Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Анализ влияния стромальных клеток на вербовкой лейкоцитов из потока

Published: January 7, 2015 doi: 10.3791/52480
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 2,3
1School of Clinical and Experimental Medicine, University of Birmingham, 2College of Medical and Dental Sciences, University of Birmingham, 3School of Immunity and Infection, University of Birmingham

Summary

Способность воспаленной эндотелия на работу лейкоцитов из потока регулируется мезенхимальных стромальных клеток. Мы описываем две модели в пробирке, включающие первичные человеческие клетки, которые могут быть использованы для оценки набора нейтрофилов из потока и изучить роль, которую мезенхимальных стромальных клеток играть в регулировании этого процесса.

Abstract

Стромальных клеток регулировать набор циркулирующих лейкоцитов при воспалении через кросс-разговоры с соседними эндотелиальных клеток. Здесь мы опишем два в пробирке моделей "сосудистых" для изучения набора циркулирующих нейтрофилов из потока воспаленной эндотелиальных клеток. Основным преимуществом этих моделей является возможность анализировать каждый шаг в каскаде адгезии лейкоцитов в порядке, как имело бы место в естественных условиях. Мы также описать, как обе модели могут быть адаптированы для изучения роли стромальных клеток, в данном случае мезенхимальных стволовых клеток (МСК), в регулировании набора лейкоцитов.

Первичные эндотелиальные клетки культивировали отдельно или вместе с человеческой MSC в непосредственном контакте на Ibidi microslides или на противоположных сторонах фильтра Transwell в течение 24 ч. Культуры стимулировали фактора некроза опухолей альфа (ФНО) в течение 4 ч и включены в поток на основе анализа адгезии. Болюс нейтрофилов перфузиина эндотелии в течение 4 мин. Захват течет нейтрофилов и их взаимодействия с эндотелия визуализировали фазово-контрастной микроскопии.

В обеих моделях, цитокин-стимуляция увеличилось эндотелия набор протекающих нейтрофилов в зависимости от дозы. Анализ поведения завербованных нейтрофилов показал дозозависимое снижение в прокатных и дозозависимое увеличение в переселении через эндотелий. В совместной культуре, MSC подавляется адгезию нейтрофилов к ФНО-стимулированной эндотелия.

Наши модели, основанные спаек потока имитировать начальные фазы набора лейкоцитов из обращения. В дополнение к лейкоцитов, они могут быть использованы для изучения набора других типов клеток, таких как административные терапевтически MSC или циркулирующих опухолевых клеток. Наши многослойные модели Сотрудничество культуры показали, что MSC общаться с эндотелием, чтобы изменить свой ответ на про-воспалительных цитокинов, Alteriнг вербовку нейтрофилов. Дальнейшие исследования с использованием таких моделей требуется, чтобы полностью понять, как стромальных клеток из различных тканей и условий (воспалительных заболеваний или рака) влиять на вербовку лейкоцитов при воспалении.

Introduction

Воспаление является защитной реакцией на микробной инфекции или повреждения ткани, что требует ужесточения регулирования въезда лейкоцитов в и выход из воспаленной ткани, чтобы разрешение 1,2. Перекрестные помехи между эндотелиальных клеток (ЭК), которые выравнивают кровеносные сосуды, циркулирующих лейкоцитов и тканевых резидентом стромальных клеток имеет важное значение для координации этого процесса 3. Однако, неконтролируемый набор лейкоцитов и их неэффективными оформление лежат в основе развития хронических воспалительных заболеваний 4. Наша нынешняя понимание набора лейкоцитов в норме и патологии является неполным и более надежные модели необходимы для анализа этого процесса.

Механизмы, поддерживающие набор лейкоцитов из крови через сосудистую ЕС в пост венул были хорошо описаны 1,2,5. Циркулирующие лейкоциты захватываются специализированных рецепторов (например, VCAM-1, Е-селектина, Р-селектина), которыйповышается, на воспаленную эндотелия. Эти переходные взаимодействия позволяют лейкоциты взаимодействовать с поверхностными связаны хемокинов и липидов, полученных посредников (как эндотелиальных или стромальных происхождения), которые активируют интегрины, выраженные лейкоцитов 6- 11. Это, в свою очередь, стабилизирует адгезию и диски миграции через эндотелий и в ткани 12-15. В ткани, набранных лейкоциты подвергаются агентов стромальных происхождения, которые влияют на их подвижность, функции и выживания 16,17. Появляется все больше свидетельств наводит на мысль, что сигналы, полученные на каждом этапе в условиях процесса набора лейкоцитов для следующей. Тем не менее, наше понимание набора лейкоцитов остается неполным и очень мало известно о компонентах формования движения лейкоцитов в ткани.

В Бирмингеме мы разработали несколько в пробирке моделей "сосудистых", чтобы изучить набор лейкоцитов оттечь 9,18,19. Теперь мы понимаем, что сосудистые акт ЕС как непосредственные регуляторы набора лейкоцитов реагировать на изменения в их микроокружения. В частности, ткань резидентом стромальные клетки могут активно регулировать воспалительный ответ, в части, беседуя с соседней сосудистой ЕС повлиять на их роль в вербовке 3. Ранее мы показали, что различные стромальные клетки модулировать способность ЕС для поддержки адгезию и миграцию лейкоцитов в ткани-специфическим образом, и что эти эффекты становятся изменены хронических заболеваний 13,16,20,21. Таким образом, клетки стромы установить тканей "Адрес-коды", которые определяют контекст каждого воспалительной реакции 22. Совсем недавно мы показали, что костный мозг происходит MSC (BMMSC) мощно вниз регулировать реакцию ЕС на цитокины, что приводит к снижению в наборе обоих нейтрофилов и лимфоцитов 23.

Механизмы гос, регламентирующими набор освещены в пробирке в основном используется анализов, включающих один тип клеток (например, ЕС) или белок в изоляции. Тем не менее, эти исследования не принимать во внимание последствия локального окружения ткани (то есть, наличие стромальных клеток) о вербовке лейкоцитов и их последующая миграция в ткани. Здесь мы опишем два метода на основе потока, в котором клетки стромы, в частности, мезенхимальные стволовые клетки (МСК), являются совместном культивировании с ЕС 23. Такие модели позволяют исследовать влияние стромы ячейки на эндотелиальные ответов, в частности, их способности поддерживать набор лейкоцитов из потока.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Выделение и культуры первичных человеческих эндотелиальных клеток и мезенхимальных стволовых клеток

