4, 165-178 (2011).
- Baldus, S., et al. Endothelial transcytosis of myeloperoxidase confers specificity to vascular ECM proteins as targets of tyrosine nitration. J Clin Invest. 108, 1759-1770 (2001).
- Baldus, S., et al. Spatial mapping of pulmonary and vascular nitrotyrosine reveals the pivotal role of myeloperoxidase as a catalyst for tyrosine nitration in inflammatory diseases. Free Radic Biol Med. 33, 1010-1019 (2002).
- Thomas, S. R., Witting, P. K., Drummond, G. R. Redox control of endothelial function and dysfunction: molecular mechanisms and therapeutic opportunities. Antioxid Redox Signal. 10, 1713-1765 (2008).
- Rees, M. D., et al. Myeloperoxidase-derived oxidants selectively disrupt the protein core of the heparan sulfate proteoglycan perlecan. Matrix Biol. 29, 63-73 (2010).
- Rees, M. D., et al. Targeted subendothelial matrix oxidation by myeloperoxidase triggers myosin II-dependent de-adhesion and alters signaling in endothelial cells. Free Radic Biol Med. 53, 2344-2356 (2012).
- Solly, K., Wang, X., Xu, X., Strulovici, B., Zheng, W. Application of real-time cell electronic sensing (RT-CES) technology to cell-based assays. Assay Drug Dev Technol. 2, 363-372 (2004).
- Giaever, I., Keese, C. R. Micromotion of mammalian cells measured electrically. Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 7896-7900 (1991).
- Vissers, M. C., Thomas, C. Hypochlorous acid disrupts the adhesive properties of subendothelial matrix. Free Radic Biol Med. 23, 401-411 (1997).
- Ziv, N. E., Schiller, J. Differential Interference Contrast (DIC) Imaging of Living Cells. CSH Protoc. 2007, (2007).
- Kennett, E. C., et al. Peroxynitrite modifies the structure and function of the extracellular matrix proteoglycan perlecan by reaction with both the protein core and the heparan sulfate chains. Free Radic Biol Med. 49, 282-293 (2010).
- Sen, S., Ng, W. P., Kumar, S. Contractility dominates adhesive ligand density in regulating cellular de-adhesion and retraction kinetics. Ann Biomed Eng. 39, 1163-1173 (2011).
- Wildt, B., Wirtz, D., Searson, P. C. Programmed subcellular release for studying the dynamics of cell detachment. Nat Methods. 6, 211-213 (2009).
