Abstract
BYT är en unik strategi som utvecklats för att mer effektivt nå protein-proteininteraktioner (PPI). Det syftar till att utöka tillgängliga läkemedelsmål utrymme genom att tillhandahålla förbättrad metod för identifiering av inhibitorer för sådana bindningsställen och som utgör majoriteten av potentiella läkemedelsmål. Huvudsyftet med denna uppsats är att ge en metodisk översikt av användningen och tillämpningen av BYT strategi som innebär beräknings och synteskemi metoder. BYT exemplifieras genom dess tillämpning på utveckling av icke-ATP konkurrenskraftig cyklinberoende kinaser (CDK) -hämmare som antitumörläkemedel. CDK ofta avreglerades cancer och därmed betraktas som viktiga mål för läkemedelsutveckling. Hämning av CDK2 / cyklin A i S-fas har rapporterats att främja selektiv apoptos i cancerceller i en p53 oberoende sätt genom E2F1 vägen. Targeting interaktion protein-protein vid cyklin binding spår (CBG) är en metod som gör det möjligt för specifik inhibering av cellcykeln över transkriptions CDK. CBG är erkänd av en konsensussekvens härledd från CDK substrat och tumörsuppressor proteiner kallas cyklin bindningsmotivet (CBM). CBM har tidigare optimerats för att en oktapeptid från p21Waf (HAKRRIF) och sedan vidare trunkeras till en pentapeptid bibehåller tillräcklig aktivitet (RRLIF). Peptider i allmänhet inte cellpermeabla, är metaboliskt instabila och därför BYT (byte med delvis ligand alternativ genom Computational Anrikning) strategi har använts för att generera fler läkemedelsliknande hämmare. Strategin börjar med utformningen av Fragment ligerades hämmande peptider (Vänder) som selektivt hämmar cellcykel CDK / cyklin-komplex. Flips genererades genom iterativt ersätta rester av HAKRRLIF / RRLIF med fragmentet som små molekyler (capping-grupper), med början från N-terminalen (NCAPS), följt av utbyte påC-terminalen. Dessa föreningar är utgångspunkter för generering av icke-ATP konkurrerande CDK-inhibitorer som anti-tumörterapi.
Introduction
I den här artikeln är en fallstudie att tillämpa BYT (ersättning med partiella ligand alternativ med hjälp av beräknings anrikning) strategi för att omvandla peptid inhibitorer av protein-proteininteraktioner i flera farmaceutiskt relevanta molekyler beskrivs 1-3. Medan PPI representerar en rik men underutnyttjade källa till potentiella målproteiner, befintliga metoder är i hög grad otillräckliga för att göra dessa allmänt tillgängliga. Nuvarande strategier inklusive fragment baserad design 4, high-throughput screening 5 och häftade peptiderna 6 har gett framsteg, men dessa är i många fall ineffektiv. Som ett resultat, är ytterligare framsteg och effektivare metoder behövs. BYT har helt validerats i utvecklingen av kinashämmare som har förbättrat läkemedelsliknande egenskaper och har potential för vidareutveckling som anti-tumörterapi. Denna strategi exemplifieras i utvecklingen av icke-ATP inhibitorer av cellcykel CDK och innebär följande: 1) för erhållande av 3D strukturell information om samspelet mellan HAKRRLIF / RRLIF med cyklin bindande spår; 2) om fastställelse av viktiga bindningsbestämningsfaktorer för peptid interaktion; 3) trunkering av peptiden N-terminalen som innehåller en eller flera bindande determinanter; 4) beräknings identifiering av potentiella småmolekylära alternativ (partiell ligand alternativ, Plas) för den stympade delen av peptiden och som bibehåller viktigaste sambanden moder peptiden; 5) syntes eller kommersiell inköp av PLA förutspådde att binda glupskt med under webbplatsen tidigare upptogs av den borttagna peptidresten (s); 6) syntes av flips genom ligering av de bästa PLA till den trunkerade peptiden med användning av fast fas-syntes; 7) test av vänder i en in vitro bindnings eller funktionell analys (fluorescenspolarisering i CDK / cyklin sammanhang) följt av ytterligare karakterisering i ett cell viabilitetsanalys. En schematisk representation av BYT strategy visas i figur 1. I den här artikeln, är upprepningar av BYT strategi diskuteras och ansökan till CDK2 / cyklin A beskrivs i detalj. CDK tros vara direkt eller indirekt avreglerad i de flesta tumörer och anses därför lämpligt cancer läkemedelsmål 7. CDK kräver association med cykliner för full aktivering och därefter fosforylera viktiga proteiner involverade i cellcykelreglering 8. De två stora grupper av CDK är isotyperna som styr cellcykelkontrollpunkter [G1 / S (CDK4 / cyklin D, CDK6 / cyklin D och CDK4 / cyklin E), S-fas (CDK2 / cyklin A) och G2 / M (CDK1 / cyklin B)] och tillsynsmyndigheterna i RNA-polymeras genom fosforylering (cdk7 / cyklin H, CDK8 / cyklin C, CDK9 / cyklin T). Ett nyckelsteg i S-fas progression sker när E2F1 transkriptionsfaktorn bildar ett komplex med DP-proteinet, som därefter binder till DNA och initierar gentranskription. CDK2 / cyklin A krävs för att neutralisera E2F1 transkriptionellaktivitet genom fosforylering vilket leder till frisättning av den E2F1-DP komplex och dess efterföljande nedbrytning. Hämning av CDK2 / cyklin A tros hålla E2F1 i dess DNA bundet tillstånd som leder till ihållande aktivering. Den resulterande nivån av E2F-1-aktivitet kommer att överträffa den tröskel som krävs för att inducera p53 oberoende apoptos föreslår därför en terapeutisk strategi. På grund av avreglerad p53 och pRB vägar, höga nivåer av E2F-1 ofta förekommer i cancerceller och hämning av CDK2 / cyklin A bör leda till selektiv apoptos i tumörer och kan betraktas som en validerad cancer mål 7.