  1. Выделение и культивирование человека эндотелиальных клеток пупочной вены (HUVEC):
    1. Положите пуповину на подносе с бумажными полотенцами и спрей с 70% этанола. Место в капот культуры ткани. Определить вену и иглу на обоих концах. Поместите хомут вокруг канюлированного конце, чтобы закрепить его.
    2. Промойте венозную кровь с PBS с помощью шприца. Заполните шприц с воздухом и пройти через вены удалить и уничтожить остаточную PBS.
    3. Оттепели 10 мг / мл коллагеназы типа Ia и разбавленным 1:10 в PBS (с кальция и хлорида магния) до конечной концентрации 1 мг / мл. Pass раствором коллагеназы в вену, пока обе канюли не будут заполнены. Закрыть зажимы на канюли на обоих концах.
    4. Накройте лоток с тканью и распылите с 70% этанола. Поместите шнур в инкубаторе в течение 20 мин при 37 ° С и 5% СО 2.
    5. Возьмите шнур изинкубатора и затяните хомуты. Массаж шнур аккуратно в течение 1 мин. Промыть клеточной суспензии с 10 мл PBS и собирают в 50 мл центрифужную пробирку.
    6. Заполните шприц с воздухом и пройти через вену, чтобы удалить остатки PBS в два раза, собирая PBS в 50 мл центрифужную пробирку, используемого на стадии 1.1.5. Центрифуга при 400 х г в течение 5 мин при комнатной температуре.
    7. Отберите супернатант и ресуспендируют осадок в 1 мл полной среды EC. Средней ЕС состоит из M199 с добавкой 35 мкг / мл гентамицина сульфата, 10 нг / мл человеческого эпидермального фактора роста, 1 мкг / мл гидрокортизона, 2,5 мкг / мл амфотерицина В, и 20% фетальной телячьей сыворотки.
    8. Добавить 4 мл среды EC и подвески ЕС в 25 см 2 колбу. Изменение среды на следующий день, а затем каждые 2 дня.
    9. EC проявляют булыжника, как морфология (рис 1ai). Для приклеивания анализов, ЕС, как правило, высевают, когда они достигают 100% слияния (см раздел 1.4
  2. Выделение желе мезенхимальных стволовых клеток Уортона (WJMSC) из пуповины человека:
    1. Изолировать желе, полученных MSC Уортон (WJMSC) из свежих пуповины или шнуров, которые уже были использованы, чтобы изолировать ЕС. Вырезать пуповину в 5 см длиной штук. Разрежьте каждый кусок в продольном направлении, чтобы выявить кровеносные сосуды (2 артерии [белый, жесткий] и 1 вену [желтый, растянутый]).
    2. Использование стерильных ножниц и щипцов удалить кровеносные сосуды и выбросить. Вырезать все ткани в 2 - 3 мм 3 шт. Использование щипцов 2 место - 3 мм 3 шт в 50 мл центрифужную пробирку.
    3. Оттепель 100 мг / мл сток коллагеназы типа II и разбавленной 1: 100 в 10 мл PBS до конечной концентрации 1 мг / мл. Оттепель 20000 U / мл стоковый гиалуронидазу и разбавленной 1: 400 до конечной концентрации 50 ед / мл в растворе коллагеназы.
    4. Добавить ферментативной коктейль в центрифужную пробирку, содержащую фрагменты ткани. Инкубируйте ткани ФрагменаTS в течение 5 ч при 37 ° С на медленном ротатора.
    5. Развести клеточной суспензии 1: 5 в ФБР. Поместите мкм пор фильтра 100 в новый 50 мл центрифужную пробирку. Налейте клеточной суспензии на пор фильтра 100 мкм.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Оставшееся фрагментов ткани будут сохранены на фильтре и клетки будут собраны в 50 мл центрифужную пробирку.
    6. Отменить фильтр. Центрифуга клеточной суспензии при 400 х г в течение 10 мин при комнатной температуре. Аспирируйте супернатант и ресуспендируют осадок WJMSC в 12 мл полной культуральной среды WJMSC (DMEM низкий уровень глюкозы, 10% FCS и 100 ед / мл пенициллина + 100 мкг / мл стрептомицина Mix).
    7. Семенной все клетки в 75 см 2 тканевой культуральной колбы. Смена носителя после 24 ч с 12 мл в комплекте WJMSC культуральной среде. Замените среду каждые 2 - 3 дня. Клетки должны достичь 70 - 80% слияния в течение 2 недель. Прохождение когда WJMSC до 70 - 80% слияния (см раздел 1.4).
  3. Расширение мозга, полученных MSC кости (BMMSC): Изолировать человека из костного мозга MSC (BMMSC), как описано ранее 24. Добавить 10 мл предварительно нагретой среды роста MSC (MSCGM) в 15 мл центрифужную пробирку.
  4. Оттепель флакон p2 BMMSC путем размещения на водяной бане 37 ° С в течение 2 мин. Добавить подвеску BMMSC в центрифужную пробирку, содержащую MSCGM. Все хорошо перемешать с помощью пипетки.
  5. Центрифуга при 400 х г в течение 5 мин при комнатной температуре. Отберите надосадочной жидкости полностью.
  6. Ресуспендируют клеток в 1 мл MSCGM и подсчет клеток с использованием гемоцитометра или цифровой счетчик клеток, таких как cellometer.
  7. Семенной клеток в 75 см 2 колбы для культивирования при плотности 5000 - 6000 клеток на см 2 в 12 мл MSCGM. Смена носителя после 24 ч с 12 мл MSCGM. Кормовые клетки с 12 мл MSCGM каждые 2 - 3 дней.
  8. Прохождение когда BMMSC до 70 - 80% слияния (см раздел 1.4). Клетки обладают фибробластов морфологию (рис 1Aii).
  • Отряд ЕС и MSC: Отберите среду из 25 см 2 колбах культуры. Добавить 2 мл 0,02% ЭДТА в течение примерно 2 мин. Аспирируйте ЭДТА и добавить 2 мл трипсина (2,5 мг / мл). Посмотреть под микроскопом, пока клетки не становятся круглыми.
  • Нажмите на колбу для отделения клеток. Инактивации трипсина путем добавления 8 мл культуральной среды (в зависимости от типа клеток; средний EC для ЭКПВЧ, DMEM LG Для WJMSC и MSCGM для BMMSC) в колбу культуры и переноса суспензии в 15 мл центрифужную пробирку.
  • Центрифуга при 400 х г в течение 5 мин при комнатной температуре. Аспирируйте супернатант и ресуспендируют осадок, как описано ниже.
    1. Для пассирования MSC, ресуспендируют осадок в 3 мл культуральной среды. Добавить 11 мл культуральной среды в трех отдельных 75 см 2 колбах культуры. Добавить 1 мл суспензии клеток в каждую колбу культуры (1: 3) разделенного. Прохождение WJMSC и BMMSC 3 раз (P3) перед использованием в совместной культуре анализов.
    2. Для посева ЕС или магистра в области адгезии анализов - см Разделы 2 и 3.
  • Замораживание MSC:
    1. При прохождении 3 отсоединения MSC, как описано в разделе 1.4. Аспирируйте супернатант и ресуспендируют в 3 мл охлажденной льдом CryoSFM. Пипетка 1 мл аликвоты клеточной суспензии в 1,5 мл охлажденного льдом криопробирки. Поместить криопробирки в контейнере замерзания.
    2. Хранить контейнер при температуре -80 ° CO / N. Переход к жидким азотом. Оттепель флакон MSC (выполните шаги 1.3.1 - 1.3.6). Ресуспендируйте MSC в 5 мл культуральной среды (выберите соответствующую среду для WJMSC или BMMSC) и семя в 25 см 2 колбу.

    • 2. Создание эндотелия мезенхимальные стволовых клеток сокультурах на Ibidi Microslides

    1. Trypsinize Конфлюэнтную 25 см 2 колбу ЕС (~ 1,5 х 10 6 клеток; в качестве раздела 1.4). Ресуспендируйте EC в 380 мкл MSCGM (1 х 25 см 2 колбу будет сеять два 6-канальных Ibidi microslides (~ 1,25 х 10 5 / канал), для приклеивания анализов все ячейки тиPES культивируют в MSCGM). Добавить 30 мкл суспензии ЕС к каждому каналу (это покроет площадь роста за счет капиллярного действия). Выдержите Ibidi microslide при 37 ° С и 5% CO 2 в течение 1 часа.
    2. Добавить 140 мкл MSCGM для каждого канала, а затем аспирации его. Повторите два раза в общей сложности 3 стирок. Добавить 140 мкл MSCGM и место в инкубаторе при 37 ° С и 5% CO 2 в течение 24 часов.
    3. Для сокультурах снять MSC (раздел 1.4). Выполните подсчет клеток с помощью гемоцитометра или cellometer. Отрегулируйте концентрацию MSC 1,5 х 10 5 клеток / мл.
    4. Аспирируйте избыток среды из каналов Ibidi (оставив только области роста канала в среде). Добавить 30 мкл суспензии MSC к каналам Ibidi. Аспирируйте среду, что был извлечен из зоны роста канала и добавить еще 30 мкл суспензии MSC. Повторите еще ​​раз, а затем поместить microslide Ibidi в инкубаторе при 37 ° С и 5% CO 2 </ SUB> в течение 1 часа.
    5. Добавить 140 мкл MSCGM для каждого канала, а затем аспирации его. Повторите два раза в общей сложности 3 стирок. Добавить конечного объема 140 мкл MSCGM к каждому каналу и место в инкубаторе при 37 ° С и 5% CO 2 в течение 24 ч.
    6. Оттепель 1 х 10 5 ед / мл TNF-alpha запаса и разбавленной 1: 1000 в MSCGM до конечной концентрации 100 ед / мл (эквивалент ~ 10 нг / мл). Выполнение последовательного разбавления путем разбавления 100 ед / мл TNF & alpha; в 1:10 в MSCGM, чтобы получить 10 ед / мл. Развести 10 U / мл TNF & alpha; в 1:10 в MSCGM, чтобы получить 1 Ед / мл.
    7. Treat каналов с ФНО при 37 ° С в течение 4 ч перед анализом. Температурные колебания во время лечения цитокинов изменит моделей набора нейтрофилов наблюдали. Добавить свежие MSCGM с необработанными каналами.

