Abstract
REPLACE является уникальная стратегия разработана для более эффективного целевого белок-белковых взаимодействий (ИЦП). Она направлена на расширение доступной целевой препарат пространство, обеспечивая улучшенное методологию для идентификации ингибиторов для таких сайтов связывания и которые представляют большинство потенциальных мишеней для лекарственных средств. Основная цель данной работы заключается в предоставлении методологической обзор использования и применения REPLACE стратегии, которая включает в себя вычислительные и синтетические подходы химии. REPLACE иллюстрируется с помощью его применения к развитию не ATP конкурентоспособной циклинзависимых киназ (CDK) ингибиторов в качестве противоопухолевых терапии. CDKs часто дерегулирование рака и, следовательно, рассматриваются как важные цели для разработки лекарств. Ингибирование CDK2 / циклин А в S фазе, как сообщалось, способствуют селективной апоптоз раковых клеток в р53 независимым образом через E2F1 пути. Ориентация белок-белкового взаимодействия в циклин bindinг паз (ЦБС) является подход, который позволит специфическое ингибирование клеточного цикла в течение транскрипционных CDKs. ЦБС признан консенсусной последовательности, полученной из CDK субстратов и супрессоров опухоли белка называется циклин связывающий мотив (CBM). Сообщение Cell Broadcast ранее была оптимизирована с октапептидом от p21Waf (HAKRRIF), а затем дополнительно усекается до пентапептида сохраняя достаточную активность (RRLIF). Пептиды в общем не клетки проницаемыми, метаболически нестабильны и поэтому REPLACE (замена с частичным лиганда Альтернативы через Вычислительная обогащение) стратегии был применен для того, чтобы генерировать более ингибиторов наркотиков, как. Стратегия начинается с разработки фрагмента лигировали тормозных пептидов (переворачивает), которые селективно ингибируют клеточного цикла CDK / циклин комплексы. Переворачивает были получены путем итеративного замены остатков HAKRRLIF / RRLIF с фрагментом, как малых молекул (укупорки группы), начиная с N-конца (НКПД), с последующей заменой наС-конец. Эти соединения представляют собой отправную точку для генерации без АТФ конкурентных ингибиторов CDK в качестве противоопухолевых терапии.
Introduction
В этой статье, на примере применения Replace (Замена с частичным использованием лигандов альтернатив вычислительную обогащение) стратегию, чтобы преобразовать пептидные ингибиторы белок-белковых взаимодействий в более фармацевтически соответствующих молекул описывается 1-3. В то время как ИПП представляют собой богатый источник, но недоиспользуются потенциальных мишеней для лекарственных средств, существующие методологии в значительной степени недостаточно, чтобы сделать эти широко доступны. Современные стратегии в том числе на основе фрагмента конструкция 4, высокопроизводительного скрининга 5 и скрепленных пептидов 6 предоставили авансы, однако они во многих случаях неэффективной. В результате, больше прогресса и более эффективные подходы. ЗАМЕНЫ была полностью подтверждена в развитии ингибиторов киназ, которые обладают улучшенными свойствами с наркотиками, как и у потенциал для дальнейшего развития в качестве противоопухолевых терапевтических. Эта стратегия проиллюстрировано в развитии не-АТФ ингибиторов клеткицикл CDKs и включает в себя следующее: 1) получение 3D структурную информацию о взаимодействиях HAKRRLIF / RRLIF с циклин связывания паз; 2) определение важных обязательных определителей для пептида взаимодействия; 3) усечение пептидов N-конца, содержащего один или более св зывани; 4) вычислительная идентификации потенциальных малых молекул альтернатив (частичные лиганд альтернативы, Plas) для усеченного части пептида и которые сохраняют основные взаимодействия исходного пептида; 5) синтез или коммерческой источников пла предсказал связать с жадностью к югу сайте ранее занимаемой удалены пептида остатка (ов); 6) синтез просматривает лигирования лучших лить с укороченным твердофазного синтеза пептидов с использованием; 7) проверка переворачивает в лабораторной связывания или функциональном анализе (поляризация флуоресценции в контексте / циклин CDK) с последующим дальнейшей характеристики в жизнеспособности клеток анализом. Схематическое представление ЗАМЕНИТЬ STRATEGу показано на рисунке 1. В этой статье итераций REPLACE стратегии обсуждаются и приложение к CDK2 / циклин А описан подробно. CDKs, как полагают, прямо или косвенно отменено в большинстве опухолей и, следовательно, считаются подходящими рака лекарственных препаратов 7. CDKs требует объединения с циклинов для полной активации, а затем фосфорилировать ключевых белков, участвующих в регуляции клеточного цикла 8. Две основные группы CDKs являются изотипы, которые контролируют контрольных точек клеточного цикла [G1 / S (CDK4 / циклин D, CDK6 / циклин D и CDK4 / циклин Е), S фаза (CDK2 / циклин А) и G2 / M (CDK1 / циклин В)] и регуляторы РНК-полимеразы посредством фосфорилирования (CDK7 / циклин Н, CDK8 / циклин C, CDK9 / циклин Т). Ключевой стадией в фазе прогрессирования S возникает, когда коэффициент E2F1 транскрипции образует комплекс с белком DP, который затем связывается с ДНК и инициирует транскрипцию гена. CDK2 / циклин А необходим для нейтрализации E2F1 транскрипциидеятельность посредством фосфорилирования что приводит к высвобождению комплекса E2F1-DP и его последующей деградации. Ингибирование CDK2 / циклин А, как полагают, поддерживать E2F1 в его ДНК связанное состояние приводит к постоянной активации. Полученный уровень E2F-1 активности превысит порога, необходимого, чтобы вызвать апоптоз p53 независимого поэтому предлагая терапевтическую стратегию. Благодаря дерегулированном p53 и PRB путей, высокие уровни E2F-1 часто встречаются в раковых клетках и ингибирование CDK2 / циклин А должно приводить к селективной апоптоза в опухолях и может рассматриваться в качестве утвержденного цели рака 7.
