Abbiamo sviluppato un nuovo modello di ex vivo per studiare l'azione di ormoni nel seno umano. Si basa su microstrutture tessuti isolati da campioni di tessuto del seno chirurgici che conservano l'architettura del tessuto, le interazioni intercellulari, e segnalazione paracrina.
Lo studio di azione dell'ormone nel seno umano è stata ostacolata dalla mancanza di adeguati sistemi modello. Alla cultura in vitro, cellule epiteliali mammarie primarie tendono a perdere l'espressione del recettore dell'ormone. Ampiamente recettore ormone linee di cellule di cancro al seno positivo utilizzati sono di scarsa rilevanza per la situazione in vivo. Qui, descriviamo un modello ex vivo per studiare l'azione di ormoni nel seno umano. Campioni di tessuto mammario umano fresco da materiale di scarto chirurgico quali mammoplastiche riduzione o mammectomies sono meccanicamente ed enzimaticamente digerite per ottenere frammenti di tessuto contenenti dotti e lobuli e molteplici tipi di cellule stromali. Queste microstrutture tessuti conservati in terreno di base senza fattori di crescita mantenere i contatti intercellulari, l'architettura dei tessuti, e rimangono ormone reattivo per diversi giorni. Essi sono facilmente elaborati per l'RNA e l'estrazione di proteine, l'analisi istologica o memorizzati in congelamento medio. Fluorescenzaattivato ordinamento delle cellule (FACS) può essere utilizzato per arricchire per specifiche popolazioni cellulari. Questo protocollo offre un approccio standard semplice per gli studi traslazionali con altamente complessi, variegati campioni umani.
Informazioni sul paesaggio mutazionale di cancro al seno sta aumentando a ritmi sostenuti. Meno attenzione è stata rivolta a fattori sistemici che influenzano lo sviluppo del cancro al seno. L'esposizione agli ormoni riproduttivi ha un impatto importante sulla progressione della malattia 1-3. Tuttavia, i meccanismi con cui gli ormoni riproduttivi incidono sul seno umano sono poco conosciuti. Lavora con modelli di topo geneticamente ha rivelato che coinvolgono cellule segnalazione intrinseca e paracrine attraverso diversi effettori a valle 4.
La conoscenza limitata su azione ormonale nel seno umano è in gran parte attribuibile alla mancanza di modelli adeguati. Maggior parte dei lavori sui meccanismi di recettore per gli estrogeni (ER) e del recettore del progesterone (PR) segnalazione è stata eseguita con linee di cellule del recettore dell'ormone positivi cancro al seno, come MCF-7 e T47D. Questi sono stati ottenuti da versamento pleurico di pazienti con carcinoma mammario avanzato che aveva already ricevuto trattamenti multipli 5. La rilevanza biologica dei risultati di tali modelli semplici in vitro del seno umano è geni discutibili e bersaglio identificati in questi modelli in vitro sono differiscono da geni bersaglio che sono identificati in modelli animali 6. Quando le cellule epiteliali mammarie umane primaria sono coltivati in vitro tendono a perdere l'espressione del recettore ormonale e, quindi, la risposta ormonale 7,8. Questo problema può essere circumventd da approcci 3D sofisticati con matrigel. In questo modo, C. Clarke e colleghi sono riusciti a stabilire cellule epiteliali mammarie che hanno mantenuto l'espressione del recettore ormonale e hanno mostrato una risposta proliferativa di progesterone stimolazione 9. Tuttavia, due importanti in vivo dei recettori del progesterone geni bersaglio, Wnt-4 e RANKL, non sono state indotte dopo stimolazione progesterone in questo sistema 9. Questo approccio è stato recentemente approvato ulteriormente con in vitro </em> ormone pretrattamento e induzione RANKL è stato raggiunto 10. Un avvertimento resta che matrigel ha attività che dipendono in batch, è costoso, e richiede un disegno sperimentale che è adatto solo per il numero di cellule piccole.
