Abstract
BYTT er en unik strategi utviklet for å mer effektivt målrette protein-protein interaksjoner (PPI). Formålet er å utvide tilgjengelige medikamentmål plass ved å tilveiebringe forbedret metode for identifisering av inhibitorer for slike bindingsseter, og som utgjør hoveddelen av potensielle drug targets. Hovedmålet med denne artikkelen er å gi en metodisk oversikt over bruken og anvendelsen av BYTT strategi som innebærer beregningsorientert og syntetisk kjemi tilnærminger. BYTT er eksemplifisert ved dens anvendelse i utvikling av ikke-ATP konkurrerende cyklinavhengige kinaser (CDK) inhibitorer som anti-tumor terapeutiske midler. CDK er ofte deregulert i kreft og dermed anses som viktige mål for legemiddelutvikling. Hemning av CDK2 / cyklin A i S-fasen har blitt rapportert å fremme selektiv apoptose av kreftceller i en p53 uavhengig måte gjennom E2F1 pathway. Målretting protein-protein interaksjon på cyklin binding groove (CBG) er en tilnærming som vil tillate spesifikk hemming av cellesyklusen løpet transkripsjons CDK. Den CBG er anerkjent av en konsensus sekvens avledet fra CDK underlag og tumorsupressorproteinene proteiner kalt cyclin bindende motiv (CBM). CBM har tidligere blitt optimalisert til et oktapeptid fra p21Waf (HAKRRIF) og deretter ytterligere avkortet til en pentapeptid beholder tilstrekkelig aktivitet (RRLIF). Peptider generelt er ikke celle gjennomtrengelig, er metabolsk ustabil og derfor erstatte (erstatning med delvis Ligand Alternatives gjennom Computational Enrichment) strategi til grunn for å generere flere narkotika-lignende hemmere. Strategien begynner med utformingen av Fragment ligatisert hemmende peptider (knipser) som selektivt hemmer cellesyklus CDK / cyklin komplekser. Flips ble generert av iterativt erstatte rester av HAKRRLIF / RRLIF med fragment som små molekyler (capping grupper), med start fra N-terminalen (Ncaps), etterfulgt av erstatning påC-terminalen. Disse forbindelsene er utgangspunkt for generering av ikke-ATP konkurrerende CDK-hemmere som anti-tumor terapi.
Introduction
I denne artikkelen, er en casestudie av bruk av BYTT (Replacement med delvis ligandgrupper alternativer som bruker beregnings berikelse) strategi for å konvertere peptidiske hemmere av protein-protein interaksjoner i flere farmasøytisk relevante molekyler beskrevet 1-3. Mens PPIs representerer en rik, men underutnyttet kilde til potensielle narkotika mål, eksisterende metoder er i stor grad utilstrekkelig til å gjøre disse allment tilgjengelig. Gjeldende strategier, inkludert fragment basert design 4, high-throughput screening 5 og stiftede peptider 6 har gitt fremskritt, men disse er i mange tilfeller ineffektiv. Som et resultat, er mer fremdrift og mer effektive metoder påkrevd. BYTT har vært fullt validert i utviklingen av kinaseinhibitorer som har forbedret narkotika-lignende egenskaper og har potensial for videre utvikling som anti-tumor terapi. Denne strategien er eksemplifisert i utvikling av ikke-ATP inhibitorer av cellesykkel CDK og innebærer som følger: 1) innhente 3D strukturell informasjon om interaksjoner av HAKRRLIF / RRLIF med cyclin bindende sporet; 2) bestemme viktige bindings determinants for peptid samhandling; 3) avkutting av peptidet N-terminalen inneholder en eller flere bindings determinanter; 4) beregnings identifisering av mulige små molekyl alternativer (delvis ligandgrupper alternativer, Plas) for den avkortede delen av peptidet og hvilke beholde nøkkel interaksjoner i morselskapet peptid; 5) syntese eller kommersiell sourcing av plas spådd å binde ivrig med sub området tidligere okkupert av slettet peptidrest (s); 6) syntese av knipser gjennom ligering av de beste Plas til den avkortede peptid ved hjelp av fastfasesyntese; 7) testing av knipser i en in vitro-bindings eller funksjonelt assay (fluorescens polarisering i CDK / cyclin sammenheng), etterfulgt av ytterligere karakterisering i en celle-levedyktighet assay. En skjematisk fremstilling av BYTT strategy er vist i figur 1. I denne artikkelen er gjentakelser av REPLACE strategi diskutert og søknaden til CDK2 / cyklin A beskrevet i detalj. CDK antas å være direkte eller indirekte deregulert i de fleste svulster og er derfor anses hensiktsmessig kreft narkotika mål 7. CDK krever tilknytning til cykliner for full aktivering og deretter fosforylere viktige proteiner involvert i cellesyklusregulering 8. De to store grupper av CDK er isotyper som styrer cellesyklus sjekkpunkter [G1 / S (CDK4 / Cyclin D, CDK6 / cyklin D og CDK4 / cyclin E), S-fasen (CDK2 / cyklin A) og G2 / M (CDK1 / cyclin B)] og regulatorer av RNA polymerase gjennom fosforylering (CDK7 / cyclin H, CDK8 / cyklin C, CDK9 / cyclin T). Et viktig skritt i S-fasen progresjon oppstår når E2F1 transkripsjonsfaktor danner et kompleks med DP-proteinet, som deretter bindes til DNA og initierer gentranskripsjon. CDK2 / cyklin A er nødvendig for å nøytralisere E2F1 transkripsjonenaktivitet gjennom fosforylering og dermed fører til frigjøring av den E2F1-DP-komplekset og påfølgende nedbrytning. Hemning av CDK2 / cyklin A antas å opprettholde E2F1 i sin DNA bundet tilstand som fører til vedvarende aktivering. Den resulterende nivået av E2F-en aktivitet vil overgå terskelen nødvendig for å indusere p53 uavhengig apoptose derfor foreslå en terapeutisk strategi. På grunn av deregulert p53 og pRb trasé, høye nivåer av E2F-1 hyppig forekommer i kreftceller og inhibisjon av CDK2 / cyklin A bør føre til selektiv apoptose i tumorer og kan betraktes som en validert mål kreft 7.