Клинически исследованные ингибиторы CDK целевой высоко консервативными ATP сайт связывания, ведущий к перекрестной реактивности среди протеинкиназ больше, чем 500 в человеческом kinome и потенциально порождая побочные эффекты и токсичность 9. Альтернативный подход не является АТФ конкурентное ингибирование путем охвата вербовки субстрата через ЦБСприсутствует на циклин положительной регуляторной субъединицы и который, следовательно, различны и далеки от АТФ сайт связывания 10,11. ЦБС в основном гидрофобный канавки присутствуют в циклин A, циклин D и циклин Е, и было показано, чтобы распознать консенсусную последовательность найти в субстратах и опухолевых супрессоров. В качестве выделенного пептида, циклин-связывающий мотив (СВМ) связывается с ЦБС и было показано, ингибируют активность киназы из CDKs клеточного цикла. Сообщение Cell Broadcast была оптимизирована с октапептидом (HAKRRLIF, CDK2 / циклин A IC 50 0,07 ± 0,02 мкМ, CDK4 / циклин D, IC 50 0,88 ± 0,34 мкм) и, кроме того, усеченная на пентапептида, представляющей собой хороший компромисс между молекулярной массой для лекарственной Сходство и потенция (RRLIF, CDK2 / циклин IC 50 1,01 ± 0,17 мкМ, CDK4 / циклин D, IC 50 ± 2,97 25,12 мкм) 12,13. В CBGs состоят из большого начального и среднего меньшего гидрофобного кармана, которые мостовом помощью ACIDIС-область (включает Glu220, Glu224 и Asp283). Ключевые связывания детерминанты включают HAKRRLIF взаимодействие Ala2 с вторичным гидрофобным карманных, ионных пар и водородных связей Lys3, Arg 4 и Arg5 с кислой области и высокой степенью комплементарности Leu6 и Phe8 с первичным липофильного сайта. Кроме того, многочисленные водородные связи вклад от позвоночника, а пептида Ile7 действует как разделительный остатка, позволяя оптимальный контакт с первичной кармане. Связывание режим и взаимодействия с HAKRRLIF ЦБС показано на рисунке 2.
Ориентация белок-белкового взаимодействия МУП / ЦБС будет препятствовать активность киназы CDK2 / циклин А, CDK2 / циклин E & CDK4 / циклин D, и это должно вызвать E2F1 опосредованного апоптоза раковых клеток, не затрагивая нормальные клетки 7. Несмотря на то, МД Пептиды являются эффективными ингибиторами клеточного цикла CDKs, то маловероятно, что они будут полезны в качестве лекарственных средств из-за их метаболическойнестабильность и общее отсутствие клеточной проницаемости. Для этого, мы применили Заменить стратегию для того, чтобы превратить эти мощные ингибиторы пептидные в более наркотиков, как соединений для дальнейшего развития противоопухолевых терапевтических эксплуататорских дерегулированный E2F1 через CDK2 / циклин A торможение. Следующий протокол обобщает работу, которая была завершена в применении заменит циклин канавки. В первую очередь, были определены наркотиков, как покрывать группы замены для N-концевого тетрапептида HAKRRLIF. Кроме того улучшения в этих группах были исследованы в качестве дополнительного исследования для проверки ЗАМЕНИТЬ. Представитель результаты этих исследований также представлены.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Вычислительная идентификации потенциальных маленькая молекула укупорки групп
Примечание: В принципе, разнообразие док или фармакофорным методов поиска могут быть использованы для прогнозирования потенциальных групп укупорки. Основная цель исследований в вычислительной ЗАМЕНЫ заключается в определении малых молекул, которые сохраняют особенности и взаимодействие аминокислот, которые замещены.
- Подтверждение LigandFit док протокола 14
Примечание: В предыдущих исследованиях, метод стыковки (LigandFit 15, модуль в молекулярной люкс программы моделирования, обнаружения Studio 3.0) был проверен, чтобы обеспечить, что этот алгоритм достаточно воспроизвести обязательные режимы известного НКПД и показать, что результаты, полученные для неизвестные соединения прогностическая 14.
- Используя следующие шаги (1,2 - 1,5), определить оптимальные параметры для LigandFit следующим образом: PLP1 ангии сетки для генерации позе, минимизации генерируемых позах и функции выигрыша PLP1 для анализа позах.
- Для того чтобы ограничить конформации, полученные и позиционировать лигандов соответственно для формирования ковалентной связи в ограничен пептида, установить азота индола и амида азота атомы Trp217 и Gln254 соответственно в качестве фильтров для взаимодействия водородных связей.