    3. Создание эндотелия мезенхимальных стволовых клеток сокультурах на фильтрах

    1. Снять WJ или BMMSC, как описано в разделе 1.4. Ресуспендируют гранулв 1 мл MSCGM. Выполните подсчет клеток клеток с использованием гемоцитометра или cellometer.
    2. Отрегулируйте уровень громкости, чтобы конечная концентрация 5 × 10 5 MSC в 500 мкл MSCGM.
    3. Использование стерильного пинцета инвертировать 6-а, 0,4 мкм ПЭТ Transwell фильтры и место в стерильном боксе.
    4. Семена 5 × 10 5 MSC на наружной поверхности фильтров. Выдержите фильтры при 37 ° С и 5% CO 2 в течение 1 часа.
    5. Сбор носитель из наружной поверхности фильтра. Подсчитайте количество неадгезированных MSC в средствах массовой информации. Re инвертировать фильтры с использованием стерильного пинцета и место в совпадающим 6-луночного планшета, содержащего 3 мл MSCGM.
    6. Добавить 2 мл MSCGM на внутренней поверхности фильтра (Фиг.1В). Место в инкубаторе при 37 ° С и 5% CO 2 в течение 24 часов. Trypsinize Конфлюэнтную 25 см 2 колбу ЕС (рис 1ai; в качестве раздела 1.4).
    7. Ресуспендируют ЭК в 8 мл MSCGM (1 х 25 см 2 колбу WiLL семян четыре фильтра 6-а; ~ 5 х 10 5 EC / фильтр). Аспирируйте среды из верхней и нижней пористых фильтров. Добавить 3 мл свежего MSCGM в нижнюю камеру (под фильтром). Добавить 2 мл EC суспензии к внутренней поверхности каждого фильтра. Инкубировать в течение 1 ч при 37 ° С и 5% СО 2.
    8. Отберите среднего смыть неадгезированных ЕС и заменить свежим MSCGM. Установка параллельных EC моно-культуры фильтры путем посева клеток на внутренней поверхности без первого посева MSC. Инкубируйте O / N при 37 ° С и 5% СО 2.
    9. Убедитесь, что монослой ЭК сливной и не содержит пробелов. Суб-сливные монослои не может быть использована для адгезии анализов (фиг.1В).
    10. Лечить верхние и нижние палаты фильтров с 1, 10 или 100 ЕД / мл ФНО (эквивалент ~ 10 нг / мл) при 37 ° С в течение 4 ч до анализа (описанного в разделе 2).

    4. Выделение лейкоцитов

    1. Возьмите венознойКровь от здоровых добровольцев и аликвоты сразу в ЭДТА пробирки. Обратить трубки осторожно перемешать.
    2. Слой 2,5 мл Histopaque 1077 на 2,5 мл Histopaque 1119 в 10 мл с круглым дном трубки. Уровень 5 мл цельной крови на градиенте Histopaque. Центрифуга при 800 х г в течение 40 мин при комнатной температуре.
    3. Урожай периферийные полиморфноядерных нейтрофилов (ПМН) на границе раздела Histopaque 1077 и 1119 (выше эритроцитов слоя). Место в 10 мл с круглым дном трубки и составляют до 10 мл PBSA. Осторожно инвертировать трубку и центрифуге при 400 х г в течение 5 мин при комнатной температуре.
    4. Развести 7,5% раствор BSA 1:50 в 100 мл PBS (с кальция и хлорида магния) до конечной концентрации 0,15% (вес / объем; PBSA). Отберите супернатант и ресуспендируют в 10 мл PBSA. Центрифуга при 400 х г в течение 5 мин при комнатной температуре.
    5. Ресуспендируют в 1 мл PBSA. Возьмем 20 мкл аликвоты клеточной суспензии и добавить к 380 мкл PBSA (1:20 разведение). Граф клеток с использованием гемоцитометра или cellometer. Разбавить до требуемой Concentration (1 х 10 6 / мл для Transwell фильтров и Ibidi microslide) в PBSA. не Поддержание суспензии нейтрофилов при комнатной температуре до анализа.

    5. Сборка Проточная система

    1. Настройте систему потока, как показано на рисунке 1С. Включите нагреватель и установлен на 37 ° C. Прикрепите 20 мл шприц (удалить поршень) и 5 ​​мл шприц с 3-ходовым краном. Прикрепите кран с камерой оргстекла с использованием микропоры ленты.
    2. Отмерьте и отрежьте длинный кусок кремния 2/4 мм (толщина) трубки, составляет примерно расстояние между клапаном и 3-х ходового крана. Вырезать 8 - 10 мм длинный кусок 1/3 мм (тонкий) трубы и вставки в один конец трубы с толщиной. Прикрепите толстой боковой трубки на 3-полосная крана.
    3. Подключите тонкий конец трубки на порту электронной 3-полосная microvalve. Это "Бачок омывателей". Вырезать 6 A - 8 мм длинный кусок толстой и тонкой трубки.
    4. Вставьте тонкую трубку в один конец толстой трубы. AttАХ толщиной трубы заканчиваются на 2 мл шприц (удалить поршень).
    5. Подключите тонкий конец трубки шприца 2 мл на порту электронной microvalve сделать "образец резервуар». Подключите клапан в камеру потока фильтра путем измерения и резки длинный кусок тонкой трубки, которая Расстояние между microvalve и в центре столик микроскопа.
    6. Для модели microslide, приложите 8 - 10 мм кусок толстой трубки к концу тонкой трубки. Разместить Г-образный соединитель до конца толстой трубы. Это будет подключаться к microslide. Для модели фильтра, прикрепить 8 - 10 мм кусок Portex Голубой линии Манометр соединительный трубопровод к концу тонкой трубки.
    7. Поместите тонкий конец трубки на microvalve. Это общий выход для стирки и образцов водоемов. Заполните резервуары с PBSA. Премьер-трубки при протекании PBSA через них, чтобы удалить пузырьки воздуха.
    8. Прикрепите Манометр труб в 29 мм (50 мл) стекла сyringe. Председатель шприц, заполнив 10 мл PBSA. Invert шприц так, чтобы конец соединен с трубкой обращена вверх и вытолкнуть все воздушные пузыри. Залейте 5 мл PBSA.
    9. Только для модели microslide, прикрепить 10 - 12 мм кусок толстой трубки к концу трубки манометра, ведущей к стеклянной шприца. Разместить Г-образный соединитель на конце толстой трубы. Поместите стеклянный шприц в шприцевой насос для инфузий / вывода.
    10. Рассчитайте коэффициент пополнения потока (Q), необходимые для создания напряжения сдвига желательно стены (τ W в Паскале, ПА) 0,1 Па (Transwell фильтров) или 0,05 Па (Ibidi microslides) с использованием следующих формул:
      γ = ш (6.Q) / (WH 2)
      τ = n.γ
      Там, где W = внутренняя ширина и Н = внутренняя глубина канала потока. N = вязкость протекающего раствора; PBSA п = 0,7 мПа Для проточную камеру плоскопараллельной пластины фильтра, ширина (W) составляет 4 мм, а глубина (Н) 0,133 мм. Depth камеры могут незначительно отличаться из-за различий в толщине прокладки Parafilm используется. Для microslide Ibidi, ширина 3,8 мм, а глубина 0,4 мм.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за разницы в размерах проточного канала и динамики захвата мы используем различные напряжения сдвига для модели microslide по сравнению с фильтром модели 6.