Klinisk undersøkt CDK hemmere målrette svært konservert ATP-bindingssetet fører til krysse reaktivitet blant mer enn 500 proteinkinaser i menneske kinome og potensielt gi opphav til bivirkninger og toksisitet 9. En alternativ tilnærming er ikke-ATP kompetitiv hemming ved å målrette underlaget rekruttering gjennom CBGtilstede på cyklin positive regulatoriske subenhet og som derfor tydelig og fjernt fra ATP-bindingssetet 10,11. Den CBG er først og fremst en hydrofob spor til stede i cyklin A, cyklin D og cyclin E, og har vist seg å gjenkjenne en konsensussekvens som finnes i substrater og tumor-suppressorer. Som et isolert peptid, cyklin bindingsmotiv (CBM) binder til CBG, og har blitt vist å inhibere kinase aktivitet av cellesyklus CDK'er. CBM er optimalisert til en oktapeptid (HAKRRLIF, CDK2 / cyklin A IC 50 0,07 ± 0,02 mikrometer, CDK4 / cyklin D, IC 50 0,88 ± 0,34 mm) og dessuten avkortet til en pentapeptide representerer et godt kompromiss mellom molekylvekt for narkotika likhet og potens (RRLIF, CDK2 / cyklin A IC 50 1,01 ± 0,17 mikrometer, CDK4 / cyclin D, IC 50 25,12 ± 2,97 mm) 12,13. De CBGs består av en stor primær og mindre sekundær hydrofob lomme som er bygget bro ved en acidic regionen (inkluderer Glu220, Glu224 og Asp283). Nøkkel bindende faktorer som bestemmer HAKRRLIF inkluderer samspillet av Ala2 med sekundær hydrofob lomme, ion sammenkobling og hydrogenbindinger av Lys3, Arg 4 og Arg5 med den sure regionen og en høy grad av komplementaritet av Leu6 og Phe8 med primær lipofile nettstedet. I tillegg er mange hydrogenbindinger bidratt fra peptidryggraden mens Ile7 virker som en avstandsholder rest som tillater optimal kontakt med den primære lommen. Bindingen modus og interaksjoner av HAKRRLIF med CBG er vist i figur 2.
Målretting CBM / CBG protein-protein interaksjon vil hemme kinase aktiviteten CDK2 / cyklin A, CDK2 / cyclin E & CDK4 / cyclin D og dette bør utløse E2F1 mediert apoptose av kreftceller, mens ikke påvirker normale celler 7. Selv CBM avledede peptider er effektive inhibitorer av cellesyklus CDK, er det lite sannsynlig at de vil være nyttige som legemidler på grunn av deres metabolskeustabilitet og generell mangel på celle permeabilitet. For å oppnå dette, har vi søkt BYTT strategi for å konvertere disse potente peptidinhibitorer inn flere narkotika-lignende forbindelser for videre utvikling av anti-tumor terapi utnytter deregulert E2F1 gjennom CDK2 / cyklin En hemming. Følgende protokoll oppsummerer arbeidet som er gjennomført i anvendelsen av BYTT til cyclin groove. I første omgang ble narkotikalignende capping gruppe erstatninger for den N-terminale tetrapeptid av HAKRRLIF identifisert. Videre forbedringer i disse gruppene ble undersøkt i en ekstra valideringsstudie for BYTT. Representative resultatene fra disse studiene er også presentert.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Computational Identifisering av Potential lite molekyl capping Grupper
Merk: I prinsippet kan en rekke tilkoblings eller pharmacophore søkemetoder brukes til å forutsi potensielle capping grupper. Hovedformålet med beregningsstudier i BYTT er å identifisere små molekyler som beholder funksjonene og interaksjoner av aminosyrer som er erstattet.
- Validering av LigandFit docking protokoll 14
Merk: I tidligere studier, forankringsmetode (LigandFit 15, en modul i den molekylære modelleringsprogram suite, Discovery Studio 3,0) ble validert for å sikre at denne algoritmen er tilstrekkelig til å gjengi bindende måter kjent Ncaps og for å vise at de oppnådde resultater for ukjente forbindelser er prediktiv 14.
- Ved å gjøre følgende (1,2 - 1,5), identifisere optimale parametre for LigandFit som følger: PLP1 noERGY grid for positur generasjon, minimering av generert positurer og PLP1 scoring funksjon for analyse av positurer.
