Summary
Hier presenteren we een protocol continu kwantificeren celadhesie en de adhesie processen met hoge tijdsresolutie op niet-invasieve wijze door cel-substraat impedantie en live cell imaging analyses. Deze benaderingen onthullen de dynamiek van cel adhesie / de-adhesieprocessen getriggerd door matrixmodificatie en hun temporele relatie tot adhesie-afhankelijke signalering evenementen.
Abstract
Cel-matrix adhesie speelt een belangrijke rol in de controle celmorfologie en signalering. Stimuli die cel-matrix adhesie (bijvoorbeeld myeloperoxidase en andere matrix modificerende oxidanten / enzymen vrijkomen bij ontsteking) verstoren zijn betrokken bij het ontstaan van pathologische veranderingen in cellulaire functie fenotype en levensvatbaarheid in een aantal ziekten. Hier beschrijven we hoe cel-substraat impedantie en live cell imaging aanpak gemakkelijk kan worden gebruikt om nauwkeurig kwantificeren real-time veranderingen in celadhesie en de adhesie geïnduceerd door matrixmodificatie (met endotheelcellen en myeloperoxidase als pathofysiologische matrix modificerende stimulus) met hoge tijdsresolutie en op niet-invasieve wijze. De xCELLigence cel-substraat impedantie systeem kwantificeert continu het gebied van cel-matrix adhesie door meting van de elektrische impedantie in de mobiele substraatgrensvlak in cellen gekweekt op goud micro-elektrode arrays. Beeldanalyse van time-lapse differentiële interferentie contrast films kwantificeert veranderingen in het geprojecteerde gebied van afzonderlijke cellen in de tijd, die veranderingen in het gebied van cel-matrix contact. Beide technieken nauwkeurig te kwantificeren snelle veranderingen om cellulaire hechting en de-adhesieprocessen. Cel-substraat impedantie micro-elektrode arrays biosensor verschaft een platform voor robuuste, high-throughput metingen. Live cell imaging analyseert zorgen voor extra details met betrekking tot de aard en de dynamiek van de morfologische veranderingen gekwantificeerd door cel-substraat impedantie metingen. Deze aanvullende benaderingen leveren waardevolle nieuwe inzichten in hoe-myeloperoxidase- gekatalyseerde oxidatie van subcellulaire extracellulaire matrix componenten triggers snelle veranderingen in de cel adhesie, morfologie en signalering in endotheelcellen. Deze benaderingen zijn ook voor het bestuderen van cellulaire adhesie dynamiek in reactie op andere matrix modificerende stimuli en aanverwante hechtende cellen (bijvoorbeeld epitheelcellen).
Introduction
Stabiele lijm contacten tussen cellen en de omringende extracellulaire matrix vereist onderhoud weefsel homeostase. Bijvoorbeeld endotheelcel adhesie aan de subendotheliale matrix bloedvaten speelt een cruciale rol bij het handhaven van de integriteit van de endotheliale laag en de homeostatische functie als regulerende, halfdoorlaatbare barrière vasculaire 1. Het actine cytoskelet is mechanisch gekoppeld met matrix moleculen op plaatsen van cel-matrix adhesie en hechtende contacten op de cel-matrix-interface lijm spelen een belangrijke rol bij het bepalen van de positie van het celmembraan door weerstand centraal gerichte actomyosine trekkrachten. Extracellulaire stimuli die cel-matrix adhesie veranderen nood- evenwicht van krachten de cel-matrix-interface, een gebeurtenis die snel veranderen "gevoeld" door mechanisch-gevoelige signaaleiwitten, waardoor de transductie van "outside-in signalering". Deze cross-talk betsen cellen en de omringende extracellulaire matrix speelt een belangrijke rol in de controle celvorm, beweeglijkheid, functionaliteit, proliferatie en overleving 2.
Diverse pathofysiologische processen (embryonale ontwikkeling, ontsteking, wondheling en kanker metastase) worden gekenmerkt door dynamische remodelleringvan klevende matrix substraten matrix- afbrekende oxidanten en / of enzymen 3,4. Bijvoorbeeld, zelfklevend subendotheliale matrixeiwitten bloedvaten (bijvoorbeeld fibronectine) zijn geïmpliceerd als belangrijke doelwitten voor modificatie of afbraak in het inflammatoire ziekten als gevolg van de lokale productie van reactieve oxidanten (bijvoorbeeld, hypochloorzuur, HOCl) van de leukocyt afgeleide enzym myeloperoxidase (MPO), die in inflammatoire vaatziekten (figuur 1) 5-9 accumuleert in het subendotheel. Veranderingen in cel-matrix adhesie geïnduceerd door MPO-afgeleide oxidanten en andere matrix modificerende stimuli likEly belangrijke rol spelen bij veranderende vasculaire homeostase bij verschillende pathologische processen, bijvoorbeeld door verandering van endotheelcellen signalering, morfologie en levensvatbaarheid, waardoor verstoort endotheelfunctie en integriteit. Echter, de morfologische en celsignalen reacties van hechtende cellen aan de extracellulaire matrix wijzigingen alleen begint te worden begrepen.