    6. Настройка параллельных пластин проточной камеры, включающих фильтры

    1. Отрежьте кусок парафильмом (те же размеры, как покровного стекла), используя шаблон металла. Вырежьте 20 х 4 мм разъем в парафильмом (чтобы создать канал для потока), используя шаблон металла. Используйте прокладку, чтобы отметить канал потока на покровного стекла.
    2. Выровняйте края фильтра 6-а на покровного стекла. Убедитесь, что фильтр покрывает маркировки канала для потока. Аккуратно вырежьте из фильтр с помощью типа 10A скальпель.
    3. Тщательно покрыть фильтр с прокладкой Parafilm, гарантируя, что канал потокаГнездо в середине фильтра (фиг 1D). Используйте кусок чистой ткани и вытолкнуть пузырьков.
    4. Поместите покровное в выемке на нижней пластине проточную камеру Perspex. Наложите верхнюю плексигласовую пластину поверх прокладки и винт пластины вместе (рис 1D).
    5. Поверните 3-позиционный кран, чтобы дать моющего буфера (PBSA) течь через клапан. Подключение манометра трубку к впускному отверстию в верхней Persex пластины. Запуск PBSA через проточный канал, чтобы пузырьки, чтобы пройти.
    6. Подключение трубки манометра из шприца в выпускному отверстию Perspex пластины. Установите шприцевой насос, чтобы пополнить и тираж. Очистить любую PBSA который капает на верхней пластине камеры.
    7. Поместите камеру на сцене перевернутого фазово-контрастной микроскопии. Настройте фокус визуализировать выше фильтров ЕС (рисунок 1b).

    7. Установка Microslides для подачи </ P>

    1. Поместите microslide на сцену контрастного микроскопа инвертировать фазы. Подключите Г-образный разъем в порт канала. Запуск PBSA через проточный канал.
    2. Поместите Г-образный соединитель из шприца в выходной порт канала. Установите шприцевой насос, чтобы пополнить и тираж. Очистите PBSA что капала на microslide. Настройте фокус для визуализации монослоя ЕС.

    8. перфузии Лейкоциты За эндотелиальных клеток

    1. Поместите 2 мл очищенных нейтрофилов в резервуар образца и оставить нагреваться в течение 2 мин. Вымойте эндотелий с PBSA в течение 2 мин.
    2. Поверните клапан на заливать нейтрофилов более эндотелия. Доставка нейтрофилов болюс 4 мин. Поверните клапан OFF и заливать PBSA из промывных резервуара для остальной части эксперимента.
    3. Убедитесь, что воздушные пузырьки не проходят через канал потока в любой точке во время теста, так как это нарушит monolay ЕСэ и причиной отряд прикрепленных нейтрофилов.

    9. Запись нейтрофилов Capture и поведение

    1. Запись набора нейтрофилов либо во время нейтрофилов потока или после перфузии.
    2. Сделать все цифровые записи, по крайней мере 5 - 10 полей в центре канала потока. Определение центра канала, перемещая цели к краю канала на входной порт и идентификации середину порта.
      1. Для записи во время нейтрофилов потока, получать изображения в одном поле каждые 10 секунд в течение 1 мин. Двигайтесь вдоль канала и записать еще одно поле в течение 1 мин. Повторите эти действия для продолжительности болюса.
      2. Для записи пост-перфузии, чтобы 10 сек запись 5 - 10 полей по центру канала потока для оценки поведения лейкоцитов (обычно 2 мин после того, как в конце нейтрофилов болюса). Возьмите изображений каждую секунду в течение интервала 10 сек. Это позволяет достаточно времени для захвата с потока и поведения приверженцем НейтроPhils быть проанализированы.
      3. Запись одно поле, содержащее, по меньшей мере 10 Переселенные нейтрофилов в течение 5 мин, с изображений каждые 30 сек. Это может быть использовано, чтобы вычислить скорость мигрировавших клеток (либо выше или под эндотелием).
      4. Запишите еще одну серию 10 сек полей (обычно 9 мин после перфузии). Это позволяет нейтрофилы время мигрируют через монослой эндотелиальных.
      5. Остановите шприцевой насос и снимите трубку. Разберите проточную камеру и промойте резервуар образца и труб. Повторите эти действия для последующих фильтров / microslide каналов.

    10. Анализ лейкоцитов вербовки и поведения

    1. Подсчитайте количество нейтрофилов в каждой области в течение 10 сек записи в момент времени 2 мин. Все клетки должны присутствовать в первой второй области для того, чтобы рассчитывать. Клетки, которые частично в области от 2 сторон (например, верхняя / правая границы) поля зрения, включены вГрафы, до тех пор, пока они остаются в области в течение всего 10 секунд.
    2. Рассчитайте среднее число примыкающих нейтрофилов в поле зрения. Измерить длину и ширину записанной области. Вычислить площадь области. Подсчитайте, сколько полей есть в 1 мм 2. Умножьте среднее количество нейтрофилов по количеству полей в 1 мм 2.
    3. Рассчитать общее количество нейтрофилов перфузии путем умножения количества нейтрофилов перфузии (например, 2 × 10 6 / мл * В [например, 0,0999 мл / мин для проточной камеры с параллельными пластинами]) по продолжительности болюса (например, 4 мин ).
    4. Разделить нейтрофилов / мм 2, на общее число нейтрофилов перфузии, чтобы определить общее количество клеток, которые придерживались (адгезивных клеток / мм 2/10 6 перфузии).
    5. Оценка того, насколько прилипшие нейтрофилы прокат, твердо сторонником или переселены (Дополнительный Видео 1 и 2).
      1. прокатки нейтрофилов фазе яркий и будет медленно двигаться вдоль эндотелия монослоя (1 - 10 мкм / сек; Дополнительный видео 1).
      2. Плотно прилипшие клетки этап яркий и связанной с поверхностью ЕС, либо остается неподвижным (т.е., не двигаясь во время записи) или произошли серьезные изменения формы и миграции по поверхности EC (рис 1ei).
      3. Переселилась нейтрофилов фаза темно и ниже слоя EC (рис 1Eii).
    6. Рассчитать процент адгезивных клеток, которые катятся, стационарные и переселилась. Кроме того, нейтрофилов поведение может быть выражено как общего количества клеток, которые обладают в разных режимах с применением ту же формулу, используемую для расчета общего адгезии (как описано в шагах 10,6 - 10,7).
      1. Отметить передний край подвижного нейтрофилов. Отметьте передний край и той же клетке в конце последовательности 10 сек. Нарисуйте линию ставкуWEEN 2 очка и измерить расстояние, которое клеток пройденное.
      2. Разделить это значение длительности записи, в ​​котором клетка прокатки (т.е. 10 сек). Попробуйте и выберите нейтрофилы, которые находятся в области в течение всего интервала 10 сек.
    7. Для расчета скорости нейтрофилов, мигрирующих по поверхности (в форме измененная фаза ярко) или под эндотелия (фаза темноте) использовать 5 мин записи (дополнительные видео 2).
      1. Draw наброски мигрировавших клеток в начале последовательности, и отслеживать их перемещения по всей последовательности. Обратите внимание на Х и Y позиции центра тяжести в каждом интервале 1 мин для каждой ячейки. Вычтите значения X и Y позиции с первого изображения последовательности из значений во втором изображении. Это основано на теореме Пифагора.
      2. Вычтите значения из второго изображения с третьего изображения. Сделайте это для всех изображений в последовательности. Площадь тон X и Y. и добавить их вместе.
      3. Квадратный корень результирующее значение. Вычислить скорость для каждой ячейки путем усреднения скорости, рассчитанные на каждом минутном интервале. Track 10 мигрировали нейтрофилов и рассчитать среднюю скорость.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    Первоначально, мы проанализировали влияние стимулировать ЕС с TNF, о вербовке нейтрофилов из потока с использованием модели microslide Ibidi (раздел 7 - 9). При отсутствии ФНО, мало, если какие-либо нейтрофилы прикреплен к эндотелиальной монослоя (фиг.2А). Этого следовало ожидать, так как лечить / отдыха EC не выражают необходимые молекулы адгезии (Селектины) или хемокины, чтобы поддержать связывания 25,26. В отличие от этого, цитокин-стимуляции значительно увеличилось адгезию нейтрофилов к эндотелию в зависимости от дозы (фиг.2А). Адгезия обычно остается стабильным в течение анализа. Связывание лейкоцитов в необработанной эндотелия означает, что либо ЕК активируются (т.е., загрязненных ЛПС в процессе культивирования) и / или нейтрофилов были активированы в процессе выделения. Действительно, LPS было показано, увеличивают экспрессию Е-селектина, ICAM-1 и VCAM-1 25-27 на поверхности ЭК, что позволяет им связывать нейтрофилы.