- For å begrense conformations innhentet og å posisjonere ligander hensiktsmessig for kovalent binding formasjon i avkortet peptid, satt indolnitrogenet og amid nitrogenatomer av Trp217 og Gln254 henholdsvis som interaksjons filtre for hydrogenbinding.
- Design og forankre et bibliotek av fragment alternativer inn i CDK2 / cyklin En reseptor (2UUE). Prioriter potensielle capping grupper for syntese og kommersiell sourcing basert på PLP1 score, interaksjoner med interaksjons filtre og komplementaritet med CBG. De forskjellige trinnene som er nødvendig for LigandFit docking er som følger.
- Fremstilling av reseptorbindingssetet 14
- Importere CDK2 / cyklin En krystallstruktur (PDB id: 2UUE) i en visualisering vindu i programvaren. Denne strukturen inneholder den tidligere identifiserte FLIP 5-metyl-1-fenyl-1H-1, 2,4-triazol-3-karboksamid (3,5-DCPT) RLIF bundet til cyclin spor (figur 3).
- Slette eller holde på plass restene RLIF (C-terminalen). Når peptidsekvensen blir beholdt, bruker den N-terminale aminogruppe i peptidet som interaksjons filter for liganden. Fra "Receptor-ligand interaksjoner" verktøy, skape en sfære rundt N-cap 3,5-DCPT fra Show / Hide nettstedet sfære. Kulen er opprettet for å definere det aktive område i bindingssetet hvor ligand-reseptor-interaksjoner har lov til å forekomme under bindingen.
- Definer bindingssetet videre fra "finne nettstedet som volumet av valgt ligand" og slette den ligand 3,5-DCPT fra protein. Utføre dette trinn for å definere mengden av binding i det skapes.
- Still indolnitrogenet og amid nitrogen atomer av rester Trp217 og Gln254 som interaksjons filtre for hydrogenbinding. Still interaksjons filtre, slik at bare de positurer som interact med atomer av faste rester vil bli filtrert under dokking prosessen derfor bevare viktige interaksjoner i dokket positurer.
- Utarbeidelse av ligander 14
- Utforme et bibliotek av 100 mulige capping grupper basert på kriterier som molekylvekt mindre enn 500, nærværet av en karboksylatgruppe for ligering med den avkortede peptid og inkludering av egnede hydrofobe grupper (substituert fenyl gruppe) for van der Waals interaksjoner i den sekundære lommen som vist i tabell 1.
- Velg heterocykliske ringer for å etterligne peptid hydrogenbindingsinteraksjoner med Trp217 og substituenter inkludert for å erstatte ionepardannende interaksjoner av basiske sidekjeder av HAKRRLIF. Forankre de ligander som respektive aldehyd-molekyler, slik at karbonyloksygen kan samhandle med det amid-nitrogenatomet i Gln254 lik peptidryggraden i moder peptid (tabell 1).
- Før dockonge, minimere utformet ligander til en lav energi konformasjon og forberede på en hensiktsmessig ionisering tilstand ved hjelp av "Forbered ligander" protokollen. Tegne og eksportere disse potensielle N caps i .sdf filformat i ChemDraw for et regneark før de blir importert inn i programvaren.
Merk: Forbered ligander protokollen brukes til å minimere alle ligander til kai til sitt laveste energi stater og ionisering kostnadene ble brukt til gjeldende atomer. Standardparameterne brukes for dette trinnet.
- Dokking av ligandene inn i et spor 14 syklin
- Velg LigandFit rutine fra reseptor-ligand interaksjoner protokoll sett av programvaren. Bruk reseptoren og de forberedte ligander som grunnlag for denne protokollen.
- For disse runs velger PLP1 som energi nett, spesifisere at poserer være energi minimert og at antallet genererte positurer som 10. La alle de andre parameterne på standardverdiene.
Merk: LigandFit eren forankringsmetode som kan identifisere og generere utgjør av høy komplementaritet og potensiell slektskap med det aktive sete av et protein ved hjelp av en form basert sammenligning filter som er kombinert med en Monte Carlo konformasjonell søkealgoritme. Energien gitter brukes av forankrings programmet er kraftfeltet for generering av ligand-reseptor-interaksjoner og potensielle utgjør. PLP1 er stykkevis lineær potensial som spesifikt prioriterer hydrogenbindingsvekselvirkninger og hvor PLP atom typen er tildelt for hver ikke-hydrogenatom ligand eller ikke-hydrogenatom reseptoren.
- Analyse av resultater
- I første omgang stiller skjerm i visualiseringsprogram og deretter sortere etter synkende verdier av PLP1 poengsum. Bruk poeng funksjoner som PLP1 å beregne bindingsaffiniteten av et forankret ligand basert på en kandidat ligand positur geometri og ikke-kovalent interaksjon med mål-reseptoren strukturen.
Merk: Her ble den PLP1 scoring funksjon funnet å give de beste resultatene som den inneholder en estimering av hydrogenbindinger. - Analyser visuelt topp 25% av de som scoret positurer for 1) superimposability med den kjente capping gruppen (som har en relativ midlere kvadratavvik (RMSD) verdi på mindre enn 2 a), 2) oppfylt interaksjons filtre og 3) visuell komplementaritet med cyclin groove . Det er akseptert at en korrekt forankret positur (sammenlignet med en eksperimentell konstruksjon) har en RMSD verdi på <2 Å.