Om te begrijpen hoe matrix wijzigingen rijden veranderingen in cel adhesie dynamiek en adhesie-afhankelijke cel signaalwegen, zijn technieken die nodig zijn dat veranderingen in de cel-matrix adhesie in real time nauwkeurig te kwantificeren, met een hoge temporele resolutie. We beschrijven hier complementair cel-substraat impedantie en live cell imaging technieken die aan deze criteria voldoen en een platform celadhesie en de adhesie processen kwantificeren op niet-invasieve wijze.
We laten zien hoe deze cel-substraat impedantie en live cell imaging voorkomendpijn kan gemakkelijk worden toegepast om (i) controleren de dynamiek van celhechting en spreiding (dwz de novo celadhesie) op natieve en gemodificeerde matrix substraten en (ii) de dynamica van cel-matrix onthechting meten (dwz de wrijvingscoëfficiënt ) van hechtende cellen blootgesteld aan matrix modificerende stimuli. De xCELLigence cel-substraat impedantie biosensor systeem zorgt voor een continue meting van de oppervlakte van de cel-matrix contact door het kwantificeren van elektrische impedantie aan het oppervlak van 96-wells gouden micro-elektrode arrays en spreekt deze elektrische impedantie metingen als 'cell-index', een dimensieloze waarde die is grotendeels evenredig met het oppervlak van cel-substraat contact 10 (figuur 2), terwijl ook gevoelig voor veranderingen in de gemiddelde afstand tussen de (isolerende) celmembraan en het elektrodeoppervlak 11. Een verdere toename van de cel-index waarden wordt ook bereikt bij de oprichting van strakke cel-cel contacten that beperken paracellulair stroom, 11 omstandigheden die niet binnen de in deze studie beschreven experimenten doen prevaleren. Meting van het geprojecteerde gebied van individuele cellen in de tijd door beeldanalyse van time-lapse differentieel interferentie contrast (DIC) films biedt een aanvullende maatregel van veranderingen op het gebied van cel-substraat contact en geeft aanvullende informatie over de precieze aard en dynamiek van de morfologische veranderingen gekwantificeerd door de cel-substraat impedantie benadering.
Met name de toepassing van deze benaderingen volgen hoe MPO-gemedieerde oxidatie kleefmiddel subendotheliale matrix proteïnen (bijvoorbeeld fibronectine) (i) vermindert het de novo hechting van zwevende endotheelcellen op gezuiverde fibronectine en (ii) activeert cel-matrix de We beschrijven -adhesion in endotheelcellen vastgelegde hechting aan fibronectine. Door het uitvoeren van parallelle celsignalering analyseert de tijd met behulp van relevante biochemical assays (bijvoorbeeld Western blotting), de temporele en causale verbanden tussen adhesie / de-adhesie processen en bijbehorende veranderingen in adhesie-afhankelijke signaaltransductie gebeurtenissen kunnen worden bepaald.
Deze benaderingen zijn onlangs gebruikt om aan te tonen dat extracellulaire matrix oxidatie gekatalyseerd door subendotheliale afzettingen van MPO veroorzaakt een snelle verlies in cel-matrix adhesie van endotheelcellen die wordt aangedreven door bestaande actomyosine contractiele krachten 9. Belangrijk doordat de tijdsrelatie tussen veranderingen in zowel celadhesie en adhesie-afhankelijke signaaltransductie te bepalen deze benaderingen vastgesteld MPO geïnduceerde matrixmodificatie en de cellulaire adhesie triggers wijziging van belangrijke adhesie-afhankelijke signaaltransductie wegen waaronder Src kinase paxillin afhankelijke fosforylering en myosine lichte keten II fosforylering (figuur 1) 9. Deze wijze van redox-afhankelijke signalering, invOlving de activatie van intracellulaire signaleringsgebeurtenissen extracellulair oxidatieve reacties die cel-matrix adhesie te verstoren, is een nieuwe werkwijze celsignalen genoemd "outside-in redox signalling" (figuur 1) 9.
In het algemeen moeten deze complementaire cel-substraat impedantie biosensor en live cell imaging aanpak waardevol in onthullen hoe verschillende matrix modificerende stimuli of agenten rijden veranderingen in celadhesie dynamiek, morfologie en signalering binnen verschillende hechtende celtypen onder uiteenlopende experimentele instellingen.