    При анализе поведения завербованных нейтрофилов обычно мы наблюдаем снижение зависимости от дозы в процентах нейтрофилов прокатки (рис 2б) с сопутствующим дозозависимое увеличение процента нейтрофилов, мигрирующих через эндотелиальной монослоя (рис 2С). На более низких дозах TNF-альфа стимуляции (1 ед ​​/ мл) в большей пропорции нейтрофилов появляются фазы яркий, указывающий, что они прикреплены к апикальной поверхности эндотелия (фиг.2В). В отличие от этого, в 10 и 100 ЕД / мл (более высокие дозы) приблизительно на 40% из набранных нейтрофилов появляются фазы темно на 2 мин, указывающий, что эти клетки мигрируют через монослой эндотелиальных и под эндотелием (фиг.2с). Нейтрофилы способны мигрировать через ЕС в течение 1 - 2 мин, с переселения достигает мУровни aximal на ~ 10 мин после перфузии 28. Здесь мы наблюдали увеличение нейтрофилов перерождений от 40% до 2 мин до 60% на 9 мин после перфузии (фиг.2с). Мы не наблюдали никакого эффекта от концентрации ФНО от скорости прокатки (~ 3 мкм / сек) или миграции (~ 10 - / мин 12 мкм) нейтрофилов.

    В модели на основе фильтра, ФНО-стимуляции увеличилась адгезию нейтрофилов в зависимости от дозы аналогичного тому, которое наблюдалось с использованием модели microslide Ibidi (фиг.3А). С точки зрения поведения, нейтрофилов прокатки была не зависит от дозы ФНО (фиг 3б), в то время как увеличение зависит от дозы, в процентах перерождений наблюдалось (фиг.3С). В этой серии экспериментов мы не наблюдали существенного влияния времени на нейтрофилов переселения (рис 3C).

    Мы предоставляем методы, как собрать две разные конструкции совместно культуры, каждый изкоторый разработал для ответа на конкретные вопросы. В microslide модели Ibidi, ЕС и MSC культивируют в одном монослое в непосредственном контакте друг с другом. Эта модель полезна для изучения влияния терапевтического введения МСК в кровь и их последующей интеграции в монослое ЕС. В отличие в модели фильтра на основе, ЕС и MSC культивируют на противоположных сторонах фильтра в непосредственной близости, но не обязательно в непосредственном контакте. Это больше напоминает ткань, при эндотелиальные клетки формируют монослой, представл кровеносный сосуд, и MSC, проживающих в субэндотелиальном отсека. Это позволяет нам изучить влияние ткани резидентом MSC от реакции ЕС на цитокинов стимуляции.

    Основываясь на нашем опыте, мы видим, что максимальная набор нейтрофилов и трансэндотелиальный миграция происходит, когда ЕС стимулировали с 100 Ед / мл ФНО. Таким образом, мы использовали эту концентрацию, чтобы исследовать влияние MSC сокультурена эндотелиальную набора нейтрофилов из потока. Здесь мы приведем данные для BMMSC в совместной культуре с ЕС с помощью microslide и модели, основанной на фильтре однако, и другие типы MSC также могут быть рассмотрены например, WJMSC. В обеих моделях наличие BMMSC значительно уменьшить адгезию нейтрофилов к ЕС, по сравнению с ЭК культивировали в одиночку (фиг.4а). Co-культура не оказывает никакого влияния на поведение, набранных нейтрофилов, с аналогичными уровнями прокатки и переселение наблюдается на ЕС культивировали в одиночку или с MSC (рис 4В и C). Таким образом, MSC может изменить реакцию ЕС на цитокинов стимуляции, которая подавляет их способность поддерживать набор нейтрофилов из потока.

    Рисунок 1
    Рисунок 1. Создание EC-MSC совместно культуры и анализа набора нейтрофилов с помощью потока на основе адгезии анализа. () (I) первичного ЕС и (II) прохождение 3 BMMSC выращивают на колбу с тканевой культурой. (В) Микрофотография ЕС и MSC культивировали на 6-луночные Transwell фильтрующие элементы. (С) Схема системы перфузии используется для генерации Поток. (D) Схематическое представление камеры параллельного потока пластины фильтра. (Е) Микрофотография (I) прочно прилипший (FA) и (II) Переселенные (TM) нейтрофилы следующие набор из потока, чтобы ЕС стимулировали 100 ед / мл TNF & alpha; . Изображения C и D взяты из рисунках 2 и 3 методов молекулярной биологии:. T-клеток с торговлей, 2010, стр 53-54 28 с любезного разрешения Springer науки и Business Media Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенное фигура.


    . Рисунок 2. нейтрофилов набора из потока, чтобы ФНО-стимулированного EC использованием Ibidi microslides ЕС стимулировали с увеличением концентраций ФНО (0 - 100 Ед / мл) в течение 4 ч. 4 мин болюс нейтрофилов перфузии по монослоя ЕС на 0,05 Па. () Адгезию нейтрофилов оценивается в 2 мин. ANOVA показал существенное влияние лечения ФНО на адгезию нейтрофилов, р <0,01. Поведение нейтрофилов оценивали на 2 и 9 мин и выражали в процентах от адгезивных клеток, которые были (В) прокатного или (С) переселены. ANOVA показал существенное влияние лечения ФНО на поведение приверженца нейтрофилов, р <0,001. В C, ANOVA показал значительное время на Переселенные нейтрофилов р <0,01. Данные представлены как среднее ± SEM из N = 3 экспериментов. * Р <0,05 и **р <0,01 по сравнению с нестимулированных (0 U / мл) управления EC по Dunnett после теста. ## р <0,01 и ### р <0,001 по сравнению с 1 Ед / мл EC в тот же момент времени по Bonferroni пост- тест.