- Undersøk utgjør for visuell komplementaritet, som er definert som å ha effektiv fylling av binde lommen på en måte som er i overensstemmelse med kjente struktur-aktivitetsforhold. Interaksjonsfiltre er å inkludere atom begrensninger som krever intermolekylære kontakter som er kjent for å være kritiske for binding og / eller kreves for å posisjonere den potensielle capping-gruppen i den korrekte geometri for amid-bindingsdannelse. Tre eksempler på kai positurer av potensielle N-capping grupper gjør hydrogenbindinger med interaction filtre er vist i figur 4.
- I første omgang stiller skjerm i visualiseringsprogram og deretter sortere etter synkende verdier av PLP1 poengsum. Bruk poeng funksjoner som PLP1 å beregne bindingsaffiniteten av et forankret ligand basert på en kandidat ligand positur geometri og ikke-kovalent interaksjon med mål-reseptoren strukturen.
2. Syntese og karakterisering av potensielle N -capping Grupper
- Syntese av N-korkende grupper.
- For syntese, bruke alle kommersielle utgangsmaterialer, løsemidler og reagenser som oppnås. Syntetisere potensielle N-korkende grupper ved konvensjonell syntetisk organisk kjemi (figur 5 12,13 for et eksempel).
- Utføre tynnsjiktskromatografi (TLC) på kiselgel for å overvåke reaksjoner.
- Oppløse utgangsmaterialet og reaksjonsblandingen (1 mg) i den mobile fase og spot dem på TLC-platen ved hjelp av kapillarrør.
- Plasser TLC-platen inn i kammeret som inneholder mobile fase (etylacetat og heksan i et 35:65 forhold). Når den mobile fase når 90% av TLC-platen, fjernes og lufttørkes platen.
- Bruke UV-lys for å detektere utgangsmaterialet og reaksjonsblandinger som er synlige flekker. Calformet, R f på alle stedene (forholdet mellom avstanden som base og den mobile fasen).
Merknad: Reaksjonen er fullstendig når det ikke lenger sees ved Rf av utgangsmaterialet.
- Etter fullførelse av reaksjonen arbeide opp reaksjonsblandingen ved å plassere i en skilletrakt og vasket med vandig syre eller baseløsning etter behov. Samle det organiske oppløsningsmiddel, fordamper den i rotasjonsfordamper, og tørk det urene produkt erholdt under vakuum.
- Oppløs 500 mg råprodukt i 3-5 ml av et egnet løsningsmiddel og legge til et 1 g silisiumdioksyd eller RP18 samplet og tørk under luft. Plasser samplet som inneholder det urene produkt på silika / RP SNAP flash patroner og renser det rå materiale ved hjelp av automatisert høyytelses flashkromatografi (i henhold til produsentens protokoll) ved anvendelse av en SNAP 100 g kolonne med en gradient løpe fra 6% etylacetat: 94 % heksaner til 50% etylacetat og 50% heksaner i løpet15 kolonnevolumer.
- Tørk det rensede produktet oppsamlet i et løsemiddel fra flash-kromatografi ved anvendelse av en rotasjonsfordamper ved fordampning av alt løsningsmidlet til tørrhet og videre tørke produktet under vakuum for å fjerne alle gjenværende løsningsmidler. Utføre karakterisering av det rensede produkt ved NMR, MS og analytisk HPLC.
- For 1H NMR og 13C NMR, veier omtrent 10 mg av den rensede prøven, oppløse den i et passende deuterert løsningsmiddel, og overfører innholdet til et tørt NMR-rør for opptak av NMR-spektra 2,14.
- Spill av 1H NMR og 13C NMR-spektra med en høy felt NMR Spectrometer (minimum 300 MHz). Erverve massespektra bruker en QTOF (Tandem quadruple-en tid av flight massespektrometer), elektro ionisering (ESI) eller en VG 70S (Dobbelt fokus magnetisk sektor massespektrometer, EI) 2,14.
- Analyser renhet av produktene ved HPLC med en diode-array detektor og utstyrt meden C18 (2) 100 A, 250 x 4,6 mm, 5 um kolonnen for analyse. Bruke en gradient løpe fra 100% vann (0,1% trifluoreddiksyre) til 60% acetonitril (0,1% trifluoreddiksyre) i løpet av 30 min og hold gradient i 4 min. Pakk kromatogrammene på 226 og 254 nm 2,14.
Merk: Analytiske renhet av evaluert forbindelser var> 95%.
3. Solid Phase Syntese for generering av knipser 2
- Syntese av N-capped knipser
- Monter N-capped peptidforbindelser gjennom vanlige fast-fase syntese metoder ved hjelp av følgende trinn.
- Aktiver 5 ekvivalenter av den C-terminale aminosyre (Fmoc-Phe) i 4,4 ekvivalenter O -Benzotriazole- N, N, N ', N'-tetrametyl-uronium-heksafluor-fosfat (HBTU, 221,93 mg) i 2 ml DMF i 5 minutter. Laste Fmoc-Phe HBTU blandingen på Rink resin med 6 ekvivalenter av diisopropylethylamin (DIPEA, 103,13mg) i 1 time ved RT.
