प्रवाह से ल्यूकोसाइट्स भर्ती करने के लिए सूजन अन्तःचूचुक की क्षमता mesenchymal stromal कोशिकाओं द्वारा नियंत्रित किया जाता है। हम प्रवाह से न्युट्रोफिल भर्ती का आकलन और mesenchymal stromal कोशिकाओं इस प्रक्रिया को विनियमित करने में खेलते हैं कि भूमिका की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि प्राथमिक मानव कोशिकाओं को शामिल दो में इन विट्रो मॉडल का वर्णन है।
Stromal कोशिकाओं पड़ोसी endothelial कोशिकाओं के साथ पार बात के माध्यम से सूजन के दौरान ल्यूकोसाइट्स परिसंचारी की भर्ती को विनियमित। यहाँ हम सूजन endothelial कोशिकाओं द्वारा प्रवाह से न्यूट्रोफिल परिसंचारी की भर्ती के अध्ययन के लिए दो में इन विट्रो "संवहनी" मॉडल का वर्णन है। इन मॉडलों का एक प्रमुख लाभ vivo में घटित होता है, के रूप में आदेश ल्युकोसैट आसंजन झरना में हर कदम का विश्लेषण करने की क्षमता है। हम भी दोनों मॉडलों ल्युकोसैट भर्ती को विनियमित करने में, इस मामले mesenchymal स्टेम सेल (एमएससी) में stromal कोशिकाओं की भूमिका का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है कि कैसे का वर्णन।
प्राथमिक endothelial कोशिकाओं Ibidi microslides पर या 24 घंटे के लिए एक Transwell फिल्टर के विपरीत दिशा में सीधे संपर्क में मानव एमएससी के साथ अकेले या एक साथ सुसंस्कृत थे। संस्कृति 4 घंटे के लिए ट्यूमर परिगलन कारक अल्फा (TNFα) के साथ प्रेरित और एक प्रवाह आधारित आसंजन परख में शामिल थे। Neutrophils के एक सांस perfused किया गया था4 मिनट के लिए अन्तःचूचुक पर। न्यूट्रोफिल और अन्तःचूचुक के साथ उनकी बातचीत बहने का कब्जा चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी द्वारा कल्पना की गई थी।
दोनों मॉडलों में, साइटोकाइन उत्तेजना एक खुराक पर निर्भर तरीके से बह न्यूट्रोफिल के endothelial भर्ती में वृद्धि हुई। भर्ती neutrophils के व्यवहार का विश्लेषण रोलिंग में एक खुराक पर निर्भर कमी और अन्तःचूचुक के माध्यम से स्थानांतरगमन में एक खुराक पर निर्भर वृद्धि देखी गई। सह संस्कृति में, एमएससी TNFα उत्तेजित अन्तःचूचुक को न्युट्रोफिल आसंजन दबा दिया।
हमारे प्रवाह आधारित आसंजन मॉडल प्रचलन से ल्युकोसैट भर्ती के प्रारंभिक चरणों की नकल। ल्यूकोसाइट्स के अलावा, वे इस तरह के उपचारात्मक प्रशासित एमएससी या परिसंचारी ट्यूमर कोशिकाओं के रूप में अन्य प्रकार की कोशिकाओं की भर्ती की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। हमारे बहुस्तरीय सह संस्कृति मॉडल एमएससी समर्थक भड़काऊ साइटोकिन्स के लिए उनकी प्रतिक्रिया को संशोधित करने के अन्तःचूचुक के साथ संवाद पता चला है कि, alterineutrophils की भर्ती एनजी। इस तरह के मॉडल का उपयोग इसके अलावा अनुसंधान पूरी तरह से विभिन्न ऊतकों और शर्तों (भड़काऊ विकारों या कैंसर) से कैसे stromal कोशिकाओं को समझने सूजन के दौरान leukocytes की भर्ती को प्रभावित करने के लिए आवश्यक है।
सूजन संकल्प 1,2 अनुमति देने के लिए सूजन के ऊतकों से तंग में ल्युकोसैट प्रविष्टि के नियमन और बाहर निकलने की आवश्यकता है कि सूक्ष्म जीवाणु संक्रमण या ऊतक चोट करने के लिए एक सुरक्षात्मक प्रतिक्रिया है। Endothelial कोशिकाओं (ईसी) कि लाइन रक्त वाहिकाओं, परिसंचारी leukocytes और ऊतक निवासी stromal कोशिकाओं के बीच क्रॉस-टॉक इस प्रक्रिया को तीन समन्वय के लिए आवश्यक है। हालांकि, leukocytes के अनियंत्रित भर्ती और उनके अप्रभावी निकासी पुरानी भड़काऊ रोगों 4 के विकास की आधारशिला हैं। स्वास्थ्य और रोग में ल्युकोसैट भर्ती की हमारी वर्तमान समझ अधूरा है और अधिक मजबूत मॉडल इस प्रक्रिया का विश्लेषण करने की जरूरत है।