    Рисунок 3
    . Рисунок 3. нейтрофилов набора из потока к ФНО-стимулированного EC помощью фильтра на основе анализа ЕС стимулировали с увеличением концентраций ФНО (0 - 100 Ед / мл) в течение 4 ч. 4 мин болюс нейтрофилов перфузии по монослоя ЕС на 0,1 Па. () Адгезию нейтрофилов оценивается в 2 мин. ANOVA показал существенное влияние лечения ФНО на адгезию нейтрофилов, р <0,001. Поведение нейтрофилов оценивали на 2 и 9 мин и выражали в процентах от адгезивных клеток, которые были (В) прокатного или (С) переселены. В C, ANOVA шоср значительное влияние времени и лечения цитокинов на нейтрофилов переселения, р <0,05. Данные представлены как среднее ± SEM из N = 3 экспериментов. ** Р <0,01 и *** р <0,001 по сравнению с нестимулированных (0 U / мл) управления EC по Dunnett после теста. # Р <0,05 по сравнению с 1 Ед / мл EC в тот же момент времени по Bonferroni сообщению -test.

    Рисунок 4
    Рисунок 4. нейтрофилов набора из потока, чтобы ФНО-стимулированных EC-BMMSC совместных культурах. BMMSC культивировали совместно с EC в течение 24 ч до стимуляции 100 U / мл TNF & alpha; в течение 4 ч. 4 мин болюс нейтрофилов перфузии по монослоя ЕС на уровне 0,05 Па в течение (A, C, E) microslides и 0,1 Па в течение (B, D, F) фильтров. (AB) адгезию нейтрофилов оценивали на 2 мин. Поведение нейтрофилов оценивали на 2 и 9 мВ и выражают как процент адгезивных клеток, которые были (CD) или прокатки (EF) переселены. В C и D, ANOVA показал существенное влияние условий культивирования на нейтрофилов прокатки, р <0,05. В Е и F, ANOVA показали значительное влияние времени на нейтрофилов переселения, р <0,05. Однако, никаких существенных различий не наблюдалось в переселение между индивидуальными процедурами Bonferroni после теста. Данные представлены как среднее ± SEM из N = 5 экспериментов. * Р <0,05 по сравнению с монокультуры ЕС по парного критерия Стьюдента или Bonferroni после теста.

    Дополнительное видео 1. Анализ нейтрофилов прокатных скоростей. ЕС, культивированные на фильтре Transwell стимулировали 100 ед / мл TNF & alpha; в течение 4 ч. Болюс нейтрофилов перфузии по ЕС для 4мин. Представитель оцифрованы последовательность одного поля 10 сек приняты 2мин после перфузии. Изменение в положении одной прокатной нейтрофилов от начала до конца последовательности 10 сек можно использовать для расчета скорости, при которой нейтрофилов прокатки.

    Дополнительное видео 2. Анализ нейтрофилов скоростей миграции. ЕС культивировали на фильтре Transwell стимулировали 100 ед / мл TNF & alpha; в течение 4 ч. Болюс нейтрофилов перфузии через ЭК в течение 4 мин. Представитель оцифрованы последовательность одного поля 5 мин, чтобы отслеживать движение переселенных нейтрофилов. Это может быть использовано, чтобы вычислить скорость.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    Здесь мы опишем два в пробирке моделей "сосудистых" для изучения набора циркулирующих нейтрофилов воспаленной эндотелия. Основным преимуществом этих моделей является возможность анализировать каждый шаг в каскаде адгезии лейкоцитов в порядке, как имело бы место в естественных условиях. Ранее мы уже наблюдали дозозависимое увеличение в адгезию нейтрофилов к и переселение через ФНО-стимулированной ЕС 9,29. Мы также описать, как обе модели могут быть адаптированы для изучения влияния стромальных клеток в области набора лейкоцитов. Здесь MSC культивировали совместно с EC в microslide Ibidi или на противоположных сторонах пористый фильтр. Это позволяет оба типа клеток, чтобы взаимодействовать друг с другом, тем самым изменяя фенотип и реакцию друг друга. Мы показали здесь, и в предыдущих исследованиях 23, что присутствие MSC подавляется адгезию нейтрофилов к ФНО-стимулированного EC. Это указывает на то, что стромальные клетки модифицировать реакцию ЕСцитокинов и впоследствии изменяет набор циркулирующих лейкоцитов.

    В дополнение к модели, описанные выше, Cellix Биочипы, Bioflux пластины и Glyotech проточных камерах с параллельными пластинами коммерчески доступные системы канала потока, которые обеспечивают поверхность для культивирования эндотелий и наблюдения набора. Во всех системах, некоторые параметры должны быть рассмотрены в то время как создание эндотелиальные культуры и выполнение на основе потока адгезии анализы, некоторые из которых приводятся ниже и в предыдущих докладах 30,31. Любые противовоспалительные агенты, такие как гидрокортизон, которые могут повлиять на ответы цитокинов должна быть исключена из среды в течение всего срока культуре и анализа 18,29. При использовании Ibidi microslide гарантировать, что нет никаких пузырьки воздуха, присутствующие в проточном канале в течение культуры ЕК как они будут нарушать монослой EC. Целостности эндотелиального монослоя должна быть подтверждена до cytokiNE-лечение, а нейтрофилы связываются с пробелами в монослое, где BSA уже покрыли microslide / фильтр. Важно также, чтобы гарантировать, что ИС выдерживают при 37 ° С в течение цитокина стимуляции, потому что ФНО является чувствительным к температуре, и только имеет максимальный эффект при 37 ° С. Для самого анализа потока, выберите соответствующий промывочный буфер, мы обычно используем PBSA для коротких анализов (менее 30 минут) и M199 среде, дополненной BSA (0,15%) для более анализов (1 - 48 ч) 30,31. Наконец убедитесь, что нет пузырьков воздуха, присутствующие в проточном канале во время теста, так как это нарушает расход, ущерб монослоя ЕС и активизирует прилипшие нейтрофилов.

    Одним из главных преимуществ моделей в многоклеточных в пробирке, описанных здесь, является их способность к размножению естественных условиях взаимодействия в между ЕС и стромальных клеток. Это трудно выделить эффекты конкретных стромальных компонентов в естественных условияхи модифицировать их контролируемым образом. В наших моделях, стромальные клетки можно манипулировать, чтобы выяснить, как они общаются с ЕС и влиять на воспалительный процесс в здоровье и болезни. Например, при использовании технологии миРНК Ранее мы показали, что производство IL-6 с помощью MSC во взаимодействии культуры была необходима для их иммуносупрессивных воздействий 23. Каждая модель может быть использована для решения конкретных вопросов т.е. эффект тканевого житель стромальных клеток (модели фильтра на основе) или терапевтически ведении стромальных клеток (Ibidi microslides и других коммерчески доступных систем) на наборе лейкоцитов. В обоих случаях мы титруют различных типов клеток стромы, чтобы обеспечить свою жизнеспособность и установить надлежащее соотношение стромы клетки EC для оценки воздействия на вербовку 15,25. Аналогично, культуральная среда должна быть совместимой с каждым типом клеток, включенного в модели. В руках со-культуры, как правило, выполняется в стромальных клеток мedium 11,18,23,31.

    С помощью модели, основанной на фильтре, ранее мы показали, что различные стромальные клетки модулировать способность ЕС для поддержки адгезию и миграцию лейкоцитов в ткани-специфическим образом и что эти эффекты становятся изменены хронических заболеваний 3. Это привело к концепции, что стромальные клетки установления тканеспецифические "Адрес кодов", которые активно регулируют набор лейкоцитов к воспаленной ткани 24. Эти модели предназначены специально для изучения начальных этапов найма в мельчайших подробностях, но не в состоянии изучить последующую миграцию в ее пределах субэндотелиальной пространства (т.е. от эндотелия в ткани). Многоклеточные, многослойные 3D конструкции, такие как статический коллагеновый гель анализа 12,32 бы быть более подходящим для изучения этих последних стадиях вербовки.