- Fjerne Fmoc beskyttelsesgruppen fra den C-terminale resten ved anvendelse av 20% piperidin i 3 ml DMF i 10 minutter. Par påfølgende aminosyrer (f.eks, Fmoc-Ile, Fmoc-Leu, Fmoc-Arg-PMC) trinnvis. Ved hvert trinn par 5 ekv av den neste aminosyre med 6 ekvivalenter av DIPEA (103,13 mg) og 4,4 ekvivalenter av HBTU (221,93 mg) i 2 ml DMF i 1 time ved RT.
- Anvende vaskesykluser (5 x 10 ml DMF + 5 x 10 ml DCM) etter aminosyre koblings og Fmoc avbeskyttelsestrinn som er beskrevet ovenfor. Etter peptid montering par N-korkende grupper med 6 ekvivalenter av DIPEA (103,13 mg) og 4,4 ekvivalenter av HBTU (221,93 mg) i 2 ml DMF i 1 time ved RT.
- Ved fullføring av peptid montering, behandler reaksjonsblandingen med 2 ml av den spalting blanding (90: 5: 5 TFA / H2O / TIPS) O / N for å fjerne sidekjedebeskyttende grupper, og spalter Vender fra harpiksen. Triturer det resulterende produkt med kald dietyleter for å felle ut og jegf nødvendig konsentrat i en rotasjonsfordamper.
- Monter N-capped peptidforbindelser gjennom vanlige fast-fase syntese metoder ved hjelp av følgende trinn.
- Syntese av N-capped-C-capped knipser
- Vei og oppløse det N-terminalt avkortet og beskyttet Arg-Leu-peptidet (16,1 mg, 0,02 mmol) i diklormetan, og legge til [4- (3-klorfenoksy) pyridin-2-yl] metanamin (C-cap) sammen med O - benzotriazole- N, N, N ', N' -tetramethyluronium-heksafluorfosfat (HBTU; 16,7 mg, 0,02 mmol) og N, N-diisopropyletylamin (DIPEA; 6,5 mg, 0,02 mmol).
- Rør og overvåke reaksjonen ved romtemperatur inntil TLC / HPLC indikerer fullstendig forbruk av utgangsmaterialet. Etter fullførelse av reaksjonen, konsentrere den rå reaksjonsblanding ved anvendelse av en rotasjonsfordamper og fordel deretter mellom etylacetat og vann.
- Separer den vandige og organiske lag; Vask det organiske lag med 1 N NaOH, 1 N HCl og saltoppløsning. Tørk det organiske lag med omtrent 1 g av natriumsulfat og konsentrerer produktet i rotasjonsfordamper. Finally behandle produktet O / N med spalting blanding (95: 2,5: 2,5 trifluoreddiksyre / H2O / TIPS) for avbeskyttelse.
- Triturer det resulterende produkt med kald dietyleter, og eventuelt konsentrere i rotasjonsfordamper til fullstendig tørrhet for å fjerne alt oppløsningsmiddel. Ytterligere tørke produktet under vakuum for å fjerne alle rester av løsemidler.
- Rensing og karakterisering av knipser
- Rens rå knipser bruker semifremstillings omvendt-fase HPLC-metoder. Lyofilisere de rensede knipser og karakterisere deres molekylvekt ved hjelp av massespektrometri 2,14.
- Bestemme analytisk renhet vendes ved hjelp av HPLC med en diode-array detektor og utstyrt med en C18 (2) 100 A, 250 x 4,6 mm, 5 um-kolonne. Bruke en gradient metode utgående fra 95% H2O (0.1% trifluoreddiksyre) / 5% acetonitril (0,1% trifluoreddiksyre) til 35% H2O (0.1% trifluoreddiksyre) / 65% acetonitril (0,1% trifluoroacetic acid) over 30 min og hold gradient for 4 min. Ekstrakt Kromatogrammer på 226 og 254 nm.
4. FluorescencePolarization Bindingsassay for bestemmelse av Competitive Binding 2,14
- Utføre analysen i svart 384-brønnen (138 pl) plater ved hjelp av følgende prosedyre.
- Fortynn prøvene, tracer peptider (4 nM), og kinase-komplekser (CDK2 / cyklin A - 18 ug / ml, CDK4 / cyklin D - 37 ug / ml) til nødvendige konsentrasjoner i analysebuffer (25 mM HEPES pH 7, 10 mM NaCl, 0,01% Nonidet P-40, 1 mM ditiotreitol (DTT).
- Til hver brønn av 384-brønners plate, tilsett: 5 ul CDK4D1 eller CDK2CA (0,3 ug / brønn renset rekombinant human-kinase kompleks), 5 ul forbindelsesløsningen, 5 ul av 30 nM tracer peptid (fluoresceinyl-AHX-Pro-Val -Lys-Arg-Arg-Leu (3ClPhe) -Gly eller fluoresceinyl-AHX-Pro-Val-Lys-Arg-Arg-Leu-Phe-Gly-peptid tracer). Bruke 5 pl av hver DMSO (6%), buffer, tracer og 5 ul DMSO (6%), kinase-komplekset, tracer som kontrollbrønner
- Etter tilsetningen av alle komponentene, Sentrifuger plate ved 500 rpm i 1 minutt (41,16 x g) ved romtemperatur, og deretter inkuberes platen under omrøring i 45 minutter ved RT. Ved hjelp av en flerplateleser og en detektor utstyrt med 485 nm / 535 nm eksitasjon / emisjonsfiltre og et dikroisk speil lese fluorescein intensiteten til hver brønn i platen.