- Дизайн и док библиотеки альтернатив фрагментов в CDK2 / циклин A рецептор (2UUE). Приоритеты потенциальные группы укупорки для синтеза и коммерческой источников на основе скоринга, PLP1 взаимодействий с фильтрами взаимодействия и взаимодополняемости с ЦБС. Различные этапы, необходимые для стыковки LigandFit в следующем.
- Подготовка связывания рецептора сайте 14
- Импортировать CdK2 / циклин A кристаллическую структуру (PDB ID: 2UUE) в окне визуализации в программном обеспечении. Эта структура содержит ранее идентифицированную FLIP 5-метил-1-фенил-1Н-1, 2,4-триазол-3-карбоксамидо (3,5-DCPT) RLIF связан с циклин паз (фиг.3).
- Удалить или оставить на месте остатки RLIF (С-концевой). Когда пептидная последовательность сохраняется, использовать N-концевой аминогруппы пептида в качестве фильтра взаимодействия лиганда. Из "рецептор-лиганд" инструментов, создать сферу вокруг N-крышкой 3,5-DCPT из передачи сфере / Скрыть сайта. Сфера создается для определения активной области в сайте связывания, где лиганд-рецепторных взаимодействий разрешено произойти во время связывания.
- Определите сайт связывания дальше от "найти сайт, как объем выбранного лиганда" и удалить лиганда 3,5-DCPT от белка. Провести этот шаг, чтобы определить объем связывания в сфере создания.
- Установите индола азота и азота амидной атомов остатков Trp217 и Gln254 как фильтры для взаимодействия водородных связей. Установите фильтры взаимодействия, так что только те позы, которые InTeRACT с атомами набор остатков будут фильтроваться в процессе стыковки, поэтому, сохраняя важные взаимодействия в состыкованных позах.
- Подготовка лигандов 14
- Дизайн библиотеку 100 потенциальных групп укупорки на основе критериев, включающих молекулярной массой менее 500, наличием карбоксильной группой для лигирования с укороченной пептида и включения соответствующих гидрофобных групп (замещенную фенильную группу) для ван-дер-ваальсовых взаимодействия на вторичном кармане как показано в таблице 1.
- Выбор гетероциклические кольца для имитации пептид водородных связей взаимодействия с Trp217 и заместителей включены для замены ионов сопряжения взаимодействия основными боковыми цепями HAKRRLIF. Закрепление лиганды в виде соответствующих молекул альдегида, так что карбонильный кислород может взаимодействовать с атомом азота амидной Gln254 аналогичной пептидного остова в исходного пептида (таблица 1).
- До документЦарь, свести к минимуму, предназначенные лигандов к низкой энергией конформации и подготовить в соответствующем состоянии ионизации с помощью «подготовить лиганды" протокол. Нарисуйте и экспортировать эти потенциальные N шапки в формате SDF-файла в ChemDraw для таблицы до того, как импортировать в программу.
Примечание: Подготовка протокола лигандов используется, чтобы минимизировать все лиганды быть пристыкован к их нижних энергетических состояний и сборы ионизации были применены к действующим атомов. Параметры по умолчанию используются для этого шага.
- Стыковка лигандов в циклин паз 14
- Выбрать процедуру LigandFit от рецептор-лиганд протокола взаимодействия множества программного обеспечения. Используйте рецептор и подготовленные лигандов в качестве входных для этого протокола.
- Для этих опытах выберите PLP1 как энергосистемы, указать, что ставит быть сведены к минимуму энергии и что число генерируемых позах как 10. Оставьте все остальные параметры на значения по умолчанию.
Примечание: LigandFit являетсяспособ стыковки, которые могут идентифицировать и генерировать позы высокой комплементарности и потенциальной близости с активным сайтом белка с использованием формы на основе сравнения фильтр, который в сочетании с методом Монте-Карло алгоритма конформационные поиска. Сетка энергия, используемая в программе док является силовое поле для формирования лиганд-рецепторных взаимодействий и потенциальных позы. PLP1 кусочно линейный потенциал, который специально приоритеты водородных связей взаимодействия и где ПФУ тип атома назначается каждому неводородным атома лиганда или рецептора атома без водорода.
- Анализ результатов
- В первую очередь, показатель представляет в программе визуализатора, а затем Сортировка по убыванию значения счетом PLP1. Используйте забил функции, такие как PLP1 оценить аффинность связывания лиганда пристыкованного на основе кандидата лиганда представляют геометрию и нековалентную взаимодействие с целевой структуре рецептора.
Примечание: Здесь функция PLP1 скоринг было обнаружено гив лучшие результаты, так как включает оценку водородной связи. - Анализ визуально верхнюю 25% набранных позах для 1) наложимости с известным покрывая группы (имеющей СКО относительной средний квадрат отклонения () значение менее 2 а), 2) выполнены фильтры взаимодействия и 3) визуальный взаимодополняемости с циклин паз , Это принято в том, что правильно установлена представляют (по сравнению с экспериментальной структуры) имеет значение СКО <2 Å.