पोस्ट-केशिका venules में संवहनी चुनाव आयोग के माध्यम से रक्त से leukocytes की भर्ती का समर्थन तंत्र अच्छी तरह 1,2,5 वर्णित किया गया है। परिसंचारी ल्यूकोसाइट्स विशेष रिसेप्टर्स (जैसे, Vcam -1, ई selectin, पी selectin) द्वारा कब्जा कर रहे हैं, जोसूजन अन्तःचूचुक पर अप-विनियमित रहे हैं। ये क्षणिक बातचीत ल्यूकोसाइट्स सतह बाध्य chemokines और ल्यूकोसाइट्स 6- 11 द्वारा व्यक्त integrins सक्रिय करें कि लिपिड व्युत्पन्न मध्यस्थों (मूल में endothelial या स्ट्रोमल या तो) के साथ बातचीत करने के लिए अनुमति देते हैं। यह बदले में अन्तःचूचुक भर में और ऊतकों को 12- 15 में आसंजन और ड्राइव प्रवास स्थिर। ऊतक के भीतर, ल्यूकोसाइट्स उनके गतिशीलता, समारोह और अस्तित्व 16,17 कि प्रभावित स्ट्रोमल व्युत्पन्न एजेंटों के अधीन हैं भर्ती किया था। बढ़ती सबूत जोरदार संकेतों अगले के लिए भर्ती प्रक्रिया की स्थिति leukocytes के प्रत्येक चरण में प्राप्त किया है कि पता चलता है। हालांकि, ल्युकोसैट भर्ती के बारे में हमारी समझ अधूरा रहता है और बहुत कम ऊतक के भीतर घटकों को आकार देने ल्युकोसैट आंदोलन के बारे में जाना जाता है।
बर्मिंघम में हम से leukocytes की भर्ती का अध्ययन करने के लिए इन विट्रो "संवहनी" मॉडल में कई विकसित किया है9,18,19 प्रवाह। अब हम ल्युकोसैट भर्ती की नाड़ी चुनाव आयोग अधिनियम के रूप में तत्काल नियामकों उनके स्थानीय microenvironment में परिवर्तन करने के लिए जवाब है कि समझते हैं। विशेष रूप से, ऊतक निवासी stromal कोशिकाओं को सक्रिय रूप से भर्ती तीन में उनकी भूमिका को प्रभावित करने के लिए पड़ोसी संवहनी चुनाव आयोग के साथ बातचीत के हिस्से में, भड़काऊ प्रतिक्रिया को नियंत्रित कर सकते। हम पहले विभिन्न stromal कोशिकाओं एक ऊतक विशेष ढंग से आसंजन और leukocytes के माइग्रेशन का समर्थन करने के लिए चुनाव आयोग की क्षमता मिलाना पता चला है कि, और इन प्रभावों पुराने रोगों 13,16,20,21 में बदल हो गया है। इस प्रकार, stromal कोशिकाओं प्रत्येक भड़काऊ प्रतिक्रिया 22 के संदर्भ को परिभाषित ऊतक कि 'पता-कोड' की स्थापना। हाल ही में, हम अस्थि-मज्जा व्युत्पन्न एमएससी (BMMSC) potently दोनों neutrophils की भर्ती में कमी करने के लिए अग्रणी, साइटोकिन्स के लिए चुनाव आयोग की प्रतिक्रिया नीचे विनियमित करने और 23 लिम्फोसाइटों कि प्रदर्शन किया है।
तंत्र शासनerning भर्ती elucidated इन विट्रो काफी हद तक अलगाव में एक एकल कोशिका प्रकार (उदाहरण के लिए, ईसी) या प्रोटीन को शामिल assays के लिए इस्तेमाल किया है। हालांकि, इन अध्ययनों को ध्यान में नहीं लेते स्थानीय ऊतक वातावरण के प्रभाव (यानी, stromal कोशिकाओं की उपस्थिति) leukocytes की भर्ती पर और ऊतकों में उनके बाद माइग्रेशन। यहाँ हम, stromal कोशिकाओं, विशेष रूप से mesenchymal कोशिकाओं स्टेम जिसमें दो प्रवाह आधारित विधियों (एमएससी) का वर्णन चुनाव आयोग 23 के साथ सह-सुसंस्कृत हैं। इस तरह के मॉडल हमें प्रवाह से ल्युकोसैट भर्ती समर्थन करने के लिए विशेष रूप से अपनी क्षमता में endothelial प्रतिक्रियाओं पर stromal सेल का प्रभाव है, जांच करने के लिए अनुमति देते हैं।
यहाँ हम सूजन अन्तःचूचुक द्वारा न्यूट्रोफिल परिसंचारी की भर्ती के अध्ययन के लिए दो में इन विट्रो "संवहनी" मॉडल का वर्णन है। इन मॉडलों का एक प्रमुख लाभ vivo में घटित होता है, के रूप में आदेश ल्युको…
The authors have nothing to disclose.