Kliniskt undersökta CDK-hämmare rikta mycket konserverade ATP-bindningsstället som leder till korsreaktivitet bland de som är större än 500 proteinkinaser i människo kinome och potentiellt ge upphov till biverkningar och toxicitet 9. Ett alternativt tillvägagångssätt är icke-ATP kompetitiv inhibering genom att rikta substrat rekrytering genom CBGnärvarande på cyklin positiv regulatorisk underenhet och som därför distinkt och långt från ATP-bindningsstället 10,11. CBG är i första hand en hydrofob spår som finns i cyklin A, cyklin D och cyklin E och har visat sig känna igen en konsensussekvens som finns i substrat och tumörsuppressorer. Som en isolerad peptid, cyklin bindningsmotivet (CBM) binder till CBG och har visats inhibera kinasaktiviteten av cellcykeln CDK. CBM har optimerats för att en oktapeptid (HAKRRLIF, CDK2 / cyklin A IC 50 0,07 ± 0,02 pM, CDK4 / cyklin D, IC 50 0,88 ± 0,34 M) och dessutom stympad till en pentapeptid representerar en bra kompromiss mellan molekylvikt för narkotika likhet och styrka (RRLIF, CDK2 / cyklin A IC 50 1,01 ± 0,17 pM, CDK4 / cyklin D, IC 50 25,12 ± 2,97 M) 12,13. De CBGs består av ett stort primär och sekundär mindre hydrofoba ficka som överbryggas av en acidic region (inkluderar Glu220, Glu224 och Asp283). De viktigaste bindningsbestämnings HAKRRLIF inkluderar interaktionen mellan Ala2 med sekundära hydrofoba ficka, jonparande och vätebindningar av Lys3, Arg 4 och Arg5 med den sura regionen och en hög grad av komplementaritet mellan Leu6 och Phe8 med det primära lipofila platsen. Dessutom är många vätebindningar bidragit från peptidstommen medan Ile7 fungerar som ett distansorgan återstod tillåter optimal kontakt med den primära ficka. Bindningsläge och interaktioner mellan HAKRRLIF med CBG visas i figur 2.
Targeting protein-proteininteraktion CBM / CBG kommer att inhibera kinasaktiviteten av CDK2 / cyklin A, CDK2 / cyklin E & CDK4 / cyklin D och detta bör utlösa E2F1 förmedlad apoptos av cancerceller utan att påverka normala celler 7. Även CBM härledda peptider är effektiva inhibitorer av cellcykel CDK, är det osannolikt att de kommer att vara användbara som läkemedel på grund av deras metaboliskainstabilitet och allmän brist på cell permeabilitet. För detta ändamål har vi tillämpat BYT strategi för att omvandla dessa potenta peptid hämmare i flera läkemedelsliknande föreningar för vidareutveckling av anti-tumörterapi som utnyttjar avreglerade E2F1 genom CDK2 / cyklin A inhibition. Följande protokoll sammanfattar arbete som har genomförts vid tillämpningen av REPLACE till cyklin spåret. I det första fallet har läkemedelsliknande tak grupp ersättare för N-terminal tetrapeptiden av HAKRRLIF identifieras. Dessutom förbättringar i dessa grupper undersöktes i en ytterligare valideringsstudie för BYT. Representativa resultat från dessa studier presenteras också.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Beräknings Identifiering av Potential liten molekyl Utjämningssats Grupper
Obs: I princip kan en mängd olika dockning eller farmakofor sökmetoder användas för att förutsäga potentiella kapslingsgrupper. Det huvudsakliga syftet med beräknings studier i BYT är att identifiera små molekyler som bibehåller funktioner och interaktioner av de aminosyror som är substituerade.
- Validering av LigandFit docknings protokoll 14
Obs! I tidigare studier, dockningsmetod (LigandFit 15, en modul i molekylär modellering programsvit, Discovery Studio 3.0) validerades för att säkerställa att denna algoritm är tillräcklig för att reproducera bindningssätt med känd NCAPS och för att visa att de resultat som erhållits för okända föreningar är prediktiva 14.
- Med användning av de följande stegen (1,2 - 1,5), identifiera optimala parametrar för LigandFit enligt följande: PLP1 svERGI nätet för pose generation, minimering av genererade poser och PLP1 scoring funktion för analys av poser.
- För att begränsa de konformationer som uppnåtts och att positionera ligander på lämpligt sätt för bildning av kovalent bindning i capped peptiden, ställer indolkvävet och amid kväveatomerna hos Trp217 och Gln254 respektive som interaktions filter för vätebindning.