- Изучите позы для визуального взаимодополняемости, которая определяется как имеющий эффективное заполнение связывающего кармана таким образом, что согласуется с известными отношений структура-активность. Взаимодействие фильтры установлены в включают атом ограничений, которые требуют межмолекулярных контактов известные является критическим для связывания и / или требуются в положение потенциального покрывая группу в правильной геометрии для образования амидной связи. Три примера состыкованных позах потенциальных N-укупорки групп, делающих водородные связи с interactioп фильтры показано на рисунке 4.
- В первую очередь, показатель представляет в программе визуализатора, а затем Сортировка по убыванию значения счетом PLP1. Используйте забил функции, такие как PLP1 оценить аффинность связывания лиганда пристыкованного на основе кандидата лиганда представляют геометрию и нековалентную взаимодействие с целевой структуре рецептора.
2. Синтез и характеристика потенциальных N -capping групп
- Синтез N-укупорки групп.
- Для синтеза, использовать все коммерческие исходных материалов, растворителей и реагентов, полученного. Обобщить потенциальных N-укупорки группы обычным органической химии синтетических (рисунок 5 12,13 для примера).
- Выполнение тонкослойной хроматографии (ТСХ) на силикагеле для реакции мониторинг.
- Растворять исходные материалы и реакционную смесь (1 мг) в подвижной фазе, и определить их на ТСХ пластине с помощью капиллярных трубок.
- Поместите пластины тонкослойной хроматограммы, чтобы в камере, содержащей подвижную фазу (смесь этилацетата и гексана в соотношении 35:65). После того, как подвижная фаза достигает 90% ТСХ пластине, удалить и просушить на воздухе пластины.
- Использование ультрафиолетового света для обнаружения исходного материала и реакционных смесей, как видимых пятен. Кэлculate в R F всех точках (отношение расстояния, пройденного месте и подвижной фазы).
Примечание: Реакци завершена, когда нет пятна видно на R F исходного материала.
- После завершения реакции обработки реакционную смесь, поместив в делительную воронку и промывают водным кислоты или раствором основания в случае необходимости. Собирают органический растворитель выпаривают его в роторном испарителе и сушат полученный сырой продукт в вакууме.
- Растворить 500 мг сырого продукта в 3-5 мл подходящем растворителе и добавить к 1 г силикагеля или RP18 samplet и сухой атмосфере воздуха. Поместите samplet, содержащий неочищенный продукт в кремнезема / РП SNAP флэш картриджей и очистить сырой материал, используя автоматизированную высокую производительность флэш-хроматографии (в соответствии с протоколом производителя) с использованием в г колонку SNAP 100 с градиентом перспективе, начиная с 6% этилацетата: 94 % гексана 50% этилацетата и 50% гексанов в течение15 объемов колонки.
- Сушат очищенного продукта, собранной в растворителе из флэш-хроматографии с использованием роторного испарителя путем выпаривания весь растворитель досуха и дополнительной сушки продукта под вакуумом, чтобы удалить все остаточные растворители. Выполнение характеристику очищенного продукта с помощью ЯМР, МС и аналитической ВЭЖХ.
- Для 1Н ЯМР и 13С ЯМР, вес примерно 10 мг очищенного образца, растворить его в соответствующем дейтерированном растворителе, и передавать содержимое в сухом трубки ЯМР для записи спектров ЯМР 2,14.
- Запишите H ЯМР 1 и 13 С ЯМР спектры с высокой поле ЯМР-спектрометра (минимум 300 МГц). Приобретать масс-спектры, используя QTOF (Tandem-четверка 1 раз массового полета спектрометра), ионизации электрораспылением (ESI) или VG 70S (двойной фокусировкой масс-спектрометра с магнитным сектором, EI) 2,14.
- Анализ чистоты продуктов с помощью ВЭЖХ с диодно-матричным детектором и оснащенысодержание C18 (2) 100 А, 250 х 4,6 мм, 5 мкм колонка для анализа. Использовать градиент перспективе, начиная с 100% воды (0,1% трифторуксусной кислоты) до 60% ацетонитрила (0,1% трифторуксусной кислоты) в течение 30 мин и удерживать градиент в течение 4 мин. Извлеките хроматограммы при 226 нм и 254 2,14.
Примечание: Аналитические чистота оцененных соединений были> 95%.
3. Твердофазный синтез для генерации переворачивает 2
- Синтез N-ограничен переворачивает
- Соберите N-увенчанные пептидные соединения через стандартные методы синтеза в твердой фазе, используя следующие шаги.
- Активация 5 эквивалентов С-концевой аминокислоты (Fmoc-Phe) в 4,4 эквивалентов O -Benzotriazole- N, N, N ', N' тетраметил-урониевых-гексафтор-фосфат (HBTU, 221,93 мг) в 2 мл ДМФ в течение 5 мин. Загрузите HBTU смесь Fmoc-Phe на смолу Rink с использованием 6 эквивалентов диизопропилэтиламина (DIPEA, 103.13мг) в течение 1 ч при комнатной температуре.
- Удаления защитной группы Fmoc с C-концевого остатка с использованием 20% пиперидина в 3 мл ДМФА в течение 10 мин. Пара последующие аминокислоты (например, Fmoc-Ile, Leu Fmoc-, Fmoc-Arg-ПМК), шаг за шагом. На каждом этапе, пара 5 экв следующего аминокислоты с использованием 6 эквивалентов ДИПЭА (103,13 мг) и 4,4 эквивалентами HBTU (221,93 мг) в 2 мл ДМФА в течение 1 ч при комнатной температуре.