Het volgende protocol beschrijft hoe u de impact van MPO-gemedieerde matrix oxidatie op de novo endotheliale cel adhesie (Experiment 1) en endotheelcellen de-adhesie (Experiment 2) processen te kwantificeren. MPO bindt gretig aan fibronectine en andere lijm subendotheliale extracellulaire matrix eiwitten en onses waterstofperoxide (H 2 O 2) in chloride-ionen (Cl -) omzetten in de zeer reactieve chloreringsmiddel oxidatiemiddel hypochloorzuur (HOCl), die plaatselijk tast deze matrixeiwitten en verstoort de cel hechting (figuur 1) 8,9, 12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Algemene endotheelcellen Culture
- Cultuur runder aorta endotheelcellen (passages 4-9) op gelatine gecoate weefselkweek kolven (laag weefselkweek oppervlak met 0,1% w / v gelatine in PBS bij kamertemperatuur gedurende 15 min) in EGM-2 medium (met EGM-2 bullet kit met 5% foetaal runderserum, groeifactoren en alle supplementen van de fabrikant, behalve hydrocortison).
- Wanneer cellen bijna samenvloeiende (ca. 3 dagen na enten na een 1: 4 frames), oogsten cellen door behandeling met 0,05% w / v trypsine / 0,02% w / v EDTA in PBS bij 37 ° C. Na de meerderheid van de cellen hebben losgemaakt, voeg volledige EGM-2-media om de trypsine en vervolgens centrifuge (100 xg, 5 min) te lessen.
- Bereid cellen voor studies van de de novo adhesie van endotheliale cellen aan fibronectine (Experiment 1: Deel 2) en daarmee de adhesie van endotheelcellen met gevestigde hechting op het substraat (Experiment 2: Hoofdstuk 3).
- Was geoogstcellen eenmaal met serumvrij medium 199 dat 1% w / v runderserumalbumine (BSA) en opnieuw gecentrifugeerd (100 xg, 5 min).
- Resuspendeer cellen in serumvrij medium 199 dat 1% m / v BSA in 2,5 x 10 5 cellen / ml (cel-substraat impedantiemetingen) of 5 x 10 5 cellen / ml (live cell imaging analyse) en 37 handhaven ° C vóór gebruik.
OPMERKING: De hechting responsen van cellen zijn zeer gevoelig voor temperatuurverschillen (bijvoorbeeld door convectie effect), zodat alle apparatuur en oplossingen die te hanteren en behandelen cellen tijdens de volgende protocollen bij een constante temperatuur van 37 ° C worden bewaard.
2. Experiment 1: Het kwantificeren De Novo endotheelcellen Hechting op inheemse en MPO-geoxideerde fibronectine (Cell-substraat Impedantie)
OPMERKING: Experiment 1 onderzoekt de mate waarin MPO-gemedieerde oxidatie van fibronectine schaadt het vermogen ondersteunen de novo
- Jas fibronectine op 96-well goud cel-substraat impedantie micro-elektrode arrays. Voeg 80 ul / putje van gezuiverd bovine fibronectine bij 5 ug / ml in PBS, incubeer gedurende 2 uur bij 37 ° C en verwijdert de oplossing.
- Incubeer met fibronectine gecoate oppervlakken MPO tot het binden van MPO aan het oppervlak gebonden fibronectine. Voeg 80 ul / putje van gezuiverd humaan neutrofiel MPO bij 20 nM in Hank's gebalanceerde zoutoplossing (HBSS) en incubeer gedurende 0,5 uur bij 37 ° C.
- Wassen oppervlakken tweemaal met HBSS om eventuele ongebonden MPO verwijderen.
- Voeg H 2 O 2 (0-10 uM eindconcentratie) aan putjes van de micro-elektrode matrix plaat met 80 ul / putje HBSS tot inleiding MPO-gekatalyseerde HOCl-afhankelijke fibronectine oxidatie en incubeer gedurende nog 0,5 uur bij 37 ° C.
- Om het effect van relevante remmers of modulators van MPO-gekatalyseerde reacties (bijvoorbeeld alternatieve MPO enzym onderzochtsubstraten, remmers of antioxidantia; Zie 9 voor details), moeten deze aan de HBSS onmiddellijk voor H 2 O 2 optelling.
- Na 0,5 uur, te behandelen oppervlakken met methionine om de resterende oppervlakte-gebonden oxiderende soorten lessen, dat wil zeggen, reactief eiwit-gebonden chloramines, die verstorende cellulaire activiteiten kunnen uitoefenen. Voeg 10 mM methionine in 80 ul HBSS per putje en incubeer gedurende 10 minuten bij 37 ° C.
- Blok oppervlakken met BSA. Voeg 80 ul / putje BSA 0,2% w / v in PBS, incubeer gedurende 2 uur bij 37 ° C en verwijdert de oplossing.
OPMERKING: Residuele ongestreken oppervlaktegebieden zullen celadhesie ondersteunen verhinderde deze met een niet-klevende eiwit (dwz BSA) waarborgt dat cellulaire adhesie reacties strikt afhankelijk van het gezuiverde cel-klevende matrix toegepast, in dit geval fibronectine. - Wassen oppervlakken tweemaal met HBSS.
