Summary
ゼブラフィッシュ角膜実質は植片から細胞シートに移行し、上皮の創傷治癒の文脈における集団的細胞移動のメカニズムの研究のためのin vitroモデルを提供する。これらのプロトコルの詳細集団細胞遊走アッセイにおいて使用するための一次外植片培養を確立するための効果的な方法。
Abstract
それらの固有の運動特性のために、魚の角膜実質細胞は、外植片培養物から解離長い単一細胞移動のメカニズムを研究するために使用されている。植片が確立されている場合しかし、これらの細胞はまた、個体が、移行を研究するための魅力的なモデルを角膜実質にする機能の多くを維持し、一括して移動：運動性の急速な速度、垂直アクチンケーブルとの広範なアクチンに富むラメラ、かつ比較的一定の速度をと移動の方向。初期の外植片では、集合的に移行するものと個別に移動する細胞の迅速な相互変換は、移行のモードを決定する際に、細胞 - 細胞接着の役割の研究を可能にし、移動の二つのモードの間の分子リンクを強調している。間葉への移行上皮が発生し、創傷治癒および炎症に関連する遺伝子が差次的に発現されるように、後に外植片中の細胞を迅速かつ集合的に移行する能力を失う。したがって、角膜実質細胞の外植片、皮膚創傷治癒の間に起こる遺伝子発現の変化の定義されたプログラムのコンテキストで集合的細胞移動のメカニズムを研究するための独自のシステムを表すことができ、再上皮化のためのインビトロモデルとして働くことができる。変異体およびトランスジェニックゼブラフィッシュ系統の様々な、利用可能な外植片は、異なる遺伝的背景を持つ魚から確立されることを可能にする。これは、これらのプロセス内の異なるタンパク質の役割を一意にアドレス指定することを可能にする。ここで概説プロトコルは、集団細胞遊走に関連する種々のアッセイで使用するためにこれらの外植文化を確立するための簡単かつ効果的な方法を記載する。
Introduction
細胞運動性の研究は、伝統的に、個別に移動する細胞に集中している。魚や両生類外植片からの培養された角膜実質1-6に近づく実験的および数学的モデリングの両方を使用して、細胞運動のメカニズムを研究するための強力なモデル系であることが判明している。均一な形状、速度、および方向を維持しながら、個別に移動する細胞に対する実験研究は、細胞の急速な、滑らかな滑走運動によって補助される。特に、胚形成、創傷治癒、および転移の間に、細胞間結合を維持しながら、しかし、 インビボにおいて 、細胞は、しばしば集合的に移動する。したがって、集合的な細胞移動、細胞遊走のフィールド内の研究の成長とますます顕著領域である。これらの細胞の集合的な移行は、最近7に記載されており、それは創傷治癒モデルにおいて、集団の細胞遊走を研究するための強力なシステムにする多くのユニークな特徴を有している。
ove_content ">スケールが麻酔され、成体ゼブラフィッシュから引き抜かれると、いくつかの上皮組織は、スケールの下側に取り付けられたままである。細胞培養培地は、これらの上皮細胞、または角膜を添加する場合、スケールからの集合的な単位として急速に移行する。ザ·移植片培養は、細胞が無傷の上皮を再確立するために離れて外植片から、彼らは、創傷床の暫定マトリックス全体に同じように移行するモデル治癒上皮創傷、と見ることができる。最近のデータは、このex vivoでの文化を模倣し、多くの機能を示唆しているin vivoで成体ゼブラフィッシュにおける創傷治癒。創傷閉鎖率は8 エキソビボ系7で観察されるものと同様の移動速度に変換する。また、 インビボでの創傷治癒モデル、ワルファリンによる治療は、止血率に影響を及ぼさないことを示唆している治癒、免疫応答を低下させるヒドロコルチゾンでの処置は再上皮8を遅らせていない間ここで紹介するプロトコルは、多くの生物学的アッセイで使用するための一貫性と再現性を確保するゼブラフィッシュ角膜実質植片培養を確立する方法について説明します。これらの外植片培養は、いくつかの理由のために集団的細胞移動のためのin vitroモデルでは特に魅力的である。まず、ゼブラフィッシュ角膜実質は外植文化を確立する時間以内に使用される主要な細胞である。したがって、これらの細胞は、初代細胞9-13の通路に関連付けられた形態学的および遺伝子発現の変化を受けていない。