- Применение циклов стирки (5 х 10 мл ДМФ + 5 х 10 мл ДХМ), после связывания аминокислоты и Fmoc удаления защитных групп, описанных выше шагов. После сборки пептидной, пара N-укупорки групп с использованием 6 эквивалентов ДИПЭА (103,13 мг) и 4,4 эквивалентами HBTU (221,93 мг) в 2 мл ДМФА в течение 1 ч при комнатной температуре.
- По завершении сборки пептидной, лечения реакционной смеси с 2 мл смеси расщепления (90: 5: 5 ТФК / Н 2 О / TIPS) O / N, чтобы удалить защитные группы боковой цепи, и расщепляют переворачивает из смолы. Растирают полученного продукта с холодным диэтиловым эфиром, чтобы осадить и яF необходимо концентрат на роторном испарителе.
- Соберите N-увенчанные пептидные соединения через стандартные методы синтеза в твердой фазе, используя следующие шаги.
- Синтез N-ограничен-С вершины переворачивает
- Взвесить и растворяют N-терминальной закрывали и защищенный Arg-Leu пептид (16,1 мг, 0,02 ммоль) в дихлорметане, и добавляют [4- (3-хлорфенокси) пиридин-2-ил] метанамин (С-CAP) наряду с O - benzotriazole- N, N, N ', N' -tetramethyluronium гексафторфосфат (HBTU; 16,7 мг, 0,02 ммоль) и N, N-диизопропилэтиламин (DIPEA; 6,5 мг, 0,02 ммоль).
- Перемешать и контролировать реакцию при комнатной температуре, пока ТСХ / ВЭЖХ не покажет полное исчезновение исходного материала. После завершения реакции, концентрируют сырой реакционной смеси с помощью роторного испарителя, а затем раздел ли между этилацетатом и водой.
- Отделением водного и органического слоя; мыть органический слой 1н NaOH, 1 N HCl и насыщенным раствором соли. Сушат органический слой приблизительно 1 г сульфата натрия и концентрируют продукт в роторном испарителе. ФинаLLY лечить продукта O / N с смеси расщепления (95: 2,5: 2,5 трифторуксусной кислоты / H 2 O / СОВЕТЫ) для снятия защиты.
- Растирают полученного продукта с помощью холодного диэтилового эфира, при необходимости концентрат в роторном испарителе до полной сухости, чтобы удалить весь растворитель. Кроме сушки продукта под вакуумом, чтобы удалить все остаточные растворители.
- Очистка и характеристика переворачивает
- Очищают сырой переворачивает с помощью полуприцепов подготовительные методы ВЭЖХ с обращенной фазой. Лиофилизировать очищенные сальто и характеризуют их молекулярную массу с помощью масс-спектрометрии 2,14.
- Определить аналитическую чистоту переворачивает с помощью ВЭЖХ с диодно-матричным детектором и оснащен C18 (2) 100 А, 250 х 4,6 мм, 5 мкм колонка. Использование метода градиента, начиная с 95% Н 2 О (0,1% трифторуксусной кислоты) / 5% ацетонитрила (0,1% трифторуксусной кислоты) до 35% Н 2 О (0,1% трифторуксусной кислоты) / 65% ацетонитрила (0,1% trifluoroaceкрестики кислоты) в течение 30 мин и удерживайте градиент в течение 4 мин. Экстракт хроматограмм при 226 и 254 нм.
4. Поляризация флуоресценции Анализ связывания для определения конкурентного связывания 2,14
- Выполните анализ в черном 384-колодца (138 мкл) с использованием пластин следующую процедуру.
- Развести образцы, трассирующие пептиды (4 нм), киназы комплексов (CDK2 / циклин А - 18 мкг / мл, CDK4 / циклин D - 37 мкг / мл) до требуемой концентрации в буфере для анализа (25 мМ HEPES рН 7, 10 мМ NaCl, 0,01% Нонидет Р-40, 1 мМ дитиотреитола (ДТТ).
- В каждую лунку в 384-луночный планшет, добавьте: 5 мкл CDK4D1 или CDK2CA (0,3 мкг / лунку очищенного рекомбинантного человеческого киназа), 5 мкл раствора соединения, 5 мкл 30 нМ меченого пептида (fluoresceinyl-AHX-Pro-Val -Lys-Arg-Arg-Leu-(3ClPhe) -Gly или fluoresceinyl-Ahx-Pro-Val-Lys-Arg-Leu-Arg-Phe-Gly-трассирующей пептид). Использование 5 мкл каждого ДМСО (6%), BuffeR, трассирующей и 5 мкл ДМСО (6%), киназа, Tracer в качестве контрольных лунках
- После добавления всех компонентов, центрифугировать планшет при 500 оборотов в минуту в течение 1 мин (41,16 х г) при комнатной температуре и затем инкубируйте при перемешивании в течение 45 мин при комнатной температуре. Использование устройства многомодового пластины и детектор, установленный с 485 нм / 535 нм / возбуждение фильтров выбросов и дихроичного зеркала читать флуоресцеина интенсивность каждую лунку в пластины.