Sulla base della constatazione che in ER vivo e segnalazione PR sono in gran parte mediata da interazioni paracrine 11, abbiamo sostenuto che le interazioni intercellulari devono essere mantenuti. Un altro fattore importante che si perde come tessuti sono correlate alle cellule singole per la cultura in vitro sono le interazioni delle cellule epiteliali con la matrice extracellulare; ma questi sono cruciali per la differenziazione epiteliale e la loro distruzione è importante nella tumorigenesi 12. Con questo in mente, abbiamo stabilito un metodo per isolare microstrutture del tessuto mammario da fresco materiale chirurgico scarto 13. Il parenchima mammario, costituito da un epitelio doppio strato con luminale interna ed esterna myoepithelicellule al, viene sezionato dal tessuto adiposo e sottoposti alla dissociazione enzimatica e meccanica. Dopo il lavaggio e centrifugazione, frammenti di condotti del latte si ottengono che mantengono una stretta interazione con molte cellule stromali. Queste microstrutture del tessuto rimangono ormone reattivo. Il modello è stato validato in campioni clinici 13. Come tale, il presente procedimento può aiutare a studiare l'azione ormonale nel seno in un contesto biologicamente e clinicamente rilevante.
La cultura ex vivo qui descritto fornisce microstrutture del tessuto del seno contenenti dotti e lobuli intatte, insieme ad altri tipi di cellule che normalmente si trovano in seno femminile umano. Nella lavorazione del tessuto mammario umano normalmente ottenuti da mammoplastiche riduzione, rimozione del tessuto adiposo, la digestione enzimatica e meccanica della matrice stromale, e lisi dei globuli rossi arricchisce per frammenti condotto latte e unità lobulare duttali terminali. Digestione enzimatica Gentle…
The authors have nothing to disclose.
Gli autori ringraziano M. Fiche di Ospedale universitario di Losanna per fornire la fotografia mastoplastica, M. Wirth e A. Ayyanan dell'Istituto svizzero per la ricerca sperimentale sul cancro, Centro Nazionale di Competenza nella Ricerca Oncologia Molecolare, Facoltà di Scienze della Vita, Ecole Polytechnique Fédérale de Losanna per l'assistenza tecnica e R. Clarke dell'Università di Manchester per i commenti critici. La ricerca che ha portato a questi risultati ha ricevuto il sostegno di SNF3100A0-112090, Oncosuisse 531.817, e l'iniziativa sui medicinali innovativi impresa comune nell'ambito dell'accordo di concessione n. 115.188, le risorse di cui si compone del contributo finanziario dal Settimo Programma Quadro dell'Unione Europea (FP7 / 2007-2013) e la Federazione europea delle industrie e associazioni farmaceutiche aziende in contributi in natura. L'indirizzo web di medicinali innovativi è http://www.imi.europa.eu/ . </ P>
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Microlitre Centrifuge | Heraeus Biofuge Fresco | 75005521 | |
Centrifuge 5810R | Eppendorf | 5810 000.327 | |
Cryobox | Nalgene | 5100-0001 | |
Controlled Rate Freezer EF600 Grant | Asymptote | EF600 | |
CO2 incubator | Hera Cell Heraeus | 51022391 | |
Roller Mixer SRT9D | Sturt | SRT9D | |
Histology Cassettes | Medizintechnik | 81-0021-00 | |
Cell Strainer | Falcon | 352340 | |
Strile Surgical Blade | Aesculap | BB536 | |
Scalpel | Aesculap | BB084R | |
Forceps | Aesculap | BD047R | |
Scissors | Aesculap | BC374R | |
Paraffin base mold | SAKURA | 4166 | |
Optimal Cutting Temperature (OCT) Cryomatrix | Thermoscientific | 6769006 | Fetal Bovine Serum |
Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15070-063 | |
Antibiotic/Antimycotic | Life Technologies | 15240-062 | |
DMEM F/12 | Life Technologies | 11039-021 | Prewarm (37°C) |
Collagenase | Roche | 11 088 793 001 | Prewarm (37°C) |
Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10270 | Can be replaced with Fetal Calf Serum |
Cell Blood Lysis Buffer | Sigma | R7757 | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
Trypsin-EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
Formaldehyde | Sigma | F1635 | |
Paraformaldehyde | Roth | 335 | |
Isopentane | Sigma | M32631 | |
Ethanol | Merck | 1009831000 | |
Cryogenic vials (5.0ml) | VWR, International | 479-0820 | |
Ultra low attachment culture dish | Corning, NY 14831 | 3471 |