NB: Geen van de voorgaande oppervlaktebehandelingen aanmerkelijk beïnvloedt cel-substraat readings. - Zaad gesuspendeerde endotheelcellen (voeg 200 ul / putje bij ongeveer 2,5 x 10 5 cellen / ml, bereid in serumvrij medium 199 dat 1% BSA, zie 1.3) op het natieve of MPO-geoxideerde fibronectine gecoate oppervlakken.
- Onmiddellijk na het zaaien cellen (dwz vóór iedere celhechting en spreiding), zet de micro-elektrode reeks voorwerpen tegen de incubator poort (ondergebracht in een 37 ° C incubator in aanwezigheid van 5% CO2).
- De instrumentsoftware onmiddellijk een "lege" lezing normaliseren volgende cel-substraat impedantie ("cell index") waarden van de oorspronkelijke achtergrondwaarden verkregen in afwezigheid van intercellulaire adhesie.
- Initiëren verwerving continue cel indexgegevens (minimaal één cel indexcijfer / min).
- Incubeer de cellen bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende 2 uur, een periode waarin maximale celhechting en spreiding wordt bereikt; Dit wordt weerspiegeld dooreen plateauing van de cel-index waarden (zie figuur 3A).
OPMERKING: De voorgaande experiment (experiment 1) onderzoekt hoe de initiële MPO-gemedieerde oxidatie van fibronectine beperkt de mogelijkheid van endotheelcellen naar cel adhesie te vestigen op deze ondergrond. Het volgende experiment (experiment 2) onderzoekt hoe MPO-gemedieerde fibronectine oxidatie bevordert de afname in cel-matrix adhesie (dat wil zeggen, de-adhesie) in endotheelcellen met gevestigde hechting op dit substraat. De behandelingen in deze twee experimenten zijn in wezen identiek, behalve de timing van MPO-gemedieerde oxidatie fibronectine (dwz voor celadhesie - Experiment 1; na celadhesie - Experiment 2).
3. Experiment 2: Het kwantificeren van endotheelcellen De-hechting van fibronectine in reactie op MPO-gemedieerde Fibronectine Oxidatie (Cell-substraat Impedantie en live cell imaging)
- Jas fibronectine op 96-well gouden micro-elektrode eenrrays voor cel-substraat impedantiemetingen (voeg 80 ul / putje van fibronectine bij 5 ug / ml in PBS en incubeer gedurende 2 uur bij 37 ° C) of 35 mm glazen bodem celcultuurschalen voor live cell imaging analyses (2 ml / schaal van fibronectine bij 5 ug / ml in PBS en incubeer gedurende 2 uur bij 37 ° C).
- Blok oppervlakken met BSA. Voeg BSA 0,2% w / v in PBS bij de in 3.1 volumes en incubeer gedurende 2 uur bij 37 ° C.
- Incubeer oppervlakken MPO om de binding van MPO fibronectine. Voeg 20 nM gezuiverd humaan MPO in HBSS bij de in 3.1 volumes en incubeer gedurende 0,5 uur bij 37 ° C.
- Wassen oppervlakken tweemaal met HBSS om eventuele ongebonden MPO verwijderen.
- Zaad gesuspendeerde endotheelcellen (bereid in serumvrij medium 199 dat 1% m / v BSA, zie 1.3) op het natieve of MPO-dragende fibronectine gecoate oppervlakken.
- Voeg 200 ul / putje van 2,5 x 10 5 cellen / ml tot 96 en cel-substraat impedantie micro-elektrode arrays. <li> Voeg 2 ml / schotel bij 5 x 10 5 cellen / ml tot 35 mm glazen bodem celkweek gerechten.
- Mount 96 putjes micro-elektrode-array platen op de cel-substraat impedantie incubator poort (ondergebracht in een 37 ° C incubator in aanwezigheid van 5% CO2) en neem 'blanco' afgelezen waarden voortdurend eigen cel indexgegevens (zie paragraaf 2.10 initiëren ).
- Overdracht 35 mm glazen bodem celcultuurschalen een 37 ° C incubator in aanwezigheid van 5% CO2.
OPMERKING: HBSS in dienst is bij het bestuderen van MPO-gekatalyseerde oxidatieve reacties in plaats van complete cultuur media als de laatste bevat oxideerbare soorten die interfereren met de oxidatiereacties.
OPMERKING: Na 0,5 uur verevening in HBSS, cel-index waarden stabiliseren op iets lagere waarden; wanneer vooraf incuberen van cellen met enzymsubstraten, enzym en celsignalerende remmers of antioxidantia, vergewissen teze niet wezenlijk aantasten verkregen bij evenwicht waarden.
- Voor celimpedantie studies met 96 goed micro-elektrode-array platen:
- Verwijder de micro-elektrode-array plaat uit de incubator en pauze cel index metingen.
- Voeg H 2 O 2 (eindconcentratie van 0-10 uM) aan de HBSS en meng door herhaald pipetteren.