- Рассчитать относительную среднюю поляризацию (КП) для всех исследованных образцах, используя уравнение показывает ниже. Определите IC 50 значений от логарифмической регрессии путем сопоставления относительных депутатов и тестирования концентрации.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Взаимодействия с HAKRRLIF циклин канавки показано на рисунке 2. Пептидные остатки, которые представляют основные обязательные детерминанты включают Ala2, arg4, Leu6 и Phe8 с другими остатки обеспечивая меньший вклад 12,13,18. В этом случае исследовании REPLACE стратегия была использована для того, чтобы найти фрагмент альтернативы для остатков в N-концевой тетрапептида HAKRRLIF, в первую очередь, имитирующие взаимодействий Ala2 и arg4. Библиотека потенциальных фрагментов NCAP (таблица 1) был построен на основе критериев. Каждая молекула был пристыкован в освободившееся сайта связывания созданного усечения N-укупорки группы от ее кристаллической структуры с циклин A (PDB ID: 2UUE). Были отобраны потенциальные альтернативы лиганд на основе анализа позы и PLP1 скоринга как предсказания сродства (примеры состыкованных позах показано на рисунке 4). Синтез подтвержденным NCAP (1- (3-хлорфенил) -5-метил-1Н-1,2,4-триазол-3-карбоновой кислоты) показана на рисунке 5, где эта молекула была сгенерирована в три этапа и очищают автоматизированной флэш-хроматографии (Дополнительное рисунок 1). 1-ЯМР, 13 C ЯМР, МС и ВЭЖХ характеристические данные репрезентативного соединения 1- (3-хлорфенил) -5-метил-1Н-1,2,4-триазол-3-карбоновой кислоты, показаны в дополнительных фиг.1-5 соответственно. Синтез N-крышками переворачивает и N-ограничен-С крышками переворачивает представлены на фиг.7 и 8, а данные по характеристике приведены в таблице 2. Связывание сродство как CDK2 / циклин А и CDK4 / циклин D определяли с использованием описанный ФП анализа, а результаты приведены в таблице 3. тестируемых соединений, содержащие триазола переворачивает на основе N-колпачки были определены иметь наибольшее сродство к CDK2 / циклин А и циклин / CDK4 D и типичного соединенияс тестировали в анализах, основанных клеток. В целом, молекулы FLIP выявленные были найдены, чтобы быть более наркотиков, как и сохранить большую часть взаимодействий октапептида HAKRRLIF. Capped тетрапептиды обладал более низкой эффективностью по сравнению с HAKRRLIF однако были сопоставимые деятельности в RRLIF пентапептида (таблицы 3 и 4). Эти результаты показывают, что соединения, полученные улучшилось подобие наркотиков, но это было получено за счет несколько скомпрометированных аффинностью связывания.
Антипролиферативная деятельность эти CGI лиганды оценивали и клеточные IC 50 лет ниже 30 мкм наблюдались в U2OS и DU145 клеточных линий рака.
Рисунок 1. Обзор REPLACE стратегии. Пожалуйста, кл Ик здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2. Связывание и взаимодействия HAKRRLIF в ЦБС Левая панель:. По образцу структура HAKRRLIF связан с ЦБС. Циклин паз состоит из двух гидрофобных карманов - большей первичной кармане (справа, занятых Leu6 и Phe8) и меньшим среднего кармана (слева, занятой Ala2) и которые мостовом кислыми остатками, изображенных на красный. Правая панель: Другие важные взаимодействия включают водородных связей контакты пептидной цепи (с Trp217, Gln254, Ile281), и ионно-парных взаимодействий трех основных остатков пептида (с Glu220, Glu224, Asp283). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенная версия этой фигуры.
441 / 52441fig3.jpg "/>
Рисунок 3. Связывание режим 3,5-DCPTRLIF в ЦБС. Связывание 3,5-DCPT-RLIF показано с водородных связей взаимодействий (изображен зеленый пунктирными линиями) с атомами боковой цепи Trp217 и Gln254. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть крупная версия этой фигуры.
Рисунок 4. Некоторые результаты док. Купированный позы 3 представительных N-укупорки групп приведены. Каждое из этих соединений сделать водородные связи с атомами фильтров взаимодействия Trp217 и Gln254 и, как показано зелеными пунктирными линиями. Фенильная заместитель делает ван дер Ваальса взаимодействия с вторичной гидрофобного кармана. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. 
Рисунок 5. Синтез 1- (3-хлорфенил) -5-метил-1Н-1,2,4-триазол-3-карбоновой кислоты. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуре.
Рисунок 6. Синтез N-крышками переворачивает синтеза твердой фазы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 7. Синтез N-окpped-С вершины сальто. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Таблица 1. Библиотека малых молекул стыковка и в результате предсказания энергии связи, используя функцию PLP1 забил.
