Bir<em> Ex vivo</em> Model İnsan Meme Hormon Eylem Eğitim için
Summary
Biz insan meme hormon eylem incelemek için yeni bir ex vivo modeli geliştirdik. Bu doku mimarisi, hücreler arası etkileşimleri ve parakrin sinyal korumak cerrahi göğüs doku numunesinin izole doku mikro dayanmaktadır.
Abstract
İnsan meme hormon eylem çalışması yeterli model sistemler eksikliği engel olmuştur. İn vitro kültüre, primer meme epitelyum hücreleri hormon reseptörü ifade kaybetme eğilimindedir. Yaygın olarak kullanılan hormon reseptörü pozitif meme kanseri hücre kuşakları in vivo duruma uygunluğu sınırlıdır. Burada, insan meme hormon etkisini incelemek için bir eks vivo modeli açıklar. Böyle azaltma tekniği mevcut ameliyat teknikleri veya mammectomies gibi cerrahi ıskarta malzeme Taze insan meme doku örnekleri mekanik ve enzimatik kanalları ve lobülleri ve çoklu stromal hücre tipleri içeren doku parçaları elde etmek için sindirilir. Büyüme faktörleri olmaksızın bazal ortamda tutulur Bu doku mikro bunların hücreler arası temas doku normal yapı, ve birkaç gün boyunca duyarlı hormon kalır. Bu maddeler hali hazırda, RNA ve protein çıkarma, histolojik analiz için işleme veya orta dondurma saklanır. Floresanaktif hücre ayrıştırma (FACS) belirli bir hücre popülasyonlarının zenginleştirilmesi için de kullanılabilir. Bu protokol son derece karmaşık, çeşitli insan örnekleri ile öteleme çalışmalar için basit, standart bir yaklaşım sağlar.
Introduction
Meme kanserinde mutasyon manzara hakkında bilgiler hızla artmaktadır. Daha az dikkat meme kanseri gelişimini etkileyen sistemik faktörler ödenmiştir. Üreme hormonları maruz kalma hastalığın ilerlemesine 1-3 üzerinde büyük bir etkisi vardır. Ancak, üreme hormonları, insan meme çarpmadan hangi mekanizmalar tam olarak anlaşılamamıştır. Genetiği fare modelleri ile çalışmak onlar birkaç mansap efektörlerinin 4 ile hücre içsel ve parakrin sinyal içerdiğini ortaya koymuştur.
İnsan meme hormon eylem hakkında sınırlı bilgi yeterli modellerin eksikliği büyük ölçüde kaynaklanmaktadır. Östrojen reseptörü (ER), progesteron reseptörü (PR), sinyal mekanizmaları ilişkin pek çok çalışma, MCF-7 ve T47D hormon reseptör pozitif göğüs kanseri hücre çizgileri ile gerçekleştirilmiştir. Bunlar alrea vardı ilerlemiş meme kanserli hastaların plevral efüzyon elde edildidy birden tedavileri 5 aldı. İnsan meme gibi basit laboratuar çalışmalarındaki modellerde bulgular biyolojik önemi, bu in vitro modellerde tespit şüpheli ve hedef genleridir olan hayvan modellerinde 6'da tanımlanan hedef genlerin farklıdır. Birincil insan meme epitel hücreleri, in vitro olarak kültürlenir onlar hormon reseptör ekspresyonu ve bu nedenle hormon yanıt 7,8 kaybetmek eğilimindedir. Bu sorun, Matrigel kullanarak karmaşık 3D yaklaşımlarla circumventd edilebilir. Bu şekilde, C. Clarke ve arkadaşları, hormon reseptörü ifade muhafaza ve projesteron uyarması 9 bir çoğalma tepkisi gösterdi göğüs epitelyal hücrelerinin kurulma başarmıştır. Bununla birlikte, in vivo progesteron reseptörü hedef genlerin önemli iki Wnt-4 ve RANKL bu sistem 9 progesteron stimülasyonu üzerine azalmadı. Bu yaklaşım, son olarak nitro ile daha fazla alınmıştır </em> hormon öncesi ve RANKL'ın indüksiyon 10 sağlandı. Bir uyarı, matrigel toplu bağımlı faaliyetleri vardır kalır pahalı ve sadece küçük hücre sayıları için apt bir deneysel tasarım gerektirir.