- Design och docka ett bibliotek av fragment alternativ i CDK2 / cyklin A-receptorn (2UUE). Prioritera potentiella kapslingsgrupper för syntes och kommersiella sourcing baserat på PLP1 poäng, interaktioner med interaktions filter och komplementaritet med CBG. De olika steg som krävs för LigandFit dockning är följande.
- Framställning av receptorbindningsstället 14
- Importera CDK2 / cyklin A kristallstruktur (PDB ID: 2UUE) till ett fönster visualisering i programvaran. Denna struktur innehåller det tidigare identifierade FLIP 5-metyl-1-fenyl-1 H-1, 2,4-triazol-3-karboxamido (3,5-DCPT) RLIF bunden till cyklin spår (fig 3).
- Ta bort eller hålla på plats resterna RLIF (C-terminal). När peptidsekvensen bibehålls, använder den N-terminala aminogruppen i peptiden som en interaktionsfilter för liganden. Från "Receptor-ligand växelverkan" verktyg, skapa en sfär kring N-cap 3,5-DCPT från Visa / Dölj webbplats sfär. Klotet är skapad för att definiera den aktiva regionen i bindningsstället där ligand-receptorinteraktioner är tillåtna att inträffa under bindning.
- Definiera bindningsstället längre bort från "hitta plats som volym av utvalda ligand" och ta bort liganden 3,5-DCPT från proteinet. Utför detta steg för att definiera volymen av bindning inom sfären skapas.
- Ställ indolkvävet och amid kväveatomer av resterna Trp217 och Gln254 som interaktions filter för vätebindningar. Ställ interaktions filter så att endast de poser som Interact med atomerna inställda rester kommer att filtreras under dockningsprocessen därför bevara viktiga interaktioner i dockade poser.
- Framställning av ligander 14
- Designa ett bibliotek med 100 potentiella kapslings grupper utifrån kriterier inklusive molekylvikt mindre än 500, närvaron av en karboxylatgrupp för ligering med den stympade peptid och integration av lämpliga hydrofoba grupper (fenylgrupp) för van der Waals interaktion i den sekundära fickan som visas i tabell 1.
- Välj heterocykliska ringar för efterliknande peptid vätebindningsinteraktioner med Trp217 och substituenter ingår för att ersätta jonparande interaktioner av basiska sidokedjor av den HAKRRLIF. Docka ligandema som respektive aldehyd molekyler så att karbonylsyret kan interagera med amidkväveatomen av Gln254 liknar peptidstommen i moderpeptiden (tabell 1).
- Före dockung, minimera utformade ligander till en lågenergikonformation och förbereda sig på lämpligt jonisering tillstånd med hjälp av "Förbered ligander" protokoll. Rita och exportera dessa potentiella N lock i .SDF filformatet i ChemDraw för ett kalkylblad innan de importeras till programmet.
Obs: Förbered ligander protokoll används för att minimera alla ligander som ska dockas till sin lägsta energitillstånd och jonisering avgifter gjordes de tillämpliga atomer. Standardparametrar används för detta steg.
- Dockning av liganderna i cyklin A Groove 14
- Välj LigandFit rutin från receptor-ligand interaktioner protokoll uppsättning av programvaran. Använd receptorn och de beredda ligander som underlag för detta protokoll.
- För dessa körningar väljer PLP1 som energinät anger som innebär vara energi minimeras och att antalet genererade poser som 10. Låt alla andra parametrar vid standardvärden.
Obs: LigandFit ären dockningsmetod, som kan identifiera och generera poser med hög komplementaritet och potentiell affinitet med det aktiva stället i ett protein med användning av en form baserad jämförelse filter som är kombinerad med en Monte Carlo-konforma sökalgoritm. Den energinät som används av docknings programmet är kraftfältet för att generera ligand-receptorinteraktioner och potentiella poser. PLP1 är styckvis linjär potential som specifikt prioriterar vätebindningsinteraktioner och där PLP atomtypen tilldelas för varje icke-väte ligand atom eller icke-vätereceptoratom.
- Analys av resultat
- I första hand innebär visning i visualizer programmet och sedan sortera fallande värden på PLP1 poäng. Använd scoring funktioner såsom PLP1 att uppskatta bindningsaffiniteten hos en dockad ligand baserad på en kandidat-ligand pose geometri och icke-kovalent interaktion med målet receptorstrukturen.
Obs: Här var PLP1 scoring funktion tate give de bästa resultaten eftersom det innehåller en uppskattning av vätebindning. - Analysera visuellt topp 25% av de skårade poser för 1) superimposability med den kända tak-gruppen (med en relativ medelkvadratavvikelsen (RMSD) värde mindre än 2 Å), 2) fullinteraktions filter och 3) visuell komplementaritet med cyklin spåret . Det är accepterat i att en korrekt dockad pose (jämfört med en experimentell struktur) har ett RMSD värde <2 Å.