    Наши модели адгезии на основе потока очень универсальны. У нас есть DESописали свои применение в контексте набора нейтрофилов, но и другие лейкоцитов подмножества могут быть исследованы аналогичным образом. Мы также использовали систему microslide Ibidi исследовать набор циркулирующих MSC ЕК 23, и происходит ли это через тот же адгезии каскада сообщалось лейкоцитов. Точно так же эти модели могут быть использованы для изучения набора и включение метастатических опухолевых клеточных линий и их последующее влияние на эндотелиальных реакций и набора лейкоцитов. В качестве альтернативы, фильтр модели на основе могут быть адаптированы, чтобы включить различные типы стромальных клеток (например, фибробластов, подоцитах, гладкомышечных клеток) от здоровых тканей и 13,21 участках болезни 11,18,20. Это позволит исследование тканеспецифических регуляторных путей, действующих на уровне ЭК и / или лейкоцитов. Во всех случаях нарушения нормальных регуляторных процессов в различных условиях болезнь может быть изучен с целью выявления кеу регулирующих посредники (например, IL-6 и TGF-beta) и потенциальных новых терапевтических мишеней. В контексте хронического воспаления эти агенты могут быть использованы, чтобы выключить процесс найма, в то время как в биологии рака можно было бы представить их использования для включения набора целевых опухоли.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Collagenase Type Ia Sigma C2674 Dilute in 10 ml PBS to get a final concentration of 10 mg/ml. Store at -20 °C in 1 ml aliquots.
    Dulbecco's PBS Sigma D8662 With calcium and magnesium chloride. Keep sterile and store at RT.
    1X Medium M199 Gibco 31150-022 Warm in 37 °C water bath before use.
    Gentamicin sulphate Sigma G1397 Store at 4 °C. Add to M199 500 ml bottle.
    Human epidermal growth factor Sigma E9644 Store at -20 °C in 10 µl aliquots.
    Fetal calf serum (FCS) Sigma F9665 FCS must be batch tested to ensure the growth and viability of isolated EC. Heat inactivate at 56 °C. Store in 10 ml aliquots at -20 °C.
    Amphotericin B Gibco 15290-026 Potent and becomes toxic within a week so fresh complete HUVEC medium must be made up every week. Store at -20 °C in 1 ml aliquots.
    Hydrocortisone Sigma H0135 Stock is in ethanol. Store at -20 °C in 10 µl aliquots.
    Collagenase Type II Sigma C6885 Dilute stock in PBS to a final concentration of 100 mg/ml. Store at -20 °C in 100 µl aliquots.
    Hyaluronidase Sigma H3631 Dilute stock in PBS to a final concentration of 20,000 U/ml. Store at -20 °C in 100 µl aliquots.
    100 µm cell strainer for 50 ml centifuge tube Scientific Lab Supplies (SLS) 352360 Other commercially available cell strainers (e.g. Greiner bio-one) can also be used.
    DMEM low glucose Biosera LM-D1102/500 Warm in 37 °C water bath before use.
    Penicillin/Streptomycin mix Sigma P4333 Store at -20 °C in 1 ml aliquots.
    25 cc tissue culture flask SLS 353109
    75 cc tissue culture flask SLS 353136
    Bone marrow mesenchymal stem cells vial Lonza PT-2501 Store in liquid nitrogen upon arrival. Cells are at passage 2 upon arrival but are designated passage 0. Exapand to passage 3 and store in liquid nitrogen for later use.
    Mesenchymal stem cell growth medium (MSCGM) Lonza PT-3001 Warm in 37 °C water bath before use. For Cell Tracker Green staining use medium without FCS.
    EDTA (0.02%) solution Sigma E8008 Store at 4 °C. Warm in 37 °C water bath before use.
    Trypsin solution Sigma T4424 Store at -20 °C in 2 ml aliquots. Thaw at RT and use immediately.
    Cryovials Greiner bio-one 2019-02 Keep on ice before adding before adding cell suspension.
    Mr. Frosty Freezing Container Nalgene 5100-0001 Store at RT. When adding cryovials with cells store at -80 °C for 24 hr before transfering cells to liquid nitrogen.
    Ibidi u-Slide VI (0.4), T/C treated, sterile Ibidi IB-80606 Alternative models include glass capillaries, Cellix Biochips (www.cellixltd.com), BioFlux Plates (www.fluxionbio.com/bioflux/) and GlycoTech parallel plate flow chambers (http://www.glycotech.com/apparatus/parallel.html).
    Cell tracker green dye Life technologies C2925 Store in 5 µl aliquots at -20 °C. Dilute in 5 ml prewarmed (at 37 °C) MSCGM.
    Cell counting chambers Nexcelom SD-100 Alternatively a haemocytometer can be used.
    Cellometer auto T4 cell counter Nexcelom Auto T4-203-0238
    Tumor necrosis factor α (TNFα) R&D Systems 210-TA-100 Dilute stock in PBS to a final concentration of 100,000 U/ml. Store at -80 °C in 10 µl aliquots.
    6-well, 0.4 µm PET Transwell filters SLS 353090
    K2-EDTA in 10ml tubes Sarstedt Store at RT.
    Histopaque 1119 Sigma 11191 Store at 4 °C. Warm to RT before use.
    Histopaque 1077 Sigma 10771 Store at 4 °C. Warm to RT before use.
    10 ml round bottomed tube Appleton Woods SC211 142 AS
    7.5% BSA Fraction V solution Life technologies 15260-037 Store at 4 °C.
    20 ml Plastipak syringes BD falcon 300613
    5 ml Plastipak syringes BD falcon 302187
    2 ml Plastipak syringes BD falcon 300185
    3M hypo-allergenic surgical tape 9 m x 2.5 cm Micropore 1530-1 Use to secure the syringe tap onto the wall of the perspex chamber.
    Silicon rubber tubing, internal diameter/external diameter (ID/OD) of 1/3 mm (thin tubing) Fisher Scientific FB68854 Cut silicon tubing to the appropriate size. All tubing leading directly to the electronic microvalve must be thin.
    Silicon rubber tubing ID/OD of 2/4 mm (thick tubing) Fisher Scientific FB68855
    Portex Blue Line Manometer tubing Smiths 200/495/200 Tubing leading to the syringe pump.
    3-way stopcock BOC Ohmeda AB
    Glass 50 ml syringe for pump Popper Micromate 550962 Must be primed prior to use by removing any air bubbles.
    Glass coverslip Raymond A Lamb 26 x 76 mm coverslips made to order. Lot number 2440980.
    Parafilm gasket American National Can Company Cut a 26 x 76 mm piece of parafilm using an aluminium template and cut a 20 x 4 mm slot into it using a scalpel 10a. Gasket thickness is approximately 133 µm.
    Two perspex parallel plates Wolfson Applied Technology Laboratory Specially designed chamber consisting of parallel plates held together by 8 screws. The lower plate has a viewing slot cut out in the middle and a shallow recess milled to allow space for the coverslip, filter and gasket. The upper perspex plate has an inlet and outlet hole positioned over the flow channel.
    Electronic 3-way microvalve with min. dead space Lee Products Ltd. LFYA1226032H Electronically connected to a 12 volt DC power supply.
    Syringe pump for infusion/withdrawal (PHD2000) Harvard Apparatus 70-2001 Set the diameter to 29 mm and refill (flow) rate.
    L-shaped connector Labhut LE876 To attach to the inlet and outlet ports onto the Ibidi microslide channel.
    Video camera Qimaging 01-QIC-F-M-12-C Connected to a computer which enables digitall videos to be recorded.
    Image-Pro Plus 7.0 Media Cybernetics 41N70000-61592 For data analysis. Manually tag cells displaying the different behaviors. Track cells for analysis of rolling and migration velocities.
    Refer to product datasheets for details on hazards of using the reagents described here.