- Beregn den relative gjennomsnittet polarisering (MP) for alle stikkprøvene ved hjelp av ligningen viser nedenfor. Bestem IC50 verdier av logaritmisk regresjon ved å korrelere relative mps og testing konsentrasjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Interaksjoner av HAKRRLIF med cyclin sporet er vist i figur 2. Peptid-rester som representerer de viktigste determinantene bindings omfatter Ala2, Arg4-, Leu6 og Phe8 med andre rester som gir mindre bidrag 12,13,18. I dette tilfellet studien BYTT strategien har blitt brukt for å finne fragment alternativer for rester i N-terminal tetrapeptid av HAKRRLIF, primært ligne interaksjoner av Ala2 og Arg4-. Et bibliotek av potensielle NCAP fragmenter (tabell 1) ble konstruert basert på kriteriene. Hvert molekyl var forankret i den forlates bindingssetet skapt av avkutting av N-capping gruppe fra sin krystallstruktur med cyklin A (PDB ID: 2UUE). Potensielle ligand alternativer ble valgt basert på positur analyse og PLP1 scoring som en prediksjon av tilhørighet (eksempler på kai positurer er vist i figur 4). Syntesen av en bekreftet NCAP (1- (3-klorfenyl) -5-metyl-1H-1,2,4-triazol-3-karboksylsyre) er vist i figur 5 hvor dette molekylet ble dannet i tre trinn og renset ved automatisert flash-kromatografi (Supplementary figur 1). Den 1H NMR, 13C NMR, MS og HPLC-karakteriseringsdata for en representativ forbindelse 1- (3-klorfenyl) -5-metyl-1H-1,2,4-triazol-3-karboksylsyre er vist i Figurene 1-5 Tilsetnings henholdsvis. Syntesen av N-capped knipser og N-avkortet-C-capped knipser er representert i figur 7 og 8, og karakteriseringsdata er vist i tabell 2. Bindingsaffiniteten for både CDK2 / cyklin A og CDK4 / cyklin D ble bestemt ved anvendelse av den beskrevne FP-analysen, og resultatene er vist i tabell 3. Av de forbindelser som ble testet, inneholdende knipser triazol basert N-hetter ble bestemt til å ha den største affinitet for CDK2 / cyklin A og CDK4 / cyklin D og representativ forbindelses ble testet i cellebaserte analyser. Som helhet, ble FLIP molekyler identifisert funnet å være mer stoff som, og å beholde de fleste av interaksjoner av HAKRRLIF octapeptidet. Avkortet tetrapeptider besatt lavere styrke sammenlignet med HAKRRLIF men var av tilsvarende aktivitet til RRLIF pentapeptid (tabell 3 og 4). Disse resultater viser at forbindelsene som ble oppnådd hadde forbedret medikament likhet, men dette ble oppnådd på bekostning av noe nedsatt bindingsaffinitet.
Den anti-proliferativ aktivitet i disse CGI-ligander ble evaluert og cellulære IC 50 's under 30 um ble observert i U2OS og DU145 kreftcellelinjer.
Figur 1. Oversikt over BYTT strategi. Vennligst cl ick her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. innbinding og interaksjoner av HAKRRLIF i CBG Venstre panel. Modellert strukturen HAKRRLIF bundet til CBG. Den cyclin spor består av to hydrofobe lommer - en større primær lomme (høyre, okkupert av Leu6 og Phe8) og en mindre sekundær lomme (venstre, okkupert av Ala2) og som er brodannet av sure rester som er vist i rødt. Høyre panel: Andre viktige interaksjoner inkluderer hydrogenbindings kontaktene på peptidryggraden (med Trp217, Gln254, Ile281), og ionepardannende interaksjoner av de tre grunnleggende rester av peptidet (med Glu220, Glu224, Asp283). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
441 / 52441fig3.jpg "/>
Figur 3. Binding modus for 3,5-DCPTRLIF i CBG. Binding av 3,5-DCPT-RLIF er vist med hydrogen binding interaksjoner (avbildet av grønne stiplede linjer) med sidekjede atomer av Trp217 og Gln254. Klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Valgt tilkoblings resultater. Dokket positurer av tre representative N-lokking grupper er vist. Hver av disse forbindelsene gjør H-bindinger med interaksjonen filter atomer av Trp217 og Gln254 og som vist ved grønne stiplede linjer. Fenylsubstituenten gjør van der Waals interaksjoner med sekundær hydrofob lomme. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. 