- Undersök poser för visuell komplementaritet, vilket definieras som att ha en effektiv fyllning av bindningsfickan på ett sätt som är förenligt med kända struktur-aktivitetssamband. Interaktions filter är inställda för att inkludera begränsningar atom som kräver intermolekylära kontakter är kända för att vara avgörande för bindning och / eller erfordras för att positionera den potentiella kapslingsgrupp i korrekt geometri för amidbindningsbildning. Tre exempel på dockade poser potentiella N-skyddande grupper som vätebindningar med interaction filter visas i Figur 4.
- I första hand innebär visning i visualizer programmet och sedan sortera fallande värden på PLP1 poäng. Använd scoring funktioner såsom PLP1 att uppskatta bindningsaffiniteten hos en dockad ligand baserad på en kandidat-ligand pose geometri och icke-kovalent interaktion med målet receptorstrukturen.
2. Syntes och karakterisering av potentiella N -capping Grupper
- Syntes av N-capping-grupper.
- För syntes, använda alla kommersiella utgångsmaterial, lösningsmedel och reagens som erhållits. Syntetisera potentiella N-capping-grupper genom konventionell syntetisk organisk kemi (figur 5 12,13 för ett exempel).
- Utför tunnskiktskromatografi (TLC) på silikagel för att övervaka reaktioner.
- Upplösa utgångsmaterialet och reaktionsblandning (1 mg) i den mobila fasen och upptäcka dem på TLC-plattan med användning av kapillärrör.
- Placera TLC-plattan i den kammare som innehåller mobila fasen (etylacetat och hexan vid ett 35:65 förhållande). När väl den mobila fasen når 90% av TLC-plattan, ta bort och lufttorka plattan.
- Använd UV-ljus för att upptäcka de utgångsmaterial och reaktionsblandningar som synliga fläckar. Calberäkna Rf av alla fläckar (förhållandet mellan avståndet som plats och den mobila fasen).
Notera: Reaktionen är fullständig när det inte finns någon plats ses vid Rf av utgångsmaterialet.
- Efter reaktionens fullbordande arbeta upp reaktionsblandningen genom att placera i en separationstratt och tvättning med vattenhaltig syra eller bas lösning som är lämpligt. Samla det organiska lösningsmedlet, indunsta den i rotationsindunstare och torka den råa produkten, som erhållits under vakuum.
- Lös 500 mg råprodukt i 3-5 ml av lämpligt lösningsmedel och tillsätt 1 g kiseldioxid eller RP18 samplet och torka under luft. Placera samplet innehållande den råa produkten i kiseldioxid / RP SNAP flash patroner och rena det råa materialet med användning av automatiserad högpresterande snabbkromatografi (enligt tillverkarens protokoll) som utnyttjar en SNAP 100 g kolonn med en gradient körning med utgångspunkt från 6% etylacetat: 94 % hexan till 50% etylacetat och 50% hexan över15 kolonnvolymer.
- Torka den renade produkten uppsamlas i lösningsmedel från flashkromatografi med användning av en rotationsindunstare genom förångning allt lösningsmedel till torrhet och ytterligare torka produkten under vakuum för att avlägsna alla kvarvarande lösningsmedel. Utför karakterisering av den renade produkten med NMR, MS och analytisk HPLC.
- För 1H NMR och 13C NMR, väger ca 10 mg av det renade provet, lösa det på ett lämpligt deutererade lösningsmedel, och överföra innehållet till en torr NMR-rör för att registrera NMR-spektra 2,14.
- Anteckna en H NMR och 13 C-NMR-spektra med en hög fält NMR-spektrometer (minst 300 MHz). Förvärva masspektra med hjälp av en QTOF (Tandem fyrdubbla-1 flygtid masspektrometer), elektrosprayjonisering (ESI) eller en VG 70S (Dubbel fokusering magnetiska massan sektorn spektrometer, EI) 2,14.
- Analysera renheten av produkterna genom HPLC med en diodarraydetektor och utrustad meden C18 (2) 100 A, 250 x 4,6 mm, 5 | im kolonn för analys. Använder en gradient körning med start från 100% vatten (0,1% trifluorättiksyra) till 60% acetonitril (0,1% trifluorättiksyra) under 30 min och håll gradient under 4 minuter. Utdrag kromatogrammen vid 226 och 254 nm 2,14.
Obs: Analytisk renhet av utvärderade föreningar var> 95%.
3. Fastfassyntes för generering av Vänder 2
- Syntes av N-capped Vänder
- Montera N-täckta peptidföreningar genom standardiserade fast fas syntesmetoder med hjälp av följande steg.
- Aktivera 5 ekvivalenter av den C-terminala aminosyran (Fmoc-Phe) i 4,4 ekvivalenter O -Benzotriazole- N, N, N ', N' -tetrametyl-uronium-hexafluor-fosfat (HBTU, 221,93 mg) i 2 ml DMF under 5 minuter. Ladda Fmoc-Phe HBTU blandningen på Rink harts med hjälp av 6 ekvivalenter av diisopropyletylamin (DIPEA, 103,13mg) under 1 h vid RT.
- Avlägsna Fmoc-skyddsgruppen från den C-terminala resten med användning av 20% piperidin i 3 ml DMF under 10 minuter. Par efterföljande aminosyror (t.ex., Fmoc-Ile, Fmoc-Leu, Fmoc-Arg-pmc) steg för steg. Vid varje steg, par 5 ekv av nästa aminosyra med användning av 6 ekvivalenter av DIPEA (103,13 mg) och 4,4 ekvivalenter av HBTU (221,93 mg) i 2 ml DMF under 1 h vid RT.