第二に、このシステムは、創傷への応答、間葉trの上皮の一部として、14が負傷に応答して、再上皮化の研究のためのモデルを表すと遺伝子発現の変化および細胞骨格再配列14,15によって証明されるようにansition（EMT）プロセスが開始される。したがって、未処理の細胞において生じる遺伝子発現と運動性の背景の変化が特徴づけおよび処置変化を解釈するためのコンテキストを提供してきた。また、魚の角膜実質とヒトケラチノサイトは、機能的に同等である。両方は、それぞれの種の主要な上皮細胞である上皮創傷治癒において重要な役割を果たしている。第三に、大人のゼブラフィッシュは、黒色腫および他の癌19-21、8,14および組織再生22-24治癒皮膚の創傷を含むヒト疾患16-18の様々なモデル系として認識を得ている。
このモデルシステムの技術的利点は、同じように魅力的である。突然変異体およびトランスジェニック系統が増え、非営利、集中型の施設から利用できます。具体的には、ゼブラフィッシュ変異プロジェクト（ZMP）ウェルカム·トラスト·サンガー研究所では、ゼブラフィッシュゲノム中のすべてのタンパク質をコードする遺伝子中にノックアウト対立遺伝子を作成することを目指しています。現在、彼らは特徴付け24088アレルで、11892遺伝子、ゲノムの約45％に変異している。また、ZMPは提案を受け入れ、無償でノックアウトを生成します。幼虫と大人のゼブラフィッシュ25-28における遺伝子ノックダウンの最近の方法は、トランスジェニックアプローチが問題か、非現実的であるために発生上重要な遺伝子の機能を研究するための柔軟性を提供する。
〜145ミクロン/ hrの運動性の彼らの非常に急速な速度に起因する間もなく文化29の設立後、アッセイは（通常は24時間以内に）迅速に完了することができます。実験は迅速に完了することができ、培養物を室温で十分に成長するにつれ、ビデオ顕微鏡を含む哺乳動物細胞遊走アッセイに関連する技術的なハードルのいくつかは回避される。また、研究予算を締めるの時代に、zebrafISHは、容易かつ安価に維持されている。
外植片の構造と動作は複雑である。スケールが除去されると、魚が出血しないように、表面的な表皮層よりもはるかに規模で除去するとは考えにくい。角膜実質細胞の大部分は抗E-カドヘリン抗体14を染色するために表示されるスケールは、最初に魚から除去されるときに、外植片における優勢な細胞型であるように見える。さらに、免疫蛍光14によってビメンチン染色の欠如によって判断されるように、最初の培養における線維芽細胞の証拠はない。しかし、繰り返しスケール除去と、（ ビデオ1を参照） を植片における多数の好中球があるように思われる。 LPSにさらされたとき、我々は、それらのサイズ、急速に運動性、および細胞シートのうち、それらの移動の形態学的観察に基づいて、好中球のような、これらの細胞を同定した（データは示さず）。さらに、これらの細胞は明るくウィットを染色好中球サイトゾル因子ならびにとともに、それらがその表面上に豊富なFcRを有することを示す二次IgG抗体の様々な抗体（データは示していない）時間。複数の細胞層が外植片内に存在する。共焦点顕微鏡は、上、下、及び細胞角膜実質細胞シート間の可視好中球スケール付近の角膜実質層以上の前縁付近単層の存在を明らかにする。
初期の時点では、〜145ミクロン/ hrの初期レートでの外植片から角膜実質の集合的な移行を開始する多層外植分極しの端に、上の細胞。外植片によって覆われる領域が急速に増加し、シート内で、張力を拡散セルにつながる、前縁の進行速度の低下。リーダーとフォロワー細胞との間の迅速な相互変換は、シート7内で自然発生的に形成されたホールの形成及び閉鎖時の前縁で観察される。として外植片を用いて開始EMTプロセスは、シート断片を継続し、角膜実質細胞は、特殊化した、迅速な運動性を失う。遺伝子発現とEMTと一致して形態変化、創傷治癒、および炎症反応は外植は約10日間14のための実行可能な検討されて培養7日以内に発生する。
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Protocol
このプロトコルは、実験動物の管理と使用に関するAVMA動物福祉の原則に準拠しており、中西部の大学の施設内動物管理使用委員会（IACUC）によって承認されています。
麻酔、機器、およびメディアの作製
- 約1.5（ペット店で入手可能）のどちらか、市販の脱塩剤を使用した水道水のLまたは24時間水スタンドをさせることにより、脱塩素。 3 1Lのビーカーを取得し、水を脱塩素500ミリリットルでそれぞれを埋める。すべての手順の前に魚を保持するための1と回復のための1にラベルを付けます。第3のビーカーに、トリカインメタン100μg/ mlを追加します。これは魚が麻酔をされる中でビーカーになる。
- 氷浅いトレイを埋める、培地を温める（RPMI 1640,10％FBS（ウシ胎児血清）、50μg/ mlのゲンタマイシン、100μg/ mlのカナマイシン、25mMのHEPES）RTにし、清潔な宝石商ピンセットを集める。イメルによるクリーンピンセット70％エタノールでのヒントを歌うとエタノールを燃焼させること、ブンゼンバーナーを通過する。
- 10倍の倍率、または顕微鏡（個人的な好みに完全に依存）を解剖 - 手順は2で、商業、卓上照明付きルーペで、倍率なしで実行するかどうかを決定します。
2.体外培養物を確立
- 保持ビーカーに魚や場所の所望の数をキャッチ。麻酔のビーカーに、単一の魚を移す。それは個別に魚を麻酔するのが最善です。
- 魚の水泳と鰓の動きを観察することによって麻酔の影響を監視します。麻酔が進行すると、鰓の動きが遅くなり、魚は不規則に、頻繁に逆さまに泳ぎます。とすぐに鰓の動きが止まるように麻酔魚を検討してください。これは魚の死をもたらす可能性がある麻酔浴に長期間魚を放置しないでください。
- 麻酔ビーカーと転送から魚を削除氷に、ピンセットを持つ手に直面して尾を水平に魚を置く。技術で、複数の魚が外植片を作るために使用される場合に経験した場合、この時点で麻酔をビーカー内の次の魚を配置することを検討。
- スケールを除去するために、位置ピンセットは、スケールの端に先端が魚に平行である。スケールは魚の体から昇格させるために少し魚の側にピンセットの平らな面を押します。摘む、ピンセットで規模を持ち、組織培養皿で（反転なし）の場所。鰓地域、側線、フィンを避け、（それぞれの側から6）大の大人から12のスケールの最大値を除去し、手順を繰り返します。
- 回復ビーカーに魚を置き、麻酔の影響から回復することを確認するために監視する。この時点で、魚が個々のタンクに戻って転送することができる。魚が完全なスケールの再生を可能にするために、少なくとも21日間回復できるようにします。
- 応じてガラスボトムディッシュあたり6スケール - 実験デザイン、プラスチック製の35mm組織培養処理皿当たり20スケールまたは4にまで配置します。スケールは皿からスケールを剥離しないように、静かにメディアを追加する前に皿に接着させる。
注：メディアが最初皿に添加される前に経験により、複数の魚を処理することができる。 - 各35ミリメートル皿に完全なメディア（上記1.2を参照のこと）の1.2ミリリットルを追加します。
- 好ましくは、または追加の処理なし所望の時間、5％CO 2で28℃、外植文化をインキュベートする。また、加熱された顕微鏡ステージ上またはビデオ顕微鏡のための生きた細胞培養チャンバ内の文化をインキュベートする。
3.明とビデオ顕微鏡
- 顕微鏡ステージ上に、最初は細胞シートを含むポジション料理は4X対物レンズを用いて焦点を合わせる。
注：より高い倍率は実験に応じて、使用することができる。の位置をマーク各細胞シート及び/又はステージ上皿の向きがほぼ同じ方向にシートを経時的に画像を撮影が容易になる。 - 各実験プロトコルに従って、種々の時点でのインキュベーターと写真から料理を取り外し、静止画像のみが実験的な時間枠にわたって必要とされている場合は、インキュベーターに戻し置く。
- ビデオ顕微鏡の実行中に、次のように注意を払う：
- 位置移行細胞シートは、ビデオの継続時間の視野に残るように、視野内の目盛り/新興の細胞シート。
注：これは、細胞が、スケールの下から移行方法を観察中にいくつかの経験がかかる場合があります。短いビデオでは、これは長いビデオのためのより関心の低い。 - 短い時間枠の場合は、RTでインキュベートする。より長い時間枠（18+時間）については、温度を維持するために加熱されたステージまたはインキュベーションチャンバーを使用してpHバランス、培養mの蒸発を最小限にするedium。
- 位置移行細胞シートは、ビデオの継続時間の視野に残るように、視野内の目盛り/新興の細胞シート。
免疫蛍光顕微鏡4.固定
- 準備し、28℃に予熱暖かいすべてのソリューション。ガラスボトム35mmの組織培養皿を用いて、上記のように、蛍光下で角膜表示するために、外植片培養物を成長させる。また、ガラスチャンバースライドを使用しています。
- 各ディッシュに1.1倍PBS中の4％パラホルムアルデヒドの0.8ミリリットルを追加します。最初の培養培地を削除しないでください。 溶液を除去するために吸引し、次いで室温で5分間インキュベートする。
- 各ディッシュに1.1倍PBS中の4％パラホルムアルデヒドの0.8ミリリットルを追加します。溶液を除去するために吸引し、次いで室温で5分間インキュベートする。
- 1X PBS 0.5 mlを、0.2％トリトンX-100を添加することにより、外部のリガンドまたは外部のエピトープ、透過化細胞を使用しない場合。溶液を除去するために吸引し、次いで室温で5分間インキュベートする。
- 1×PBS中0.5ミリリットルの1％のBSAを追加し（4℃で）1（RTで）時間またはO / Nインキュベートする。
注：実験条件に依存して、のphalloidinこの工程で添加することができる。 - インキュベーション後、吸引して溶液を除去し、抗体染色を進める。 4℃で4週間 - 3用の1×PBS中の1％BSAを2ml - あるいは、少なくとも1を加算して培養皿を格納する。
5.免疫蛍光プロトコル
- 製造業者の推奨に従って一次および二次抗体溶液を準備します。
NOTE：ポリクローナル500および1：製造業者の推奨を使用できない場合は、（1×PBS中の1％BSA）で一次抗体の良い出発希釈は1 1,000モノクローナル抗体について、二次抗体のための良い出発希釈は1：千。信号が強く、バックグラウンドが問題となる場合には、信号が低く、弱い場合、より高い製造業者から入手したオリジナルの株式のこれらの希釈液を調整します。 - 1×PBS溶液中の1％BSAを吸引する。一次抗体溶液0.5mlを加え、（4℃で）またはO / N（RTで）1時間インキュベートする。 、一次抗体溶液を除去清潔に置き、1.5 mlマイクロチューブを標識し、-20℃で凍結する。
注：必要に応じてこれは、一次抗体の再利用が可能になります。 - 各洗浄後、PBSを除去し、廃棄、1×PBSで5回 - ディッシュ3を洗ってください。
- 二次抗体溶液の0.5ミリリットルを追加します。必要であれば、このステップの間に（どのメーカーの推奨濃度以下）蛍光標識ファロイジンを追加します。 （4℃で）またはO / N（RTで）1時間インキュベートする。
NOTE：蛍光標識ファロイジンの使用は、アクチンフィラメントの可視化を可能にする。我々は488標識ファロイジンは我々のゼブラフィッシュ角膜実質において最適に動作するが、他のフルオロフォアを使用することができることを見出した。 - 二次抗体溶液を除去し、廃棄する。
- 各洗浄後、PBSを除去し、廃棄、1×PBSで5回 - ディッシュ3を洗ってください。
注：皿4℃争うことができない場合に、光からカバーし、保存することができますすぐにワット。 （ - 30分20）、その後の直前次のステップに進むようにPBSを削除する1×PBSは、細胞が完全に乾くけどRTに暖かいないように格納する前に皿に追加されたことを確認してください。 - 準備ができたら、観察する2追加するには - 皿に、実験的なニーズに応じて、DAPIの有無にかかわらず、封入剤の3滴を、室温で10分間放置します。
注：我々はDAPIで市販の、グリセロールベースの封入剤を使用していますが、他の取り付けメディアを使用することができます。皿に座って取り付け媒体10分を許可すると、皿の底からカバーガラスを容易に除去することが容易になります。 - インキュベーション後、軽く緩め、カバースリップを除去するための皿の側面に絞る。スライド上に、下に、細胞をスライドガラス上に取り付けメディアの追加のドロップを追加し、カバースリップを配置。
注： - 2日スライドよりも長い1保持する必要がある場合に明確な爪のポリッシュを使用してスライドにカバースリップを密封することを検討してください。 - 蛍光顕微鏡下でスライドを観察します。