Figur 5. Syntese av 1- (3-klor) -5-metyl-1H-1,2,4-triazol-3-karboksylsyre. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6. Syntese av N-capped knipser etter fast fase syntese. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7. Syntese av N-capped-C-capped knipser. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Tabell 1. Bibliotek av små molekyler forankret og de resulterende spådommer om bindingsenergien bruker PLP1 scoring funksjon.
| Peptide | Purity | Søylemål | Metode | Strømningshastighet | HPLC retensjonstid | Teoretisk MW | Observerte MW |
| 5843 | > 90% | 4,6 × 250 mm | 5-65% acetonitril / vann / 0,1% TFA | 1 ml / min | 23.9 | 732 | 732,6 |
| 5773 | > 90% | 4,6 × 250 mm | 5-65% acetonitril / vann / 0,1% TFA | 1 ml / min | 22.4 | 801,77 | 800,55 |
| 5774 | > 90% | 4,6 × 250 mm | 5-65% acetonitril / vann / 0,1% TFA | 1 ml / min | 24.2 | 767,33 | 766,5 |
| 5762 | > 90% | 4,6 × 250 mm | 5-65% acetonitril / vann / 0,1% TFA | 1 ml / min | 9.0 | 731,91 | 731,65 |
| 5763 | > 90% | 4,6 × 250 mm | 5-65% acetonitril / vann / 0,1% TFA | 1 ml / min | 11.2 | 800,8 | 799,5 |
| 5764 | > 90% | 4,6 × 250 mm | 5-65% acetonitril / vann / 0,1% TFA | 1 ml / min | 10.1 | 766,34 | 765,55 |
| 5771 | > 90% | 4,6 × 250 mm | 5-65% acetonitril / vann / 0,1% TFA | 1 ml / min | 9.4 | 749,9 | 749,6 |
| 5765 | > 90% | 4,6 × 250 mm | 5-65% acetonitril / vann / 0,1% TFA | 1 ml / min | 10.1 | 766,35 | 755,65 |
| 5766 | > 90% | 4,6 × 250 mm | 5-65% acetonitril / vann / 0,1% TFA | 1 ml / min | 9.4 | 761,9 | 761,55 |
| 5767 | > 90% | 4,6 × 250 mm | 5-65% acetonitril / vann / 0,1% TFA | 1 ml / min | 20.4 | 761,9 | 761,55 |
| 5776 | > 75% | 4,6 × 250 mm | 5-65% acetonitril / vann / 0,1% TFA | 1 ml / min | 23.3 | 785,7 | 784,55 |
| 5775 | > 90% | 4,6 × 250 mm | 5-65% acetonitril / vann / 0,1% TFA | 1 ml / min | 9.9 | 751,34 | 750,45 |
Tabell 2. Analytisk Data for CGI peptider og knipser.
Tabell 3. In vitro binding av utvalgte N-capped knipser å CDK2CA og CDK4CD.
Tabell 4. In vitro binding av valgt N & C avkortet knipser å CDK2CA og CDK4CD.
Supplerende Figur 1-5. Rensing og karakterisering av 1- (3-klorfenyl) -5-metyl-1H-1,2,4-triazol-3-karboksylsyre.
Supplerende Figur 1. Flash kromatogram av produktet innhentet fra trinn 1. Det er fire elueringstoppene, de store topp eluering på 55% etylacetat / 45% heksaner ble funnet å være ønsket produkt. Klikk her for å se en større versjon av denne figur.
Supplerende Figur 2. 1HNMR av 1- (3-klorfenyl) -5-metyl-1H-1,2,4-triazol-3-car karboksylsyre. NMR-spektret viser 3 alifatiske metylprotoner og 3 aromatiske protoner. Integrering for alle de tre toppene er vist nedenfor NMR-spekteret. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Supplerende Figur 3. 13C NMR 1- (3-klorfenyl) -5-metyl-1H-1,2,4-triazol-3-karboksylsyre. Det er ti karbonatomer i strukturen, 13C NMR med 10 signaler for hvert karbon atom. Integrasjonen for hver topp er vist nedenfor NMR-spekteret. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
ig4.jpg "/>
Supplerende Figur 4. MS av 1- (3-klorfenyl) -5-metyl-1H-1,2,4-triazol-3-karboksylsyre. Molekylvekten av forbindelsen som er vist som modertopp ved 237. Selve molekylære vekten av det sammensatte er 237,64. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Supplerende Figur 5. HPLC av 1- (3-klorfenyl) -5-metyl-1H-1,2,4-triazol-3-karboksylsyre. Renheten av produktet ble bestemt som 100% som vist ved HPLC-kromatogrammet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Computational Chemistry | |||
| Accelyrs Discovery studio 3.0 | |||
| Dell Optiplex Workstations | |||
| Synthetic Organic Chemistry | |||
| Silica gel (GF-254 plates) for TLC, Biotage (Uppsala, Sweden) for flash chromatography, Waters Alliance 2695 HPLC with a 2996 diode-array detector and equipped with a C18 (2) 100 A, 250 x 4.6 mm, 5 μm column (Phenomenox Luna) for purity determination, 1H NMR and 13C NMR spectra were recorded with a Varian Mercury 300 and 400 Spectrometer, respectively. Mass spectra were measured with a Micromass QTOF (Tandem quadruple-1 time of flight mass spectrometer), electrospray ionization (ESI) and VG 70S (Double-focusing magnetic sector mass spectrometer, EI). | |||
| Flourescence Polarization Assay | |||
| 384 micro well plates, Micro pipets | Grenier Bio-one | 110256602 | |
| CDK4D1 and CDK2CA (well purified recombinant human kinase complex) | BPS Bio Sciences | 40094(CDK4/Cyclin D), 41101(CDK2/Cyclin A) | |
| assay buffer (25 nM HEPES pH 7, 10 mM NaCl, 0.01% Nonidet P-40, 1 mM dithiothretiol (DTT)) | |||
| 25 nM HEPES | CALBIOCHEM | 375368 | |
| NaCl | Fisher | 127838 | |
| Nonidet P-40 | US Biological | N3500 | |
| DTT | Aldrich | ||
| -70 °C freezer | Revco (Ultima II) | ||
| DTX880 multimode detector fitted with 485 nm/535 nm excitation/emission filters and a dichroic mirror suitable for fluorescein | Beckman Coulter, Brea, CA | ||
| Cell Culture | |||
| 96 well plates | Fisher | ||
| Frozen stocks of U2OS (osteosarcoma) and DU145 (prostate cancer) cell lines | ATCC | ||
| NU serum, DMEM media, trypsin, PEN/STRIP, MTT reagent | Fisher, Life technology, Alfa Aesar | ||
| Heamocytometer | VWR | ||
| -70 °C freezer | Revco (Ultima II) | ||
| Incubator | Thermo electron corporation | ||
| Centrifuge | Eppendorf | 5804 R | |
| Refrigerator 4-8 °C | Isotemp Fisher | ||
| DTX880 multimode detector fitted with 595 nm filter | Beckman Coulter, Brea, CA | ||
References
- Andrews, M. J., et al. REPLACE: a strategy for iterative design of cyclin-binding groove inhibitors. Chembiochem. 7, 1909-1915 (2006).