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Springer, T. A. Traffic signals on endothelium for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration. Ann. Rev. Physiol. 57, 827-872 (1995).
    2. Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nature reviews. Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).
    3. McGettrick, H. M., Butler, L. M., Buckley, C. D., Rainger, G. E., Nash, G. B. Tissue stroma as a regulator of leukocyte recruitment in inflammation. Journal of leukocyte biology. 91 (3), 385-400 (2012).
    4. Serhan, C. N., Savill, J. Resolution of inflammation: the beginning programs the end. Nature immunology. 6 (12), 1191-1197 (2005).
    5. Schmidt, S., Moser, M., Sperandio, M. The molecular basis of leukocyte recruitment and its deficiencies. Molecular immunology. 55, 49-58 (2013).
    6. Luu, N. T., Rainger, G. E., Nash, G. B. Differential Ability of Exogenous Chemotactic Agents to Disrupt Transendothelial Migration of Flowing Neutrophils. The Journal of Immunology. 164 (11), 5961-5969 (2000).
    7. Smith, C. W., Rothlein, R., et al. Recognition of an endothelial determinant for CD 18-dependent human neutrophil adherence and transendothelial migration. The Journal of clinical investigation. 82 (5), 1745-1756 (1988).
    8. Luscinskas, F. W., Brock, A. F., Arnaout, M. A., Gimbrone, M. A. Endothelial-leukocyte adhesion molecule-1-dependent and leukocyte (CD11/CD18)-dependent mechanisms contribute to polymorphonuclear leukocyte adhesion to cytokine-activated human vascular endothelium. J. Immunol. 142 (7), (1989).
    9. Bahra, P., Rainger, G. E., Wautier, J. L., Nguyet-Thin, L., Nash, G. B. Each step during transendothelial migration of flowing neutrophils is regulated by the stimulatory concentration of tumour necrosis factor-alpha. Cell adhesion and communication. 6 (6), 491-501 (1998).
    10. Piali, L., Weber, C., et al. The chemokine receptor CXCR3 mediates rapid and shear-resistant adhesion-induction of effector T lymphocytes by the chemokines IP10 and Mig. European journal of immunology. 28 (3), 961-972 (1998).
    11. McGettrick, H. M., Smith, E., et al. Fibroblasts from different sites may promote or inhibit recruitment of flowing lymphocytes by endothelial cells. European journal of immunology. 39 (1), 113-125 (2009).
    12. McGettrick, H. M., Hunter, K., Moss, P. a, Buckley, C. D., Rainger, G. E., Nash, G. B. Direct observations of the kinetics of migrating T cells suggest active retention by endothelial cells with continual bidirectional migration. Journal of leukocyte biology. 85 (1), 98-107 (2009).
    13. McGettrick, H. M., Buckley, C. D., Filer, A., Rainger, G. E., Nash, G. B. Stromal cells differentially regulate neutrophil and lymphocyte recruitment through the endothelium. Immunology. 131 (3), 357-370 (2010).
    14. Tull, S. P., Yates, C. M., et al. Omega-3 Fatty acids and inflammation: novel interactions reveal a new step in neutrophil recruitment. PLoS biology. 7 (8), e1000177 (2009).
    15. Ahmed, S. R., McGettrick, H. M. Prostaglandin D2 regulates CD4+ memory T cell trafficking across blood vascular endothelium and primes these cells for clearance across lymphatic endothelium. Journal of immunology. 187 (3), 1432-1439 (2011).
    16. Bradfield, P. F., Amft, N., et al. Rheumatoid fibroblast-like synoviocytes overexpress the chemokine stromal cell-derived factor 1 (CXCL12), which supports distinct patterns and rates of CD4+ and CD8+ T cell migration within synovial tissue. Arthritis and rheumatism. 48 (9), 2472-2482 (2003).
    17. Filer, A., Parsonage, G., et al. Differential survival of leukocyte subsets mediated by synovial, bone marrow, and skin fibroblasts: site-specific versus activation-dependent survival of T cells and neutrophils. Arthritis and rheumatism. 54 (7), 2096-2108 (2006).
    18. Lally, F., Smith, E., et al. A novel mechanism of neutrophil recruitment in a coculture model of the rheumatoid synovium. Arthritis and rheumatism. 52 (11), 3460-3490 (2005).
    19. Chakravorty, S. J., McGettrick, H. M., Butler, L. M., Buckley, C. D., Rainger, G. E., Nash, G. B. An in vitro. model for analysing neutrophil migration into and away from the sub-endothelial space: Roles of flow and CD31. Biorheology. 43 (1), 71-82 (2006).
    20. Rainger, G. E., Nash, G. B. Cellular Pathology of Atherosclerosis Smooth Muscle Cells Prime Cocultured Endothelial Cells for Enhanced Leukocyte Adhesion. Circulation Research. 88 (6), 615-622 (2001).
    21. Kuravi, S. J., McGettrick, H. M. Podocytes regulate neutrophil recruitment by glomerular endothelial cells via IL-6-mediated crosstalk. Journal of immunology. 193 (1), 234-243 (2004).
    22. Parsonage, G., Filer, A. D. A stromal address code defined by fibroblasts. Trends in immunology. 26 (3), 150-156 (2005).
    23. Luu, N. T., McGettrick, H. M. Crosstalk between mesenchymal stem cells and endothelial cells leads to downregulation of cytokine-induced leukocyte recruitment. Stem cells. 31 (12), 2690-2702 (2013).
    24. Bevilacqua, M. P., Nelson, R. M., Mannori, G., Cecconi, O. Endothelial-leukocyte adhesion molecules in human disease. Annual review of medicine. 45, 361-378 (1994).
    25. Stanness, K. A., Beatty, P. G., Ochs, H. D., Harlan, J. M. An endothelial cell surface factor(s) induced in vitro. 136 (12), 4548-4553 (1986).
    26. Burton, V. J., Butler, L. M. Delay of migrating leukocytes by the basement membrane deposited by endothelial cells in long-term culture. Experimental cell research. 317 (3), 276-292 (2011).
    27. Luu, N. T., Rainger, G. E., Buckley, C. D., Nash, G. B. CD31 Regulates Direction and Rate of Neutrophil Migration over and under Endothelial Cells. Journal of Vascular Research. 40 (5), 467-479 (2003).
    28. McGettrick, H. M., Buckley, C. D., Ed Rainger, G., Nash, G. B. Influence of stromal cells on lymphocyte adhesion and migration on endothelial cells. Methods in molecular biology. 616, 49-68 (2010).
    29. Butler, L. M., McGettrick, H. M., Nash, G. B. Static and dynamic assays of cell adhesion relevant to the vasculature. Methods in molecular biology. 467, 211-228 (2009).
    30. Jeffery, H. C., Buckley, C. D., Moss, P., Rainger, G. E., Nash, G. B., McGettrick, H. M. Analysis of the effects of stromal cells on the migration of lymphocytes into and through inflamed tissue using 3-D culture models. Journal of immunological methods. 400-401, 45-57 (2013).

    Tags

    Иммунологии выпуск 95 эндотелиальные клетки лейкоциты мезенхимальные стромальные клетки мезенхимальные стволовые клетки совместное культивирование адгезии воспаление набор на основе анализа адгезии потоком Ibidi microslide нейтрофилов
    Анализ влияния стромальных клеток на вербовкой лейкоцитов из потока
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Munir, H., Rainger, G. E., Nash, G.… More

    Munir, H., Rainger, G. E., Nash, G. B., McGettrick, H. Analyzing the Effects of Stromal Cells on the Recruitment of Leukocytes from Flow. J. Vis. Exp. (95), e52480, doi:10.3791/52480 (2015).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter