Summary

Analizzando gli effetti delle cellule stromali per il reclutamento dei leucociti da portata

Published: January 07, 2015
doi:

Summary

La capacità di endotelio infiammato per reclutare leucociti dal flusso è regolato da cellule stromali mesenchimali. Descriviamo due modelli in vitro che incorporano cellule umane primarie che possono essere utilizzati per valutare il reclutamento di neutrofili dal flusso e esaminare il ruolo che le cellule stromali mesenchimali svolgono nel regolare questo processo.

Abstract

Cellule stromali regolano il reclutamento dei leucociti circolanti durante l'infiammazione attraverso il cross-talk con le cellule endoteliali vicine. Qui si descrive due vitro modelli "vascolari" in per studiare il reclutamento di neutrofili circolanti dalla portata dalle cellule endoteliali infiammate. Un vantaggio importante di questi modelli è la capacità di analizzare ogni passo nella cascata leucociti in ordine, come avverrebbe in vivo. Descriviamo inoltre come entrambi i modelli possono essere adattati per studiare il ruolo delle cellule stromali, in questo caso le cellule staminali mesenchimali (MSC), nel regolare il reclutamento dei leucociti.

Cellule endoteliali primarie sono state coltivate solo o insieme con MSC umana in contatto diretto sulla microslides Ibidi o su lati opposti di un filtro Transwell per 24 ore. Le colture sono state stimolate con fattore di necrosi tumorale alfa (TNF) per 4 ore e incorporati in un saggio di adesione a base di flusso. Un bolo di neutrofili è stato perfusosopra l'endotelio per 4 min. La cattura di fluire neutrofili e le loro interazioni con l'endotelio è stata visualizzata mediante microscopia in contrasto di fase.

In entrambi i modelli, citochine stimolazione aumentata endoteliale reclutamento di neutrofili scorre in modo dose-dipendente. Analisi del comportamento di neutrofili reclutati mostrato una riduzione dose-dipendente in rotolamento e un aumento dose-dipendente nella trasmigrazione attraverso l'endotelio. In co-coltura, MSC soppresso neutrofili all'endotelio TNF-stimolata.

I nostri modelli a base di adesione flusso imitano le fasi iniziali di reclutamento dei leucociti dalla circolazione. Oltre a leucociti, possono essere utilizzati per esaminare il reclutamento di altri tipi di cellule, come le cellule tumorali circolanti MSC o terapeuticamente somministrati. I nostri modelli di co-coltura multistrato hanno dimostrato che MSC comunicare con endotelio di modificare la loro risposta a citochine pro-infiammatorie, Altering il reclutamento dei neutrofili. Sono necessarie ulteriori ricerche utilizzando tali modelli per comprendere appieno le cellule stromali come di diversi tessuti e condizioni (malattie infiammatorie o il cancro) influenzano il reclutamento dei leucociti durante l'infiammazione.

Introduction

L'infiammazione è una risposta protettiva alle infezioni microbiche o lesioni dei tessuti che richiede stretta regolamentazione dell'entrata dei leucociti e l'uscita dal tessuto infiammato per consentire la risoluzione 1,2. Cross-talk tra cellule endoteliali (EC) che i vasi sanguigni linea, leucociti circolanti e cellule stromali tessuti residente è essenziale per coordinare questo processo 3. Tuttavia, l'assunzione incontrollata di leucociti e loro liquidazione inefficace alla base dello sviluppo delle malattie infiammatorie croniche 4. La nostra attuale comprensione del reclutamento dei leucociti in salute e malattia è insufficiente e sono necessari modelli più robusti per analizzare questo processo.

I meccanismi di sostegno al reclutamento dei leucociti dal sangue attraverso CE vascolare in venule post-capillari sono stati ben descritti 1,2,5. Leucociti circolanti vengono catturati dai recettori specializzati (ad esempio, VCAM-1, E-selectina, P-selectina) chesono up-regolati su endotelio infiammata. Queste interazioni transitorie consentono leucociti di interagire con chemochine superficie vincolata e mediatori lipidici di derivazione (o endoteliali o stromali in origine) che attivano integrine espresse dai leucociti 6- 11. Questo a sua volta stabilizza adesione e le unità di migrazione attraverso l'endotelio e nel tessuto 12- 15. All'interno del tessuto, reclutati leucociti sono sottoposti a agenti stromali di derivazione che influenzano la loro motilità, funzione e la sopravvivenza 16,17. Una crescente evidenza suggerisce fortemente che i segnali ricevuti in ogni fase delle condizioni di processo di reclutamento dei leucociti per il prossimo. Tuttavia, la nostra comprensione di reclutamento dei leucociti rimane incompleto e molto poco si sa circa il movimento dei leucociti componenti shaping all'interno del tessuto.

In Birmingham abbiamo sviluppato diversi modelli in vitro "vascolari" per studiare il reclutamento dei leucociti daflusso 9,18,19. Ora capiamo che vascolare atto CE per quanto immediati regolatori di reclutamento dei leucociti rispondere ai cambiamenti nel loro microambiente locale. In particolare, le cellule stromali tessuti residenti possono regolare attivamente la risposta infiammatoria, in parte conversando con i paesi limitrofi CE vascolare di influenzare il loro ruolo nel reclutamento 3. Abbiamo precedentemente dimostrato che varie cellule stromali modulano la capacità di CE di sostenere l'adesione e la migrazione di leucociti in modo tessuto-specifico, e che tali effetti diventare alterato nelle malattie croniche 13,16,20,21. Così, le cellule stromali stabilire tessuto 'indirizzo codici "che definiscono il contesto di ogni risposta infiammatoria 22. Più recentemente, abbiamo dimostrato che il midollo osseo derivate MSC (BMMSC) potentemente down-regolare la risposta della CE alle citochine, portando ad una riduzione del reclutamento di neutrofili e linfociti 23.

I meccanismi govErning reclutamento chiarito in vitro hanno in gran parte utilizzato dosaggi incorporano un tipo singola cella (ad esempio, CE) o proteine ​​in isolamento. Tuttavia, questi studi non prendono in considerazione gli effetti dell'ambiente tessuto locale (cioè, la presenza di cellule stromali) sul reclutamento dei leucociti e la loro successiva migrazione nel tessuto. Qui si descrivono due metodi basati sul flusso in cui le cellule stromali, in particolare le cellule staminali mesenchimali (MSC), sono co-coltura con EC 23. Tali modelli consentono di esaminare l'effetto delle cellule stromali sulle risposte endoteliali, in particolare la loro capacità di sostenere il reclutamento dei leucociti dal flusso.

Protocol

1. Isolamento e la coltura di cellule endoteliali umane primarie e cellule staminali mesenchimali Cellule isolamento e la coltura di umane ombelicali endoteliali vena (HUVEC): Mettere cordone ombelicale su un vassoio con carta assorbente e spruzzare con il 70% di etanolo. Mettere in una cappa coltura tissutale. Identificare la vena e cannulate ad entrambe le estremità. Posizionare una fascetta intorno alla fine cannulata per fissarlo. Lavare sangue venoso con PBS usando una siringa. Riempi…

Representative Results

Inizialmente, abbiamo analizzato l'effetto di stimolare CE con TNF sul reclutamento di neutrofili dal flusso utilizzando il modello MicroSlide Ibidi (Sezione 7 – 9). In assenza di TNFa, poca o nessuna neutrofili rispettate monostrato endoteliale (Figura 2A). Questo è stato previsto, come non trattata / riposo CE non esprimono le molecole necessarie adesione (selectine) o chemochine per sostenere vincolante 25,26. Al contrario, citochine stimolazione aumentato significati…

Discussion

Qui si descrive due vitro modelli "vascolari" in per studiare il reclutamento di neutrofili circolanti da endotelio infiammata. Un vantaggio importante di questi modelli è la capacità di analizzare ogni passo nella cascata leucociti in ordine, come avverrebbe in vivo. Abbiamo già osservato un aumento dose-dipendente in neutrofili adesione e la trasmigrazione attraverso TNF-stimolata CE 9,29. Descriviamo inoltre come entrambi i modelli possono essere adattati per studiar…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Umbilical cords were collected with the assistance of the Birmingham Women’s Health Care NHS Trust. HMM was supported by an Arthritis Research UK Career Development Fellowship (19899) and Systems Science for Health, University of Birmingham (5212).

Materials

Collagenase Type Ia Sigma C2674 Dilute in 10ml PBS to get a final concentration of 10mg/ml. Store at -20°C in 1ml aliquots.
Dulbecco's PBS Sigma D8662 With calcium and magnesium chloride. Keep sterile and store at room temperature.
1X Medium M199 Gibco 31150-022 Warm in 37 °C water bath before use.
Gentamicin sulphate Sigma G1397 Store at 4°C. Add to M199 500ml bottle.
Human epidermal growth factor Sigma E9644 Store at -20°C in 10µl aliquots.
Fetal calf serum (FCS) Sigma F9665 FCS must be batch tested to ensure the growth and viability of isolated EC. Heat inactivate at 56°C. Store in 10ml aliquots at -20°C.
Amphotericin B Gibco 15290-026 Potent and becomes toxic within a week so fresh complete HUVEC medium must be made up every week. Store at -20°C in 1ml aliquots.
Hydrocortisone Sigma H0135 Stock is in ethanol. Store at -20°C in 10µl aliquots.
Collagenase Type II Sigma C6885 Dilute stock in PBS to a final concentration of 100mg/ml. Store at -20°C in 100µl aliquots.
Hyaluronidase Sigma H3631 Dilute stock in PBS to a final concentration of 20,000U/ml. Store at -20°C in 100µl aliquots.
100µm cell strainer for 50ml centifuge tube Scientific Lab Supplies (SLS) 352360 Other commercially available cell strainers (e.g. Greiner bio-one) can also be used.
DMEM low glucose Biosera LM-D1102/500 Warm in 37 °C water bath before use.
Penicillin/Streptomycin mix Sigma P4333 Store at -20°C in 1ml aliquots.
25cm2 tissue culture flask SLS 353109
75cm2 tissue culture flask SLS 353136
Bone marrow mesenchymal stem cells vial Lonza PT-2501 Store in liquid nitrogen upon arrival. Cells are at passage 2 upon arrival but are designated passage 0. Exapand to passage 3 and store in liquid nitrogen for later use.
Mesenchymal stem cell growth medium (MSCGM) Lonza PT-3001 Warm in 37 °C water bath before use. For Cell Tracker Green staining use medium without FCS.
EDTA (0.02%) solution Sigma E8008 Store at 4°C. Warm in 37°C water bath before use.
Trypsin solution Sigma T4424 Store at -20°C in 2ml aliquots. Thaw at room temperature and use immediately.
Cryovials Greiner bio-one 2019-02 Keep on ice before adding before adding cell suspension.
Mr. Frosty Freezing Container Nalgene 5100-0001 Store at room temperature. When adding cryovials with cells store at -80°C for 24h before transfrring cells to liquid nitrogen.
Ibidi u-Slide VI (0.4), T/C treated, sterile Ibidi IB-80606 Alternative models include glass capillaries, Cellix Biochips (www.cellixltd.com), BioFlux Plates (www.fluxionbio.com/bioflux/) and GlycoTech parallel plate flow chambers (http://www.glycotech.com/apparatus/parallel.html).
Cell tracker green dye Life technologies C2925 Store in 5µl aliquots at -20°C. Dilute in 5ml prewarmed (at 37°C) MSCGM.
Cell counting chambers Nexcelom SD-100 Alternatively a haemocytometer can be used.
Cellometer auto T4 cell counter Nexcelom Auto T4-203-0238
Tumor necrosis factor α (TNFα) R&D Systems 210-TA-100 Dilute stock in PBS to a final concentration of 100,000U/ml. Store at -80°C in 10µl aliquots.
6-well, 0.4µm PET Transwell filters SLS 353090
K2-EDTA in 10ml tubes Sarstedt Store at room temperature.
Histopaque 1119 Sigma 11191 Store at 4°C. Warm to room temperature before use.
Histopaque 1077 Sigma 10771 Store at 4°C. Warm to room temperature before use.
10ml round bottomed tube Appleton Woods SC211 142 AS
7.5% BSA Fraction V solution Life technologies 15260-037 Store at 4°C.
20ml Plastipak syringes BD falcon 300613
5ml Plastipak syringes BD falcon 302187
2ml Plastipak syringes BD falcon 300185
3M hypo-allergenic surgical tape 9m x 2.5cm Micropore 1530-1 Use to secure the syringe tap onto the wall of the perspex chamber.
Silicon rubber tubing, internal diameter/external diameter (ID/OD) of 1/3mm (thin tubing) Fisher Scientific FB68854 Cut silicon tubing to the appropriate size. All tubing leading directly to the electronic microvalve must be thin.
Silicon rubber tubing ID/OD of 2/4mm (thick tubing) Fisher Scientific FB68855
Portex Blue Line Manometer tubing Smiths 200/495/200 Tubing leading to the syringe pump.
3-way stopcock BOC Ohmeda AB
Glass 50ml syringe for pump Popper Micromate 550962 Must be primed prior to use by removing any air bubbles.
Glass coverslip Raymond A Lamb 26x76mm coverslips made to order. Lot number 2440980.
Parafilm gasket American National Can Company Cut a 26x76mm piece of parafilm using an aluminium template and cut a 20x4mm slot into it using a scalpel 10a. Gasket thickness is approximately 133µm.
Two perspex parallel plates Wolfson Applied Technology Laboratory Specially designed chamber consisting of parallel plates held together by 8 screws. The lower plate has a viewing slot cut out in the middle and a shallow recess milled to allow space for the coverslip, filter and gasket. The upper perspex plate has an inlet and outlet hole positioned over the flow channel.
Electronic 3-way microvalve with min. dead space Lee Products Ltd. LFYA1226032H Electronically connected to a 12 volt DC power supply.
Syringe pump for infusion/withdrawal (PHD2000) Harvard Apparatus 70-2001 Set the diameter to 29mm and refill (flow) rate.
L-shaped connector Labhut LE876 To attach to the inlet and outlet ports onto the Ibidi microslide channel.
Video camera Qimaging 01-QIC-F-M-12-C Connected to a computer which enables digitall videos to be recorded.
Image-Pro Plus 7.0 Media Cybernetics 41N70000-61592 For data analysis. Manually tag cells displaying the different behaviors. Track cells for analysis of rolling and migration velocities.
Refer to product datasheets for details on hazards of using the reagents described here.

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Munir, H., Rainger, G. E., Nash, G. B., McGettrick, H. Analyzing the Effects of Stromal Cells on the Recruitment of Leukocytes from Flow. J. Vis. Exp. (95), e52480, doi:10.3791/52480 (2015).

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