In vivo ER ve PR sinyalizasyon büyük ölçüde parakrin etkileşimleri 11 aracılık bulgusuna dayanarak, biz hücrelerarası etkileşimleri muhafaza edilmesi gerektiğini savundu. Dokular olarak kaybolur bir başka önemli faktör, in vitro kültür için tek bir hücre için hücre dışı matriks ile epitelyal hücrelerinin etkileşimlerdir ayrışmış edilir; ancak bu epitel farklılaşması için çok önemli olan ve bozulma tümör oluşumu 12 önemlidir. Bu düşünceyle, biz taze cerrahi ıskarta malzeme 13 meme dokusu mikro izole etmek için bir yöntem kurdu. İç luminal ve dış myoepitheli sahip bir iki tabakalı epitelyum oluşan meme parankimi,ark hücreleri, adipoz dokudan kesilmiş, mekanik ve enzimatik ayrışma tabi tutulur. Yıkama ve santrifüj sonra, süt kanallarının parçaları birçok stromal hücreler ile yakın ilişkileri korumak olduğunu elde edilir. Bu doku mikro duyarlı hormon kalır. Model klinik örneklerden 13 valide edildi. Bu haliyle, bu işlem, bir biyolojik ve klinik olarak anlamlı bir bağlamda meme hormon etkisini incelemek için yardımcı olabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada anlatılan ex vivo kültür normalde insan kadın meme bulunan diğer hücre tipleri ile birlikte sağlam kanalları ve lobülleri içeren meme dokusu mikro sağlar. Genellikle azaltma tekniği mevcut ameliyat teknikleri elde edilen insan göğüs dokusunun işlenmesi sırasında, yağ dokusu, stromal matrisin mekanik ve enzimatik sindirme ve kırmızı kan hücrelerinin lizizine çıkarılması süt kanalı parçaları ve terminal duktal lobüler birimleri zenginleştirir. Sağ süresince doğru konsant…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar mamoplasti fotoğrafı sağlamak için Lozan Üniversitesi Hastanesi M. Fişini teşekkür, M. Wirth ve Deneysel Kanser Araştırma Enstitüsü İsviçre, Araştırma Moleküler Onkoloji Yeterlilik Ulusal Merkezi, Yaşam Bilimleri Okulu, Ecole Polytechnique Fédérale de A. Ayyanan eleştirel yorumlar için Manchester Üniversitesi teknik yardım için Lozan ve R. Clarke. Bu sonuçlara önde gelen araştırma herhangi bir hibe anlaşması kapsamında SNF3100A0-112090, Oncosuisse 531.817 ve Yenilikçi İlaçlar Girişimi Ortak Taahhüt destek aldı. Avrupa Birliği'nin Yedinci Çerçeve Programı (FP7 / 2007-2013) ve tür katkı İlaç Sanayi ve Dernekleri şirketlerin 'Avrupa Federasyonu mali katkısı oluşan kaynaklar olan 115.188. Yenilikçi İlaçlar Girişimi Web adresi http://www.imi.europa.eu/ . </ P>
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Microlitre Centrifuge | Heraeus Biofuge Fresco | 75005521 | |
| Centrifuge 5810R | Eppendorf | 5810 000.327 | |
| Cryobox | Nalgene | 5100-0001 | |
| Controlled Rate Freezer EF600 Grant | Asymptote | EF600 | |
| CO2 incubator | Hera Cell Heraeus | 51022391 | |
| Roller Mixer SRT9D | Sturt | SRT9D | |
| Histology Cassettes | Medizintechnik | 81-0021-00 | |
| Cell Strainer | Falcon | 352340 | |
| Strile Surgical Blade | Aesculap | BB536 | |
| Scalpel | Aesculap | BB084R | |
| Forceps | Aesculap | BD047R | |
| Scissors | Aesculap | BC374R | |
| Paraffin base mold | SAKURA | 4166 | |
| Optimal Cutting Temperature (OCT) Cryomatrix | Thermoscientific | 6769006 | Fetal Bovine Serum |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15070-063 | |