注：私たちの画像のほとんどは、油浸下40Xまたは63X対物レンズを用いて撮影したが、使用される特定の対物レンズは、実験プロトコルに依存します。
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Representative Results
図1に示すように、角膜実質細胞のシートは、移植片培養を確立するための時間以内にスケール直下からの移行を観察することができる。時折、集合的に移行するシートから離れて壊れて個別に移行する角膜実質を観察することができる。外植片が以前に摘み取られていた魚から確立されたように加えて、シートを通って移動する豊富な好中球があります。より長い培養期間で、角膜実質細胞のようなシートフラグメントは、EMT 14を受ける。
シート進歩の初期速度は非常に急速であるが、このレートはすぐに、培養の最初の48時間（ 図2A-C）の間（〜3.1それぞれ倍〜1.8を増やし面積と核間距離によって測定されたと）細胞が広がるように遅くなります。急速な増加は、細胞増殖と関連していない。 （蛍光チミジンアナログエチニルウリジンで24時間標識した後にEDUの）、〜10％の細胞が細胞分裂の証拠は、形質転換された細胞株で見られるよりもはるかに低いが、ヒトの器官培養30にreepithelizationに関与する細胞とより一致率を示す。後の時点で、前縁の前進を困難シート断片（本システム14において観察EMTに関連する現象）を測定した。
24時間後にシートによって覆われた領域は、集団的細胞遊走15,31を変化させる化合物の能力のための迅速なスクリーニングとして使用することができる。処理は、外植片を確立した時点で追加されたときに、シート領域における用量反応が見られる。いくつかの哺乳動物のサイトカイン（ 例えば 、TGF-1 15）（例えば、CXCL12など）、ケモカインおよび小分子阻害剤は、本来、哺乳動物系を特徴（ 例えば 、MMP-2、-9、および-13の阻害剤31）が首尾よく用いられてきた。しかし、24時間でのシート領域が正規分布していないとして（
多くの場合、集合的な移動に対する治療（単数または複数）の効果は、より短い期間で観察される。これらのケースでは、ビデオ顕微鏡、治療に対する集合的に移行するシートの応答をアッセイするために使用することができる。ペプチドを含有する可溶性RGDを破壊するために、培養培地（ 図4の第三のパネル）に追加されたときdhesion形成は、シートの先端におけるラメラは急速に縮小し、その後、シートて引き離すと後退の先端。シート全体が2分以内に引っ込むように、治療に対するシートの応答が迅速であることができる。
図5に示すように、シート内またはリーダーとフォロワーの細胞内のタンパク質の局在化を評価するために、シート全体を固定し、染色することができる。細胞シートが容易に破壊されるように注意が定着プロセス中に注意しなければならない。我々の手では、（特に、サイトゾルタンパク質）は、哺乳動物のタンパク質の機能的ドメインに多くのポリクローナル抗体が交差たちのゼブラフィッシュの外植片中で反応することが見出されている。
図1.細胞シートの一括移行。移植片培養において確立後、角膜実質を移行集団的単位としてのスケールの下から。 （A）と、培養中にわずか2時間後にスケールから離れて移動した細胞の相対量を示している（BE）毎時間、その後撮影（3 -それぞれ6時間で、）。すべての画像は100倍の倍率で撮影した。シーケンス全体は、ビデオ1に示されている。 1フレームは、6時間の期間にわたって30秒毎に撮影された。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
集団の移行図2.特性。いくつかの点で測定し、前縁の前進の初期速度、急速であるが、培養液中の最初の24時間（A）の間に遅くなる。 cとを用いて核間距離とセル面積の測定皮質アクチンで囲まれた面積として測定ultures 4及び24時間後に固定し、参照としてDAPIおよびファロイジンで染色した同じ期間中にあることを示すために、（それぞれの核の中心から測定される）間距離の両方のセル面積が増加する（細胞骨格、（B）および（C）それぞれ）。各グラフは三連で3つの独立した実験の平均（±SEM）を表す。この図は、Rapanan らから変更されている。