- Applicera tvättcykler (5 x 10 ml DMF + 5 x 10 ml DCM) efter aminosyra kopplings och Fmoc avskyddande stegen beskrivna ovan. Efter peptidaggregat, par N-capping-grupper med användning av 6 ekvivalenter av DIPEA (103,13 mg) och 4,4 ekvivalenter av HBTU (221,93 mg) i 2 ml DMF under 1 h vid RT.
- Efter avslutad peptidaggregat, behandla reaktionsblandningen med 2 ml av klyvningsblandningen (90: 5: 5 TFA / H2O / TIPS) O / N för att avlägsna sidokedjeskyddande grupper och klyva flips från hartset. Triturera den resulterande produkten med kall dietyleter för att fälla ut och jagf nödvändig koncentrat i en rotationsindunstare.
- Montera N-täckta peptidföreningar genom standardiserade fast fas syntesmetoder med hjälp av följande steg.
- Syntes av N-capped-C-capped Vänder
- Väg och lös den N-terminalt skyddade och skyddade Arg-Leu-peptiden (16,1 mg, 0,02 mmol) i diklormetan, och tillsätt [4- (3-klorfenoxi) pyridin-2-yl] metanamin (C-lock) tillsammans med O - benzotriazole- N, N, N ', N' tetrametyluronium hexafluorofosfat (HBTU; 16,7 mg, 0,02 mmol) och N, N-diisopropyletylamin (DIPEA, 6,5 mg, 0,02 mmol).
- Rör om och övervaka reaktionen vid RT tills TLC / HPLC indikerar fullständig förbrukning av utgångsmaterial. Efter fullbordande av reaktionen, koncentrera den råa reaktionsblandningen med användning av en rotationsindunstare och sedan fördela mellan etylacetat och vatten.
- Separera vatten och organiska skiktet; Tvätta det organiska skiktet med 1 N NaOH, 1 N HCl och saltlösning. Torka det organiska skiktet med ca 1 g natriumsulfat och koncentrera produkten i rotationsindunstare. Finally behandla produkten O / N med klyvningsblandningen (95: 2,5: 2,5 trifluorättiksyra / H2O / TIPS) för avlägsnande av skyddsgrupper.
- Triturera den resulterande produkten med kall dietyleter och om nödvändigt koncentrat i rotationsindunstare till fullständig torrhet för att avlägsna allt lösningsmedel. Ytterligare torka produkten under vakuum för att avlägsna alla återstående lösningsmedel.
- Rening och karakterisering av Vänder
- Rena rå flips med hjälp av semi preparativa HPLC-metoder omvänd fas. Lyofilisera de renade flips och karakterisera sin molekylvikt med hjälp av masspektrometri 2,14.
- Bestäm den analytiska renheten för de fälls genom HPLC med en diodarraydetektor och utrustad med en C18 (2) 100 A, 250 x 4,6 mm, 5 ^ m kolonn. Använd en gradientmetoden utgående från 95% H2O (0,1% trifluorättiksyra) / 5% acetonitril (0,1% trifluorättiksyra) till 35% H2O (0,1% trifluorättiksyra) / 65% acetonitril (0,1% trifluoroacetic syra) under 30 minuter och håll gradienten under 4 min. Utdrag Kromatogram vid 226 och 254 nm.
4. fluorescenspolarisationen bindningsanalys för bestämning av kompetitiv bindning 2,14
- Utföra analysen i svart 384-brunn (138 | il) plattor med användning av följande förfarande.
- Späd prover, spår peptider (4 nM), och kinaskomplex (CDK2 / cyklin A - 18 | j, g / ml, CDK4 / cyklin D - 37 | ig / ml) och erforderliga koncentrationerna i analysbuffert (25 mM HEPES pH 7, 10 mM NaCl, 0,01% Nonidet P-40, 1 mM ditiotreitol (DTT).
- Till varje brunn av 384-brunnar, tillsätt: 5 fil av CDK4D1 eller CDK2CA (0,3 | j, g / brunn renad rekombinant humant kinas komplex), 5 ^ il föreningslösning, 5 | il av 30 nM spårämne peptid (fluoresceinyl-Ahx-Pro-Val Lys-Arg-Arg-Leu (3ClPhe) -Gly eller fluoresceinyl-Ahx-Pro-Val-Lys-Arg-Arg-Leu-Phe-Gly spårämne peptid). Använd 5 pl av varje DMSO (6%), buffer, spårämne och 5 ^ il DMSO (6%), kinaskomplex, spårämne som kontrollbrunnarna
- Efter tillsatsen av alla komponenter, centrifugera plattan vid 500 rpm under 1 minut (41,16 xg) vid RT och sedan inkubera plattan med omrörning under 45 min vid RT. Med användning av en multimode-plattavläsare och detektor utrustad med 485 nm / 535 nm excitation / emissionsfilter och en dikroisk spegel läsa fluorescein intensiteten för varje brunn i plattan.