Umbilical cords were collected with the assistance of the Birmingham Women’s Health Care NHS Trust. HMM was supported by an Arthritis Research UK Career Development Fellowship (19899) and Systems Science for Health, University of Birmingham (5212).
Collagenase Type Ia | Sigma | C2674 | Dilute in 10ml PBS to get a final concentration of 10mg/ml. Store at -20°C in 1ml aliquots. |
Dulbecco's PBS | Sigma | D8662 | With calcium and magnesium chloride. Keep sterile and store at room temperature. |
1X Medium M199 | Gibco | 31150-022 | Warm in 37 °C water bath before use. |
Gentamicin sulphate | Sigma | G1397 | Store at 4°C. Add to M199 500ml bottle. |
Human epidermal growth factor | Sigma | E9644 | Store at -20°C in 10µl aliquots. |
Fetal calf serum (FCS) | Sigma | F9665 | FCS must be batch tested to ensure the growth and viability of isolated EC. Heat inactivate at 56°C. Store in 10ml aliquots at -20°C. |
Amphotericin B | Gibco | 15290-026 | Potent and becomes toxic within a week so fresh complete HUVEC medium must be made up every week. Store at -20°C in 1ml aliquots. |
Hydrocortisone | Sigma | H0135 | Stock is in ethanol. Store at -20°C in 10µl aliquots. |
Collagenase Type II | Sigma | C6885 | Dilute stock in PBS to a final concentration of 100mg/ml. Store at -20°C in 100µl aliquots. |
Hyaluronidase | Sigma | H3631 | Dilute stock in PBS to a final concentration of 20,000U/ml. Store at -20°C in 100µl aliquots. |
100µm cell strainer for 50ml centifuge tube | Scientific Lab Supplies (SLS) | 352360 | Other commercially available cell strainers (e.g. Greiner bio-one) can also be used. |
DMEM low glucose | Biosera | LM-D1102/500 | Warm in 37 °C water bath before use. |
Penicillin/Streptomycin mix | Sigma | P4333 | Store at -20°C in 1ml aliquots. |
25cm2 tissue culture flask | SLS | 353109 | |
75cm2 tissue culture flask | SLS | 353136 | |
Bone marrow mesenchymal stem cells vial | Lonza | PT-2501 | Store in liquid nitrogen upon arrival. Cells are at passage 2 upon arrival but are designated passage 0. Exapand to passage 3 and store in liquid nitrogen for later use. |
Mesenchymal stem cell growth medium (MSCGM) | Lonza | PT-3001 | Warm in 37 °C water bath before use. For Cell Tracker Green staining use medium without FCS. |
EDTA (0.02%) solution | Sigma | E8008 | Store at 4°C. Warm in 37°C water bath before use. |
Trypsin solution | Sigma | T4424 | Store at -20°C in 2ml aliquots. Thaw at room temperature and use immediately. |
Cryovials | Greiner bio-one | 2019-02 | Keep on ice before adding before adding cell suspension. |
Mr. Frosty Freezing Container | Nalgene | 5100-0001 | Store at room temperature. When adding cryovials with cells store at -80°C for 24h before transfrring cells to liquid nitrogen. |
Ibidi u-Slide VI (0.4), T/C treated, sterile | Ibidi | IB-80606 | Alternative models include glass capillaries, Cellix Biochips (www.cellixltd.com), BioFlux Plates (www.fluxionbio.com/bioflux/) and GlycoTech parallel plate flow chambers (http://www.glycotech.com/apparatus/parallel.html). |
Cell tracker green dye | Life technologies | C2925 | Store in 5µl aliquots at -20°C. Dilute in 5ml prewarmed (at 37°C) MSCGM. |