- Onmiddellijk, opnieuw monteren van de micro-elektrode-array terug op de 37 ° C incubator-poort en opnieuw te beginnen de overname van de mobiele index lezingen.
- Voor live cell imaging studies met behulp van 35 mm glazen bodem celkweekschaaltje:
- Verwijder de cultuur schotel uit de incubator en monteren op een 37 ° C verwarmd fase van een omgekeerde confocale microscoop uitgerust met een 63x water objectief met geschikte DIC optiek voor het opnemen van live cell films.
- Focus op cellen enoptimaliseren DIC optiek (Köhler verlichting, bias retardatie en camera Offset / gain, voor meer informatie, zie 13).
- Initiëren DIC film en registreren basislijn metingen van onbehandelde cellen gedurende 1 min.
- Voeg H 2 O 2 (uiteindelijke concentratie van 0-10 uM) en meng voorzichtig door herhaalde pipetteren. Opnieuw richten van de microscoop (indien nodig) en voortgezet wordt DIC films van de behandelde cellen voor de vereiste tijd.
4. Data-analyse en presentatie
- Cel-substraat impedantiedata
- Export ruwe data (cel index versus tijd) in een spreadsheet.
- Voor cel de-adhesie studies (Experiment 2: Hoofdstuk 3), normaliseren van gegevens door het instellen van waarden die direct voorafgaand aan de inleiding van MPO-gemedieerde fibronectine oxidatie bij een waarde van 1 (ie, onmiddellijk vóór de toevoeging van H 2 O 2 in 3.11 .1.1).
LET OP: Dit zorgt ervoor dat de relatieveveranderingen in cel index waarden uitgelokt door MPO-gemedieerde fibronectine oxidatie worden niet gemaskeerd door kleine initiële verschillen in absolute cel indexwaarden tussen putten.- Bestaande gegevens plots van genormaliseerde cel index (y-as) versus tijd (x-as).
- Live cell imaging data (cel de-adhesie studies in Experiment 2: deel 3)
- Open DIC live cell imaging films opgenomen direct voorafgaand aan en na de opening van de MPO-gemedieerde fibronectine oxidatie in een standaard beeldanalyse-programma (bijvoorbeeld ImageJ software).
- In ten minste twee afzonderlijke DIC films selecteren willekeurig meerdere cellen en meten hun geprojecteerde oppervlak in opeenvolgende frames (bijvoorbeeld 1 min interval) handmatig traceren van baanrand en kwantificering van het aantal ingesloten pixels.
- Export ruwe data (geprojecteerde celgebied versus tijd) naar een Excel spreadsheet en normaliseren celgebied gegevens door het instellen van waarden die direct voorafgaand aande inleiding van MPO-gemedieerde fibronectine oxidatie bij een waarde van 1 (dat wil zeggen onmiddellijk vóór de toevoeging van H 2 O 2 in 3.11.2.3).
- Aanwezig gegevens als een grafiek van genormaliseerde celoppervlak (y-as) versus tijd (x-as).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Real-time kwantificering van endotheelcellen de-hechting van fibronectine in reactie op MPO-gemedieerde fibronectine oxidatie (Experiment 2). Het zaaien van endotheelcellen suspensies op inheemse (MPO gratis) fibronectine of MPO-dragende fibronectine resulteert in maximale celhechting en spreiding binnen 2 uur, zoals beoordeeld door een plateauing cel indexwaarden in de cel substraat impedantiemetingen (Figuur 3A). Deze eerste fase van celhechting en spreiding wordt aanzienlijk verminderd wanneer MPO-gemedieerde fibronectine oxidatie vóór zaaien van cellen in experimenten uitgevoerd volgens het protocol beschreven in experiment 1 wordt geïnitieerd (gegevens niet getoond; voor details 9). Zodra maximale celadhesie is vastgesteld op natief of MPO-dragende fibronectine, fibronectine gerichte oxidatie gemedieerd door MPO-gekatalyseerde HOCl (geïnitieerd door de toevoeging van MPO co-substraat H 2 O 2) veroorzaakt een snelle afname van de surgezicht gebied van cel-matrix contact gemeten door cel-substraat impedantie (figuur 3A, B) en beeldvorming van levende cellen (Figuur 3C, voor een representatieve DIC film zie Film 1, cel index of celoppervlak verlies na H 2 O 2 optelling minimaal bij afwezigheid van MPO 9). Terwijl cel index en celgebied veranderingen tijdens MPO-geïnduceerde de-adhesie waren zeer vergelijkbaar, de relatief tragere afname van de cel-index waarden kunnen de isolerende werking van de celmembraan materialen aanwezig in 'cel-vrij' regio's op de celperiferie weerspiegelen tijdens de- hechting, die niet gekwantificeerd in het geprojecteerde cel oppervlaktemetingen. De snelle cellulaire de-adhesie blijkt in endotheelcellen gebonden aan MPO-dragende fibronectine reactie op H 2 O 2 behandeling afwezig in cellen behandeld met H 2 O 2 alleen (dat wil zeggen, cellen die geen MPO bevatten) (Figuur 3A) en wordt geblokkeerd by MPO enzymremmers of HOCl scavengers (data niet getoond, zie 9 voor details) identificeren dat dit proces afhankelijk is van de MPO-gekatalyseerde productie van HOCl (zie Figuur 1). Remming van myosine II motorische functie met blebbistatin remt de snelheid van de endotheelcellen de-adhesie gemeten door cel-substraat impedantie (Figuur 3B) en door live cell imaging (Figuur 3C, Movie 2), het identificeren van dat cellulaire de-adhesie en krimp in reactie om MPO-gekatalyseerde subcellulaire matrix oxidatie wordt aangedreven door actomyosine trekkrachten 9.