| Пептид | Чистота | Колонка Размеры | Метод | Расход | ВЭЖХ время удерживания | Теоретическая МВт | Соблюдается МВт |
| 5843 | > 90% | 4.6 × 250 мм | 5-65% ацетонитрил / вода / 0,1% TFA | 1 мл / мин | 23,9 | 732 | 732,6 |
| 5773 | > 90% | 4.6 × 250 мм | 5-65% ацетонитрил / вода / 0,1% TFA | 1 мл / мин | 22,4 | 801,77 | 800,55 |
| 5774 | > 90% | 4.6 × 250 мм | 5-65% ацетонитрил / вода / 0,1% TFA | 1 мл / мин | 24.2 | 767,33 | 766,5 |
| 5762 | > 90% | 4.6 × 250 мм | 5-65% ацетонитрил / вода / 0,1% TFA | 1 мл / мин | 9.0 | 731,91 | 731,65 |
| 5763 | > 90% | 4.6 × 250 мм | 5-65% ацетонитрил / вода / 0,1% TFA | 1 мл / мин | 11.2 | 800,8 | 799,5 |
| 5764 | > 90% | 4.6 × 250 мм | 5-65% ацетонитрил / вода / 0,1% TFA | 1 мл / мин | 10.1 | 766,34 | 765,55 |
| 5771 | > 90% | 4.6 × 250 мм | 5-65% ацетонитрил / вода / 0,1% TFA | 1 мл / мин | 9.4 | 749,9 | 749,6 |
| 5765 | > 90% | 4.6 × 250 мм | 5-65% ацетонитрил / вода / 0,1% TFA | 1 мл / мин | 10.1 | 766,35 | 755,65 |
| 5766 | > 90% | 4.6 × 250 мм | 5-65% ацетонитрил / вода / 0,1% TFA | 1 мл / мин | 9.4 | 761,9 | 761,55 |
| 5767 | > 90% | 4.6 × 250 мм | 5-65% ацетонитрил / вода / 0,1% TFA | 1 мл / мин | 20.4 | 761,9 | 761,55 |
| 5776 | > 75% | 4.6 × 250 мм | 5-65% ацетонитрил / вода / 0,1% TFA | 1 мл / мин | 23.3 | 785,7 | 784,55 |
| 5775 | > 90% | 4.6 × 250 мм | 5-65% ацетонитрил / вода / 0,1% TFA | 1 мл / мин | 9.9 | 751,34 | 750,45 |
Таблица 2. Аналитические данные для пептидов Переплет CGI и сальто.
Таблица 3. В пробирке связывание выбранных N-крышками переворачивается CDK2CA и CDK4CD.
Таблица 4. В пробирке связывания выбранного N & C ограничен переворачивается CDK2CA и CDK4CD.
Дополнительное Рисунок 1-5. Очистка и характеристика 1- (3-хлорфенил) -5-метил-1Н-1,2,4-триазол-3-карбоновой кислоты.
Дополнительное Рисунок 1. Флэш хроматограмма продукта, полученный на стадии 1. Существуют четыре пика элюирования основной пик при элюировании при 55% этилацетата / 45% гексана было установлено, что желаемый продукт. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенное фигура.
Дополнительное Рисунок 2. 1 H ЯМР 1- (3-хлорфенил) -5-метил-1Н-1,2,4-триазол-3-автомобиля карбоновой кислоты. ЯМР-спектр показывает 3 алифатические протоны метил и 3 ароматические протоны. Интеграция всех трех пиков показано ниже в спектре ЯМР. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Дополнительное Рисунок 3. 13 C ЯМР 1- (3-хлорфенил) -5-метил-1Н-1,2,4-триазол-3-карбоновой кислоты. Есть десять атомов углерода в структуре, 13 C ЯМР с 10 сигналов для каждого углерода атом. Интеграция для каждого пика показано ниже в спектре ЯМР. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
ig4.jpg "/>
Дополнительное Рисунок 4. MS 1- (3-хлорфенил) -5-метил-1Н-1,2,4-триазол-3-карбоновой кислоты. Молекулярная масса соединения, как показано на материнской пика 237. Фактическое молекулярной масса соединения является 237,64. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Дополнительное Рисунок 5. ВЭЖХ 1- (3-хлорфенил) -5-метил-1Н-1,2,4-триазол-3-карбоновой кислоты. Чистоту продукта определяется как 100%, как показано на хроматограмме ВЭЖХ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Computational Chemistry | |||
| Accelyrs Discovery studio 3.0 | |||
| Dell Optiplex Workstations | |||
| Synthetic Organic Chemistry | |||
| Silica gel (GF-254 plates) for TLC, Biotage (Uppsala, Sweden) for flash chromatography, Waters Alliance 2695 HPLC with a 2996 diode-array detector and equipped with a C18 (2) 100 A, 250 x 4.6 mm, 5 μm column (Phenomenox Luna) for purity determination, 1H NMR and 13C NMR spectra were recorded with a Varian Mercury 300 and 400 Spectrometer, respectively. Mass spectra were measured with a Micromass QTOF (Tandem quadruple-1 time of flight mass spectrometer), electrospray ionization (ESI) and VG 70S (Double-focusing magnetic sector mass spectrometer, EI). | |||
| Flourescence Polarization Assay | |||
| 384 micro well plates, Micro pipets | Grenier Bio-one | 110256602 | |
| CDK4D1 and CDK2CA (well purified recombinant human kinase complex) | BPS Bio Sciences | 40094(CDK4/Cyclin D), 41101(CDK2/Cyclin A) | |
| assay buffer (25 nM HEPES pH 7, 10 mM NaCl, 0.01% Nonidet P-40, 1 mM dithiothretiol (DTT)) | |||
| 25 nM HEPES | CALBIOCHEM | 375368 | |
| NaCl | Fisher | 127838 | |
| Nonidet P-40 | US Biological | N3500 | |
| DTT | Aldrich | ||
| -70 °C freezer | Revco (Ultima II) | ||
| DTX880 multimode detector fitted with 485 nm/535 nm excitation/emission filters and a dichroic mirror suitable for fluorescein | Beckman Coulter, Brea, CA | ||
| Cell Culture | |||
| 96 well plates | Fisher | ||
| Frozen stocks of U2OS (osteosarcoma) and DU145 (prostate cancer) cell lines | ATCC | ||
| NU serum, DMEM media, trypsin, PEN/STRIP, MTT reagent | Fisher, Life technology, Alfa Aesar | ||
| Heamocytometer | VWR | ||
| -70 °C freezer | Revco (Ultima II) | ||
| Incubator | Thermo electron corporation | ||
| Centrifuge | Eppendorf | 5804 R | |
| Refrigerator 4-8 °C | Isotemp Fisher | ||
| DTX880 multimode detector fitted with 595 nm filter | Beckman Coulter, Brea, CA | ||
References
- Andrews, M. J., et al. REPLACE: a strategy for iterative design of cyclin-binding groove inhibitors. Chembiochem. 7, 1909-1915 (2006).