Cell counting chambers | Nexcelom | SD-100 | Alternatively a haemocytometer can be used. |
Cellometer auto T4 cell counter | Nexcelom | Auto T4-203-0238 | |
Tumor necrosis factor α (TNFα) | R&D Systems | 210-TA-100 | Dilute stock in PBS to a final concentration of 100,000U/ml. Store at -80°C in 10µl aliquots. |
6-well, 0.4µm PET Transwell filters | SLS | 353090 | |
K2-EDTA in 10ml tubes | Sarstedt | Store at room temperature. | |
Histopaque 1119 | Sigma | 11191 | Store at 4°C. Warm to room temperature before use. |
Histopaque 1077 | Sigma | 10771 | Store at 4°C. Warm to room temperature before use. |
10ml round bottomed tube | Appleton Woods | SC211 142 AS | |
7.5% BSA Fraction V solution | Life technologies | 15260-037 | Store at 4°C. |
20ml Plastipak syringes | BD falcon | 300613 | |
5ml Plastipak syringes | BD falcon | 302187 | |
2ml Plastipak syringes | BD falcon | 300185 | |
3M hypo-allergenic surgical tape 9m x 2.5cm | Micropore | 1530-1 | Use to secure the syringe tap onto the wall of the perspex chamber. |
Silicon rubber tubing, internal diameter/external diameter (ID/OD) of 1/3mm (thin tubing) | Fisher Scientific | FB68854 | Cut silicon tubing to the appropriate size. All tubing leading directly to the electronic microvalve must be thin. |
Silicon rubber tubing ID/OD of 2/4mm (thick tubing) | Fisher Scientific | FB68855 | |
Portex Blue Line Manometer tubing | Smiths | 200/495/200 | Tubing leading to the syringe pump. |
3-way stopcock | BOC Ohmeda AB | ||
Glass 50ml syringe for pump | Popper Micromate | 550962 | Must be primed prior to use by removing any air bubbles. |
Glass coverslip | Raymond A Lamb | 26x76mm coverslips made to order. Lot number 2440980. | |
Parafilm gasket | American National Can Company | Cut a 26x76mm piece of parafilm using an aluminium template and cut a 20x4mm slot into it using a scalpel 10a. Gasket thickness is approximately 133µm. | |
Two perspex parallel plates | Wolfson Applied Technology Laboratory | Specially designed chamber consisting of parallel plates held together by 8 screws. The lower plate has a viewing slot cut out in the middle and a shallow recess milled to allow space for the coverslip, filter and gasket. The upper perspex plate has an inlet and outlet hole positioned over the flow channel. | |
Electronic 3-way microvalve with min. dead space | Lee Products Ltd. | LFYA1226032H | Electronically connected to a 12 volt DC power supply. |
Syringe pump for infusion/withdrawal (PHD2000) | Harvard Apparatus | 70-2001 | Set the diameter to 29mm and refill (flow) rate. |
L-shaped connector | Labhut | LE876 | To attach to the inlet and outlet ports onto the Ibidi microslide channel. |
Video camera | Qimaging | 01-QIC-F-M-12-C | Connected to a computer which enables digitall videos to be recorded. |
Image-Pro Plus 7.0 | Media Cybernetics | 41N70000-61592 | For data analysis. Manually tag cells displaying the different behaviors. Track cells for analysis of rolling and migration velocities. |
Refer to product datasheets for details on hazards of using the reagents described here. |