Figuur 1. MPO-gemedieerde subcellulaire matrix oxidatie triggers cel-matrix-de-adhesie en cell signaling. MPO triggers snelle de-hechting reacties en veranderingen in de adhesie-afhankelijke signalering door te bemiddelen gerichte oxidation kleefmiddel subendotheliale matrix eiwitten, waarbij de volgende gebeurtenissen 9: (A) MPO gretig bindt aan de subendotheliale matrix en gebruikt H 2 O 2 aan de zeer reactieve oxidant HOCl die lokaal reageert met matrixeiwitten (bijvoorbeeld fibronectine) en verstoort het genereren cel klevende eigenschappen. (B) Deze beschadiging verstoort lijm contacten op de cel-matrix interface leidt tot (C) membraan terugtrekking dankzij ongehinderd spanning in het actine cytoskelet en de wijziging van de adhesie-afhankelijke signaaltransductie wegen (Overgenomen met toestemming van Rees et al. 9 ). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figure 2. Work-flow en principe van de cel-substraat impedantie analyses om endotheelcellen de-hechting van fibronectine te kwantificeren in reactie op MPO-gemedieerde fibronectine oxidatie (Experiment 2). Cell-index waarden gemeten door de cel-substraat microarray impedantie biosensor systeem weerspiegelen het vermogen van de celmembraan veld geïnduceerde ionenstromen op het elektrodeoppervlak te beperken en zijn evenredig met het oppervlak van cel-substraat contact 10. Klik hier om een grotere versie van deze figuur zien.
Figuur 3. Real-time kwantificering van endotheelcellen de hechting van fibronectine in reactie op MPO-gemedieerde oxidatie fibronectine (Experiment 2). Endotheliale celsuspensies (in serumvrij medium 199 dat 1%BSA) werden gezaaid natief of MPO-dragende fibronectine (fibronectine gecoate bij 5 g / ml, vervolgens geïncubeerd in de afwezigheid of aanwezigheid van 20 nM MPO) in 96 putjes micro-elektrode arrays (cel-substraat impedantiemetingen) of 35 mm met glazen bodem celcultuur gerechten (live cell imaging analyses). De cellen werden vervolgens geïncubeerd bij 37 ° C gedurende 2 uur tot maximale celhechting en spreiding mogelijk voordat equilibreren cellen met HBSS en initiëren MPO gemedieerde fibronectine oxidatie door toevoeging H 2 O 2 (10 uM) (tijdstip van H 2 O 2 optelling bedraagt t = 0 min). (A) volledige tijdsverloop van cel-substraat impedantiemetingen voor en na behandeling met H 2 O 2 in aanwezigheid (+ MPO) en afwezigheid (-MPO) van MPO. (B) Cell-substraat impedantiemetingen en (C) celoppervlak metingen via live cell imaging analyses, na behandeling van MPO-bevattende cellen met H 2 O 2 met (Blebbistatin +) en afwezigheid (-blebbistatin) van de myosine II inhibitor blebbistatin (40 uM). Cel index en celoppervlak waarden zijn genormaliseerd naar waarden onmiddellijk voorafgaand aan het tijdstip van H 2 O 2 optelling die kregen een waarde van 1. Cell index gegevens stellen het gemiddelde ± SEM, n = 6 herhaalde metingen van een representatief experiment. Celoppervlakte waarden geven het gemiddelde ± SEM, n = 10 cellen (2 herhaalde films, 5 willekeurig geselecteerde cellen per film: zie films 1 en 2). (Figuur 3B, figuur 3C, Film 1 en Film 2 worden gereproduceerd met toestemming van Rees et al. 9). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Film 1 . Time lapse DIC microscopie film van endotheelcellen gehandeld op MPO-dragende fibronectine meer dan 0-15 min na blootstelling aan H 2 O 2 (10 M); 1 sec = 3 min.