- Beräkna den relativa medel polarisation (mp) för alla testproven med hjälp av ekvationen visar nedan. Bestäm IC 50 värden genom logaritmisk regression genom att korrelera relativa mps och testa koncentrationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De interaktioner av HAKRRLIF med cyklin spåret visas i figur 2. De peptidrester som representerar de viktigaste bindningsdeterminanter inkluderar Ala2, ARG4, Leu6 och Phe8 med andra rester som tillhandahåller mindre insatser 12,13,18. I denna fallstudie BYT strategi har använts för att hitta fragment alternativ för rester i N-terminal tetrapeptiden av HAKRRLIF, främst imiterar samspelet mellan Ala2 och ARG4. Ett bibliotek av potentiella NCAP fragment (tabell 1) konstruerades på grundval av de kriterier. Varje molekyl var dockad i den lediga bindningsstället som skapas av trunkering av den N-capping grupp från dess kristallstruktur med cyklin A (PBF-ID: 2UUE). Potentiella ligand alternativ selekterades baserat på pose analys och PLP1 poängsättning som en förutsägelse av affinitet (exempel på dockade poser är visade i fig 4). Syntesen av en bekräftad NCAP (1- (3-klorfenyl) -5-metyl-1H-1,2,4-triazol-3-karboxylsyra) är visad i fig 5, där denna molekyl alstrades i tre steg och renades genom automatiserad flashkromatografi (Kompletterande Fig 1). Den 1 HNMR, 13 CNMR, MS och HPLC karakteriseringsdata för en representativ förening 1- (3-klorfenyl) -5-metyl-1H-1,2,4-triazol-3-karboxylsyra är visade i Kompletterande Figurer 1-5 respektive. Syntesen av N-capped flips och N-capped-C-capped flips är representerade i fig 7 och 8 och de karakteriseringsdata visas i tabell 2. Bindningsaffiniteten för både CDK2 / cyklin A och CDK4 / cyklin D-bestämdes med användning av den beskrivna FP-analys och resultaten visas i tabell 3. Av föreningarna testas, flips innehållande triazol baserade N-caps bestämdes ha störst affinitet för CDK2 / cyklin A och CDK4 / cyklin D och representativ förenings testades i cellbaserade analyser. Som helhet var FLIP molekyler identifierade befunnits vara mer drog liknande, och för att kvarhålla de flesta av interaktion mellan HAKRRLIF oktapeptiden. Capped tetrapeptider hade lägre potens jämfört med HAKRRLIF men var jämförbar verksamhet till RRLIF pentapeptiden (tabellerna 3 och 4). Dessa resultat visar att de erhållna föreningarna hade förbättrad läkemedels likhet men detta erhölls på bekostnad av något komprometterad bindningsaffinitet.
Den anti-proliferativ aktivitet dessa CGI ligander utvärderades och cellulära IC50 under 30 pM observerades i U2OS och DU145 cancercellinjer.
Figur 1. Översikt över BYT strategin. Vänligen cl ick här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Bindning och interaktioner mellan HAKRRLIF i CBG Vänster panel. Modellerade struktur HAKRRLIF bunden till CBG. Cyklin spåret består av två hydrofoba fickor - en större primär ficka (höger, ockuperat av Leu6 och Phe8) och en mindre sekundär ficka (vänster, ockuperat av Ala2) och som överbryggas av sura rester som visas i rött. Höger panel: Andra viktiga interaktioner inkluderar vätebindningskontakter peptidryggraden (med Trp217, Gln254, Ile281) och jonparande interaktioner mellan de tre basiska rester av peptiden (med Glu220, Glu224, Asp283). Klicka här för att se en större version av denna figur.
441 / 52441fig3.jpg "/>
Figur 3. Bindning läge 3,5-DCPTRLIF i CBG. Bindning av 3,5-DCPT-RLIF visas med vätebindningsinteraktioner (avbildad av gröna streckade linjer) med sidokedjan atomer av Trp217 och Gln254. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4. Valda docknings resultat. Dockad poser av 3 representativa N-kapslingsgrupper visas. Var och en av dessa föreningar gör H-bindningar med interaktion filteratomer Trp217 och Gln254 och som visas av gröna streckade linjer. Fenylsubstituenten gör van der Waals interaktioner med andra hydrofoba fickan. Klicka här för att se en större version av denna siffra. 
Figur 5. Syntes av 1- (3-klorfenyl) -5-metyl-1H-1,2,4-triazol-3-karboxylsyra. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6. Syntes av N-capped volter av fastfassyntes. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7. Syntes av N-capped-C-täckta flips. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Tabell 1. Library of små molekyler dockad och prognoserna för bindningsenergi med hjälp av PLP1 scoring funktion.