7 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図集団移行3.アッセイ細胞シート領域を使用して 、 培養の確立中に培養培地に加え、PEPTIDE Z-PLG-NHOH（広域スペクトルMMP）と小分子SB-3CT（MMP2＆特定9）阻害剤は、培養中の24時間（A）の後に細胞シートの面積を小さくする。未処理の細胞シートの面積が指数関数的に（B）が分散されるように、データはテキストで説明青（参照上限またはURLと下限基準値またはLRLに示されるように決定され、中央値の標準誤差の中央値としてプロットされるべきである（ C））。中央値とURLとLRLの違いは、（ライトグリーンに影）は、グラフ上のエラーバーのサイズを決定する。この図は、マクドナルドらから変更されている。31 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図5.免疫蛍光アッセイ細胞を、MMP14a（赤）の触媒ドメインに対する抗体で染色し、蛍光標識（488）ファロイジン（緑）および/ またはDAPIで対比染色した（青）。 （C）及び（D）は、典型的な24時間のシートの一部を示しているが（A）及び（B）は、スケールから現れる典型的な4時間のシートを表す。すべての画像は400倍の倍率で撮影した。 MMP14a染色の強度は、新興のセル（（Bで見られる）と（D））シートと著名な葉状仮足の先端に高いことに注意してください）リーダー細胞（A）と（C）に見られる。 こちらをクリックしてくださいこの図の拡大版を表示します。
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Discussion
培地の添加の前に、3分間 - 角膜実質細胞移植片培養を成功させるために最も重要なステップは、スケールが約2の培養皿に付着させている。スケールの約75％が、シート（各実験のために確立培養の数はそれに応じて調整する必要がある）に付着し成長する。角膜実質細胞シートは、魚から除去し、いくつかの理由のために培養にあらゆる規模の周りに形成しない。まず、外植のDAPI染色は、いくつかのスケールが少数の細胞が付いていることを明らかにし、したがって、それはこれらのスケールは、角膜実質のシートを持っていないことが予想される。第二に、組織培養皿に付着する外植片の能力は、シートの移動のための必須の前提条件である。スケールが付着し、成功した移植片培養が確立されているかどうかの重要な決定因子は、成長表面および培地の添加のスケールを配置する間の時間である。メディアを使用せずに接着するのに不十分な時間がfloatinスケールにつながる長すぎる期間は（売却のエッジに見える細胞の残党との植片の乾燥に恐らく）成長なしとの接着性の尺度になりますしながら、メディアにおけるG（時々目に見える組織に取り付けられている）。スケール皿で配置し、成長培地の添加の間の時間は、乾燥することなく、皿に付着することがどれだけ速く細胞に影響し得る実験室内の温度や湿度などの要因として、実験的に決定される必要があり得る。
市販の、ゼブラフィッシュ特異的抗体の数が増加しているが、利用可能な種々の試薬を制限することができる。免疫原と標的タンパク質の間の85％の相同性は、典型的には、交差反応性のために必要であると考えられる。しかし、このような活性部位、タンパク質 - タンパク質相互作用部位、および修飾部位としてとして機能ドメインは、タンパク質の他の領域よりもより保存され、これらの領域に対する抗ペプチドポリクローナル抗体は、頻繁にあることができる全体の相同性が低くても使用。切断部位は、同様に高度31に保存されている間、触媒およびタンパク質結合部位で96％ -ゼブラフィッシュMMP14aそのヒトオーソログと全体の68％の同一性を有しているが、例えば、79の同一の増加率（値= 0を期待する）。データは、ヒトMMP14aの触媒活性部位に対する抗体は、ゼブラフィッシュ角膜実質細胞培養物と交差反応することを示唆している。ゼブラフィッシュシート中の染色は、前縁31で延伸細胞に局在ことを提案はMMP14は、機械的なセンサ32として機能することができることを示唆している他のデータと一致している。