Film 2 . Tijdsverloop DIC microscopie filmpje van endotheelcellen gehecht aan MPO-dragende fibronectine gedurende 0-15 min na blootstelling aan H 2 O 2 (10 uM) in aanwezigheid van blebbistatin (40 uM); 1 sec = 3 min.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Cel-matrix adhesie en de-adhesieprocessen nauwkeurig kan worden gekwantificeerd in real time met een hoge temporele resolutie met behulp van cel-substraat impedantie en live cell imaging analyses. Deze real-time benaderingen bieden een groot voordeel ten opzichte van end-point analyses van cel adhesie, die arme temporele resolutie bieden. Door het nauwkeurig kwantificeren snelle de-hechting reacties met een hoge temporele resolutie, kunnen deze analyses kritisch inzicht in verschaffen hoe morfologische reacties op matrix aanpassingen worden geregeld en hoe ze invloed hebben op de hechting-afhankelijke cel signalering processen, gemeten parallel met behulp van relevante biochemische assays (bijvoorbeeld, Western blotting).
In recente studies werden deze methoden toegepast om een nieuwe rol MPO-gemedieerde oxidatie van de subendotheliale matrix triggering het de adhesie van endotheelcellen zichtbaar en vertoonden: (i) de snelheid van de adhesie was kritisch afhankelijk pre- bestaande actomyosinecontractiliteit (zie figuren 3B en 3C) en (ii) het verlies van cel-matrix adhesie reed wijziging van belangrijke adhesie-afhankelijke signaaltransductie wegen waaronder Src-afhankelijke fosforylatie paxillin en myosine lichte keten II fosforylering 9 (zie figuur 1). Deze gegevens hebben belangrijke implicaties voor het begrijpen van de endotheelfunctie en barrière integriteit tijdens ontstekingsreacties, waar de subendotheliale extracellulaire matrix is betrokken als een belangrijke doelstelling voor oxidanten geproduceerd door subendotheliale afzettingen van-matrix gebonden MPO of andere bronnen van reactieve oxidanten 3,5-9, 14.
Het gebruik van een microarray-gebaseerde, cel-substraat impedantie biosensor systeem een platform voor robuuste, high-throughput celadhesie metingen. Elk putje van de 96 putjes cel-substraat impedantie micro-elektrode arrays heeft de potentie om gelijktijdig analyseren 32 verschillende experimentele omstandigheden (dwz 3 wells per voorwaarde). Echter, bij het vergelijken van kleine veranderingen in celhechting, ten minste 4 of meer putjes per experimentele conditie. Tijdens cel zaaien en daaropvolgende cel behandelingen, moet ervoor worden gezorgd dat alle oplossingen bij 37 ° C te houden en het minimaliseren van de tijd genomen om de cellen buiten de 37 ° C incubator milieu (dit voorkomt mogelijke temperatuurverschillen over de micro-elektrode array die hechting reacties van invloed kunnen behandelen ). Met name de elektrische stroom aan de cel-substraat interface is gevoelig voor de ionische sterkte van de cel supernatant 10: bijgevolg cellen worden equilibreren na de toevoeging van nieuwe buffers / media een constante index cel respons te verkrijgen voor volgen van het effect van de stimulus van belang (zie 3.10 en Figuur 3A). Vermindering van cel index zou niet alleen een afname in het gemiddelde gebied van intercellulaire matrix contact kunnen weergeven maar ook een afname van het aantal aangehechte cellen. Om te discriminerentussen deze mogelijkheden, veranderingen in het aantal aangehechte cellen van micro-elektrode arrays kunnen direct na cel-substraat impedantiemetingen Crystal violet kleuring deze benadering is gebruikt om te bevestigen dat MPO gemedieerde fibronectine oxidatie veroorzaakt een snelle afname in het gemiddelde gebied van gekwantificeerde cel-matrix contact, maar is niet bevorderlijk voor mobiele onthechting (voor details, zie 9).
Een beperking van de cel-substraat impedantie techniek is dat het een gemiddelde mate van hechting veranderingen in alle cellen aanwezig zijn op de micro-elektrode oppervlak en bevat geen informatie over de precieze aard van adhesie of morfologische veranderingen op het niveau van individuele cellen bevatten. Om deze beperking te pakken, levende cellen DIC microscopie en beeldanalyse biedt een aanvullende maatregel van hechting veranderingen en onthult morfologische veranderingen van individuele cellen. Zo vermindert in cel index in reactie op MPO-gemedieerde fibronectine oxidatie measured door cel-substraat impedantie (figuur 3A) correleren goed met de dalingen in het geprojecteerde gebied van de cellen gemeten door livebeeld cell analyse van DIC films (figuur 3B). Belangrijk DIC films blijkt dat afzonderlijke cellen, MPO-geïnduceerde de adhesie omvat de snelle terugtrekking van de perifere celmembraan van de ondergrond en naburige cellen en uiteindelijk resulteert in cellen uitgaande van een compacte 'afgeronde up' morfologie, maar dit leidt in cel onthechting (Film 1). Zoals bij cel-substraat impedantiemetingen, reproduceerbare cellulaire responsen waarborgen moet ervoor worden gezorgd dat oplossingen handhaven op 37 ° C voor gebruik op cellen en een verwarmde microscooptafel (of gelijkwaardige temperatuurregelaar) worden gebruikt tijdens de live cell imaging opnames.