| Peptid | Renhet | Kolumn Dimensioner | Metod | Flödeshastighet | HPLC-retentionstid | Teoretisk molekylvikt | Observerad MW |
| 5843 | > 90% | 4,6 x 250 mm | 5-65% acetonitril / vatten / 0,1% TFA | 1 ml / min | 23,9 | 732 | 732,6 |
| 5773 | > 90% | 4,6 x 250 mm | 5-65% acetonitril / vatten / 0,1% TFA | 1 ml / min | 22,4 | 801,77 | 800,55 |
| 5774 | > 90% | 4,6 x 250 mm | 5-65% acetonitril / vatten / 0,1% TFA | 1 ml / min | 24,2 | 767,33 | 766,5 |
| 5762 | > 90% | 4,6 x 250 mm | 5-65% acetonitril / vatten / 0,1% TFA | 1 ml / min | 9,0 | 731,91 | 731,65 |
| 5763 | > 90% | 4,6 x 250 mm | 5-65% acetonitril / vatten / 0,1% TFA | 1 ml / min | 11,2 | 800,8 | 799,5 |
| 5764 | > 90% | 4,6 x 250 mm | 5-65% acetonitril / vatten / 0,1% TFA | 1 ml / min | 10,1 | 766,34 | 765,55 |
| 5771 | > 90% | 4,6 x 250 mm | 5-65% acetonitril / vatten / 0,1% TFA | 1 ml / min | 9,4 | 749,9 | 749,6 |
| 5765 | > 90% | 4,6 x 250 mm | 5-65% acetonitril / vatten / 0,1% TFA | 1 ml / min | 10,1 | 766,35 | 755,65 |
| 5766 | > 90% | 4,6 x 250 mm | 5-65% acetonitril / vatten / 0,1% TFA | 1 ml / min | 9,4 | 761,9 | 761,55 |
| 5767 | > 90% | 4,6 x 250 mm | 5-65% acetonitril / vatten / 0,1% TFA | 1 ml / min | 20,4 | 761,9 | 761,55 |
| 5776 | > 75% | 4,6 x 250 mm | 5-65% acetonitril / vatten / 0,1% TFA | 1 ml / min | 23,3 | 785,7 | 784,55 |
| 5775 | > 90% | 4,6 x 250 mm | 5-65% acetonitril / vatten / 0,1% TFA | 1 ml / min | 9,9 | 751,34 | 750,45 |
Tabell 2. Analysdata för CGI bindande peptider och FLIPS.
Tabell 3. In vitro-bindning av utvalda N-utjämnade flippar till CDK2CA och CDK4CD.
Tabell 4. In vitro-bindning av utvalda N & C utjämnade flippar till CDK2CA och CDK4CD.
Kompletterande Figur 1-5. Rening och karakterisering av 1- (3-klorfenyl) -5-metyl-1H-1,2,4-triazol-3-karboxylsyra.
Kompletterande Figur 1. Flash kromatogram som erhålls från steg 1. Det finns fyra toppar eluerande, huvud Elueringstoppen vid 55% etylacetat / 45% hexan befanns vara den önskade produkten. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Kompletterande Figur 2. 1 HNMR av 1- (3-klorfenyl) -5-metyl-1H-1,2,4-triazol-3-bil boxylsyror syra. NMR-spektrum visar 3 alifatiska metylprotoner och 3 aromatiska protoner. Integrationen för alla de tre toppar visas under NMR-spektrum. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande Figur 3. 13 CNMR 1- (3-klorfenyl) -5-metyl-1H-1,2,4-triazol-3-karboxylsyra. Det finns tio kolatomer i strukturen, 13 CNMR med 10 signaler för varje kol atom. Integrationen för varje topp visas under NMR-spektrum. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
ig4.jpg "/>
Kompletterande Figur 4. MS av 1- (3-klorfenyl) -5-metyl-1H-1,2,4-triazol-3-karboxylsyra. Molekylvikten för föreningen visas som modertopp vid 237. Den faktiska molekyl vikten av föreningen är 237,64. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande Figur 5. HPLC av 1- (3-klorfenyl) -5-metyl-1H-1,2,4-triazol-3-karboxylsyra. Renheten för produkten bestämmes som 100%, såsom visas i HPLC-kromatogrammet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Computational Chemistry | |||
| Accelyrs Discovery studio 3.0 | |||
| Dell Optiplex Workstations | |||
| Synthetic Organic Chemistry | |||
| Silica gel (GF-254 plates) for TLC, Biotage (Uppsala, Sweden) for flash chromatography, Waters Alliance 2695 HPLC with a 2996 diode-array detector and equipped with a C18 (2) 100 A, 250 x 4.6 mm, 5 μm column (Phenomenox Luna) for purity determination, 1H NMR and 13C NMR spectra were recorded with a Varian Mercury 300 and 400 Spectrometer, respectively. Mass spectra were measured with a Micromass QTOF (Tandem quadruple-1 time of flight mass spectrometer), electrospray ionization (ESI) and VG 70S (Double-focusing magnetic sector mass spectrometer, EI). | |||
| Flourescence Polarization Assay | |||
| 384 micro well plates, Micro pipets | Grenier Bio-one | 110256602 | |
| CDK4D1 and CDK2CA (well purified recombinant human kinase complex) | BPS Bio Sciences | 40094(CDK4/Cyclin D), 41101(CDK2/Cyclin A) | |
| assay buffer (25 nM HEPES pH 7, 10 mM NaCl, 0.01% Nonidet P-40, 1 mM dithiothretiol (DTT)) | |||
| 25 nM HEPES | CALBIOCHEM | 375368 | |
| NaCl | Fisher | 127838 | |
| Nonidet P-40 | US Biological | N3500 | |
| DTT | Aldrich | ||
| -70 °C freezer | Revco (Ultima II) | ||
| DTX880 multimode detector fitted with 485 nm/535 nm excitation/emission filters and a dichroic mirror suitable for fluorescein | Beckman Coulter, Brea, CA | ||
| Cell Culture | |||
| 96 well plates | Fisher | ||
| Frozen stocks of U2OS (osteosarcoma) and DU145 (prostate cancer) cell lines | ATCC | ||
| NU serum, DMEM media, trypsin, PEN/STRIP, MTT reagent | Fisher, Life technology, Alfa Aesar | ||
| Heamocytometer | VWR | ||
| -70 °C freezer | Revco (Ultima II) | ||
| Incubator | Thermo electron corporation | ||
| Centrifuge | Eppendorf | 5804 R | |
| Refrigerator 4-8 °C | Isotemp Fisher | ||
| DTX880 multimode detector fitted with 595 nm filter | Beckman Coulter, Brea, CA | ||
References
- Andrews, M. J., et al. REPLACE: a strategy for iterative design of cyclin-binding groove inhibitors. Chembiochem. 7, 1909-1915 (2006).