- Liu, S., et al. Optimization of Non-ATP Competitive CDK/Cyclin Groove Inhibitors through REPLACE-Mediated Fragment Assembly. J Med Chem. 56, 1573-1582 (2013).
- McInnes, C. Chapter 29. Annual Reports in Medicinal Chemistry. Bernstein, M., Desai, P. 47, Elsevier. 459-474 (2012).
- Bower, J. F., Pannifer, A. Using fragment-based technologies to target protein-protein interactions. Curr Pharm Des. 18, 4685-4696 (2012).
- Makley, L. N., Gestwicki, J. E. Expanding the number of 'druggable' targets: non-enzymes and protein-protein interactions. Chemical biology, and drug design. 81, 22-32 (2013).
- Walensky, L. D., Bird, G. H. Hydrocarbon-Stapled Peptides: Principles, Practice, and Progress. J Med Chem. , (2014).
- Shapiro, G. I. Cyclin-dependent kinase pathways as targets for cancer treatment. J Clin Oncol. 24, 1770-1783 (2006).
- Thais, M., Sielecki, J. F. B., Enfield, P. A., Trainor, G. l Cyclin dependant kinase inhibitors: Useful targets in cell cycle regulation. Journal of medicinal chemistry. 43, 1-18 (2000).
- Morphy, R. Selectively nonselective kinase inhibition: striking the right balance. J Med Chem. 53, 1413-1437 (2010).
- Chen, Y. N., et al. Selective killing of transformed cells by cyclin/cyclin-dependent kinase 2 antagonists. Proc Natl Acad Sci USA. 96, 4325-4329 (1999).
- Orzaez, M., Gortat, A., Mondragon, L., Bachs, O., Perez-Paya, E.
- Kontopidis, G., et al. Insights into cyclin groove recognition: complex crystal structures and inhibitor design through ligand exchange. Structure. 11, 1537-1546 (2003).
- McInnes, C., Andrews, M. J., Zheleva, D. I., Lane, D. P., Fischer, P. M. Peptidomimetic design of CDK inhibitors targeting the recruitment site of the cyclin subunit. Current medicinal chemistry. Anti-cancer agents. 3, 57-69 (2003).
- Premnath, P. N., et al. Fragment based discovery of arginine isosteres through REPLACE: towards non-ATP competitive CDK inhibitors. Bioorganic, and medicinal. 22, 616-622 (2014).
- Venkatachalam, C. M., Jiang, X., Oldfield, T., Waldman, M. LigandFit: a novel method for the shape-directed rapid docking of ligands to protein active sites. J Mol Graph Model. 21, 289-307 (2003).
- Mendoza, N., et al. Selective cyclin-dependent kinase 2/cyclin A antagonists that differ from ATP site inhibitors block tumor growth. Cancer Res. 63, 1020-1024 (2003).
- Denizot, F., Lang, R. Rapid colorimetric assay for cell growth and survival. Modifications to the tetrazolium dye procedure giving improved sensitivity and reliability. J Immunol Methods. 89, 271-277 (1986).
- Zheleva, D. I., et al. Highly potent p21(WAF1)-derived peptide inhibitors of CDK-mediated pRb phosphorylation: delineation and structural insight into their interactions with cyclin A. The journal of peptide research : official journal of the American Peptide Society. 60, 257-270 (2002).
- Ivanov, A. A., Khuri, K. F. R., Fu, H. Targeting protein-protein interactions as an anticancer strategy. Trends in Pharmacological Sciences. 34, (2013).
- Thayer, A. M.
- Yin, H., Hamilton, A. D. Strategies for targeting protein-protein interactions with synthetic agents. Angew Chem Int Ed Engl. 44, 4130-4163 (2005).
- Jubb, H., Higueruelo, A. P., Winter, A., Blundell, T. L. Structural biology and drug discovery for protein-protein interactions. Trends Pharmacol Sci. 33, 241-248 (2012).
- Cannon, J. B. Pharmaceutics and drug delivery aspects of heme and porphyrin therapy. J Pharm Sci. 82, 435-446 (1993).