De hier beschreven protocollen kunnen gemakkelijk worden gemodificeerd door substitutie met andere gezuiverde fibronectine matrix substraten (
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen onthullingen te maken.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 well gold cell-substrate impedance microelectrode array | ACEA Biosciences / Roche | E-Plate 96 | single-use plate used for performing cell-based assays on the xCELLigence system |
| blebbistatin | Sigma | B0560 | selective inhibitor of non-muscle myosin-II |
| Bovine Aortic Endothelial Cells, cryopreserved | Lonza | BW-6001 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | 05470 | |
| EGM-2 BulletKit | Lonza | CC-3162 | endothelial cell growth media kit |
| Fibronectin, lyophilized powder | Sigma | F-4759 | from bovine plasma |
| Fluorodish 35 mm glass-bottomed cell culture dish | World Precision Instruments | FD35-100 | Cell cuture dish with optical quality glass bottom for imaging |
| Gelatin from bovine skin | Sigma | G9391 | cell culture substratum |
| Hank's Balanced Salt Solution | Life Technologies | 14025076 | |
| Hydrogen peroxide | Merck | 107298 | |
| Medium-199 | Life Technologies | 11150-059 | serum-free cell media |
| Methionine | Sigma | M9500 | quenches chlorinating oxidants generated by myeloperoxidase |
| Myeloperoxidase, Human Polymorphonuclear Leukocytes | Millipore | 475911 | |
| RTCA MP Instrument / xCELLigence cell substrate impedance system | ACEA Biosciences / Roche | Consists of RTCA Analyzer, RTCA (Multiple Plate) MP Station and RTCA Control Unit | |
| Trypsin-EDTA (0.5%) | Gibco | 15400-054 |
References
- Wu, M. H. Endothelial focal adhesions and barrier function. J Physiol. 569, 359-366 (2005).
- Geiger, B., Yamada, K. M. Molecular architecture and function of matrix adhesions. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3, (2011).
- Rees, M. D., Kennett, E. C., Whitelock, J. M., Davies, M. J. Oxidative damage to extracellular matrix and its role in human pathologies. Free Radic Biol Med. 44, 1973-2001 (2008).
- Cox, T. R., Erler, J. T. Remodeling and homeostasis of the extracellular matrix: implications for fibrotic diseases and cancer. Dis Model Mech. 4, 165-178 (2011).
- Baldus, S., et al. Endothelial transcytosis of myeloperoxidase confers specificity to vascular ECM proteins as targets of tyrosine nitration. J Clin Invest. 108, 1759-1770 (2001).
- Baldus, S., et al. Spatial mapping of pulmonary and vascular nitrotyrosine reveals the pivotal role of myeloperoxidase as a catalyst for tyrosine nitration in inflammatory diseases. Free Radic Biol Med. 33, 1010-1019 (2002).
- Thomas, S. R., Witting, P. K., Drummond, G. R. Redox control of endothelial function and dysfunction: molecular mechanisms and therapeutic opportunities. Antioxid Redox Signal. 10, 1713-1765 (2008).
- Rees, M. D., et al. Myeloperoxidase-derived oxidants selectively disrupt the protein core of the heparan sulfate proteoglycan perlecan. Matrix Biol. 29, 63-73 (2010).
- Rees, M. D., et al. Targeted subendothelial matrix oxidation by myeloperoxidase triggers myosin II-dependent de-adhesion and alters signaling in endothelial cells. Free Radic Biol Med. 53, 2344-2356 (2012).
- Solly, K., Wang, X., Xu, X., Strulovici, B., Zheng, W. Application of real-time cell electronic sensing (RT-CES) technology to cell-based assays. Assay Drug Dev Technol. 2, 363-372 (2004).
- Giaever, I., Keese, C. R. Micromotion of mammalian cells measured electrically. Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 7896-7900 (1991).
- Vissers, M. C., Thomas, C. Hypochlorous acid disrupts the adhesive properties of subendothelial matrix. Free Radic Biol Med. 23, 401-411 (1997).
- Ziv, N. E., Schiller, J. Differential Interference Contrast (DIC) Imaging of Living Cells. CSH Protoc. 2007, (2007).
- Kennett, E. C., et al. Peroxynitrite modifies the structure and function of the extracellular matrix proteoglycan perlecan by reaction with both the protein core and the heparan sulfate chains. Free Radic Biol Med. 49, 282-293 (2010).
- Sen, S., Ng, W. P., Kumar, S. Contractility dominates adhesive ligand density in regulating cellular de-adhesion and retraction kinetics. Ann Biomed Eng. 39, 1163-1173 (2011).
- Wildt, B., Wirtz, D., Searson, P. C. Programmed subcellular release for studying the dynamics of cell detachment. Nat Methods. 6, 211-213 (2009).