| Antibiotic/Antimycotic | Life Technologies | 15240-062 | |
| DMEM F/12 | Life Technologies | 11039-021 | Prewarm (37°C) |
| Collagenase | Roche | 11 088 793 001 | Prewarm (37°C) |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10270 | Can be replaced with Fetal Calf Serum |
| Cell Blood Lysis Buffer | Sigma | R7757 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
| Formaldehyde | Sigma | F1635 | |
| Paraformaldehyde | Roth | 335 | |
| Isopentane | Sigma | M32631 | |
| Ethanol | Merck | 1009831000 | |
| Cryogenic vials (5.0ml) | VWR, International | 479-0820 | |
| Ultra low attachment culture dish | Corning, NY 14831 | 3471 |
References
- Beral, V. Breast cancer and hormone-replacement therapy in the Million Women Study. Lancet. 362 (9382), 419-427 (2003).
- MacMahon, B., et al. Age at first birth and breast cancer risk. Bull World Health Organ. 43 (2), 209-221 (1970).
- Pike, M. C., Krailo, M. D., Henderson, B. E., Casagrande, J. T., Hoel, D. G. ‘Hormonal’ risk factors, ‘breast tissue age’ and the age-incidence of breast cancer. Nature. 303 (5920), 767-770 (1983).
- Brisken, C., O’Malley, B. Hormone action in the mammary gland. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (12), a003178 (2011).
- Levenson, A. S., Jordan, V. C. MCF-7: the first hormone-responsive breast cancer cell line. Cancer Res. 57 (15), 3071-3078 (1997).
- Tanos, T., Rojo, L. J., Echeverria, P., Brisken, C. ER and PR signaling nodes during mammary gland development. Breast Cancer Res. 14 (4), 210 (2012).
- Roskelley, C., Desprez, P., Bissell, M. Extracellular matrix-dependent tissue-specific gene expression in mammary epithelial cells requires both physical and biochemical signal transduction. Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (26), 12378-12382 (1994).
- Kass, L., Erler, J. T., Dembo, M., Weaver, V. M. Mammary epithelial cell: influence of extracellular matrix composition and organization during development and tumorigenesis. Int J Biochem Cell Biol. 39 (11), 1987-1994 (2007).
- Graham, J. D., et al. DNA replication licensing and progenitor numbers are increased by progesterone in normal human breast. Endocrinology. 150 (7), 3318-3326 (2009).
- Wang, J., et al. Comment on "Progesterone/RANKL is a major regulatory axis in the human breast". Sci Transl Med. 5 (215), 215le214 (2013).
- Brisken, C. Progesterone signalling in breast cancer: a neglected hormone coming into the limelight. Nat Rev Cancer. 13 (6), 385-396 (2013).
- Xu, R., Boudreau, A., Bissell, M. J. Tissue architecture and function: dynamic reciprocity via extra- and intra-cellular matrices. Cancer Metastasis Rev. 28 (1-2), 167-176 (2009).
- Tanos, T., et al. Progesterone/RANKL is a major regulatory axis in the human breast. Sci Transl Med. 5 (182), 182ra155 (2013).
- Yalcin-Ozuysal, O., et al. Antagonistic roles of Notch and p63 in controlling mammary epithelial cell fate. Cell Death Differ. 17 (10), 1600-1610 (2010).
- Hines, W. C., Su, Y., Kuhn, I., Polyak, K., Bissell, M. J. Sorting out the FACS: a devil in the details. Cell Rep. 6 (5), 779-781 (2014).