- Liu, S., et al. Optimization of Non-ATP Competitive CDK/Cyclin Groove Inhibitors through REPLACE-Mediated Fragment Assembly. J Med Chem. 56, 1573-1582 (2013).
- McInnes, C. Chapter 29. Annual Reports in Medicinal Chemistry. Bernstein, M., Desai, P. 47, Elsevier. 459-474 (2012).
- Bower, J. F., Pannifer, A. Using fragment-based technologies to target protein-protein interactions. Curr Pharm Des. 18, 4685-4696 (2012).
- Makley, L. N., Gestwicki, J. E. Expanding the number of 'druggable' targets: non-enzymes and protein-protein interactions. Chemical biology, and drug design. 81, 22-32 (2013).
- Walensky, L. D., Bird, G. H. Hydrocarbon-Stapled Peptides: Principles, Practice, and Progress. J Med Chem. , (2014).
- Shapiro, G. I. Cyclin-dependent kinase pathways as targets for cancer treatment. J Clin Oncol. 24, 1770-1783 (2006).
- Thais, M., Sielecki, J. F. B., Enfield, P. A., Trainor, G. l Cyclin dependant kinase inhibitors: Useful targets in cell cycle regulation. Journal of medicinal chemistry. 43, 1-18 (2000).
- Morphy, R. Selectively nonselective kinase inhibition: striking the right balance. J Med Chem. 53, 1413-1437 (2010).
- Chen, Y. N., et al. Selective killing of transformed cells by cyclin/cyclin-dependent kinase 2 antagonists. Proc Natl Acad Sci USA. 96, 4325-4329 (1999).
- Orzaez, M., Gortat, A., Mondragon, L., Bachs, O., Perez-Paya, E.
- Kontopidis, G., et al. Insights into cyclin groove recognition: complex crystal structures and inhibitor design through ligand exchange. Structure. 11, 1537-1546 (2003).
- McInnes, C., Andrews, M. J., Zheleva, D. I., Lane, D. P., Fischer, P. M. Peptidomimetic design of CDK inhibitors targeting the recruitment site of the cyclin subunit. Current medicinal chemistry. Anti-cancer agents. 3, 57-69 (2003).
- Premnath, P. N., et al. Fragment based discovery of arginine isosteres through REPLACE: towards non-ATP competitive CDK inhibitors. Bioorganic, and medicinal. 22, 616-622 (2014).
- Venkatachalam, C. M., Jiang, X., Oldfield, T., Waldman, M. LigandFit: a novel method for the shape-directed rapid docking of ligands to protein active sites. J Mol Graph Model. 21, 289-307 (2003).
- Mendoza, N., et al. Selective cyclin-dependent kinase 2/cyclin A antagonists that differ from ATP site inhibitors block tumor growth. Cancer Res. 63, 1020-1024 (2003).
- Denizot, F., Lang, R. Rapid colorimetric assay for cell growth and survival. Modifications to the tetrazolium dye procedure giving improved sensitivity and reliability. J Immunol Methods. 89, 271-277 (1986).
- Zheleva, D. I., et al. Highly potent p21(WAF1)-derived peptide inhibitors of CDK-mediated pRb phosphorylation: delineation and structural insight into their interactions with cyclin A. The journal of peptide research : official journal of the American Peptide Society. 60, 257-270 (2002).
- Ivanov, A. A., Khuri, K. F. R., Fu, H. Targeting protein-protein interactions as an anticancer strategy. Trends in Pharmacological Sciences. 34, (2013).
- Thayer, A. M.
- Yin, H., Hamilton, A. D. Strategies for targeting protein-protein interactions with synthetic agents. Angew Chem Int Ed Engl. 44, 4130-4163 (2005).
- Jubb, H., Higueruelo, A. P., Winter, A., Blundell, T. L. Structural biology and drug discovery for protein-protein interactions. Trends Pharmacol Sci. 33, 241-248 (2012).
- Cannon, J. B. Pharmaceutics and drug delivery aspects of heme and porphyrin therapy. J Pharm Sci. 82, 435-446 (1993).