- Liu, S., et al. Optimization of Non-ATP Competitive CDK/Cyclin Groove Inhibitors through REPLACE-Mediated Fragment Assembly. J Med Chem. 56, 1573-1582 (2013).
- McInnes, C. Chapter 29. Annual Reports in Medicinal Chemistry. Bernstein, M., Desai, P. 47, Elsevier. 459-474 (2012).
- Bower, J. F., Pannifer, A. Using fragment-based technologies to target protein-protein interactions. Curr Pharm Des. 18, 4685-4696 (2012).
- Makley, L. N., Gestwicki, J. E. Expanding the number of 'druggable' targets: non-enzymes and protein-protein interactions. Chemical biology, and drug design. 81, 22-32 (2013).
- Walensky, L. D., Bird, G. H. Hydrocarbon-Stapled Peptides: Principles, Practice, and Progress. J Med Chem. , (2014).
- Shapiro, G. I. Cyclin-dependent kinase pathways as targets for cancer treatment. J Clin Oncol. 24, 1770-1783 (2006).
- Thais, M., Sielecki, J. F. B., Enfield, P. A., Trainor, G. l Cyclin dependant kinase inhibitors: Useful targets in cell cycle regulation. Journal of medicinal chemistry. 43, 1-18 (2000).
- Morphy, R. Selectively nonselective kinase inhibition: striking the right balance. J Med Chem. 53, 1413-1437 (2010).
- Chen, Y. N., et al. Selective killing of transformed cells by cyclin/cyclin-dependent kinase 2 antagonists. Proc Natl Acad Sci USA. 96, 4325-4329 (1999).
- Orzaez, M., Gortat, A., Mondragon, L., Bachs, O., Perez-Paya, E. ATP-noncompetitive inhibitors of CDK-cyclin complexes. ChemMedChem. 4, 19-24 (2009).
- Kontopidis, G., et al. Insights into cyclin groove recognition: complex crystal structures and inhibitor design through ligand exchange. Structure. 11, 1537-1546 (2003).
- McInnes, C., Andrews, M. J., Zheleva, D. I., Lane, D. P., Fischer, P. M. Peptidomimetic design of CDK inhibitors targeting the recruitment site of the cyclin subunit. Current medicinal chemistry. Anti-cancer agents. 3, 57-69 (2003).
- Premnath, P. N., et al. Fragment based discovery of arginine isosteres through REPLACE: towards non-ATP competitive CDK inhibitors. Bioorganic, and medicinal. 22, 616-622 (2014).
- Venkatachalam, C. M., Jiang, X., Oldfield, T., Waldman, M. LigandFit: a novel method for the shape-directed rapid docking of ligands to protein active sites. J Mol Graph Model. 21, 289-307 (2003).
- Mendoza, N., et al. Selective cyclin-dependent kinase 2/cyclin A antagonists that differ from ATP site inhibitors block tumor growth. Cancer Res. 63, 1020-1024 (2003).
- Denizot, F., Lang, R. Rapid colorimetric assay for cell growth and survival. Modifications to the tetrazolium dye procedure giving improved sensitivity and reliability. J Immunol Methods. 89, 271-277 (1986).
- Zheleva, D. I., et al. Highly potent p21(WAF1)-derived peptide inhibitors of CDK-mediated pRb phosphorylation: delineation and structural insight into their interactions with cyclin A. The journal of peptide research : official journal of the American Peptide Society. 60, 257-270 (2002).
- Ivanov, A. A., Khuri, K. F. R., Fu, H. Targeting protein-protein interactions as an anticancer strategy. Trends in Pharmacological Sciences. 34, (2013).
- Thayer, A. M. Improving peptides. Chemical and Engineering News. 89, 13-20 (2011).
- Yin, H., Hamilton, A. D. Strategies for targeting protein-protein interactions with synthetic agents. Angew Chem Int Ed Engl. 44, 4130-4163 (2005).
- Jubb, H., Higueruelo, A. P., Winter, A., Blundell, T. L. Structural biology and drug discovery for protein-protein interactions. Trends Pharmacol Sci. 33, 241-248 (2012).
- Cannon, J. B. Pharmaceutics and drug delivery aspects of heme and porphyrin therapy. J Pharm Sci. 82, 435-446 (1993).