これは、非滅菌の水槽の水の中で泳ぐ魚から完全に無菌の植片を作成することはできません。我々の実験のほとんどが24時間以内に完了しているように、我々は外植の細菌や真菌汚染との問題を経験しない。しかし、より長いインキュベーション時間が望ましい場合、oを無菌性を維持するF植片が問題になることがあります。インキュベーションの3日以上が関与する実験を計画する際には、いくつかの予防措置を培養物が汚染されていないままにする可能性を高めるために取られる。まず、細菌負荷を低減するために、魚/ mlカナマイシンを100μgの添加を伴うまたは伴わない新鮮な脱塩素水道水を3回交換し、約1時間泳がせている。第二に、培地を抗生物質の適切なレベルを維持し、存在する任意の細菌の数を減らすために、日常的に交換される。特に長いインキュベーション（> 5日間）1×PBSで3回の洗浄を各メディア交換で行われている。しかし、これは、これは培地に交換する必要があるように外植片培養は、外因性化合物で処理したときの実験設計において考慮されなければならない変数を導入する。また、外植片により分泌されるサイトカインおよび成長因子は、各培地交換により除去される。しかしながら、細胞数が低く、メディアのボリュームとしてこの効果は実質的でないことがあり、典型的な角膜実質細胞の外植片に大きい。
魚の鱗が完全に33を再生成するために3週間を必要とするように、我々は魚が実験で魚を繰り返し使用する前に、この期間のために回復することができますことをお勧めします。上皮層を改質することははるかに急速に発生するが、我々は同じ魚を使用しての間の時間の長さがこれを待って魚34で皮膚の創傷治癒に報告されている全身性炎症効果のための機会を最小限にすることを想定しています。
外植片は、長い上皮細胞の挙動を研究するために使用されている。魚種と両生類の多品種から外植は、個人と集団細胞遊走レベル3-6,35-37で同じような運動特性を有している。これらの細胞は、哺乳動物の外植片より明らかに異なる運動特性を有しているが、全体的な構造および構成は類似8,30,38度が高いと思われる14を保存されているようであるが。
私たちは、このプロトコルは、私たちは14の創傷治癒の初期段階をモデル化する一次細胞外植片を用いて、ゼブラフィッシュ角膜実質の集合的な移行を検討することを可能にすることを見出した。新たに確立された初代培養物を用いた実験を行うことは、シリアル初代細胞の継代または形質転換された細胞株の使用に関連する問題を回避する。外植片を培養が確立されたときにEMTが開始されるように、皮膚創傷治癒におけるEMTの役割を研究するために使用することができる。我々の研究は、これらの一次外植をより正確に生体内で負傷した上皮層内の角膜実質の自然な行動と移行を模倣することを示唆している。このプロトコルは、移動アッセイにおいて使用するための初代培養を確立するための、ならびに実験的コンディットの一見無限の配列内の遺伝子および/またはタンパク質発現の変化を調べるための基礎を提供するイオン。手順は、迅速、簡単、安価で、再現可能な、任意の研究機関での使用に適している。
要約すると、この外植技術は、EMTを受けている創傷治癒モデルの文脈における集団的細胞移動のための迅速なアッセイを提供する。配向スケール複数の層のいくつかの細胞型の存在は、このex vivoで培養システムに複雑さを提供する。
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Disclosures
著者らは、開示することは何もない。
Acknowledgments
健康科学研究促進助成金の中西部の大学からの資金によってサポートされていたこの作品は、研究とスポンサープログラム学内グラントのオフィスKJLに授与EEHと中西部の大学に授与。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm Glass Bottom Culture Dishes (Poly-D Lysine Coated) | MatTek | P35GC-1.5-14-C | 1.5 mm thickness is best for coverslip removal. 14 mm diameter provides more culture area. |
| Swiss Jewelers Style Forceps, Integra, Miltex 17-303 | VWR | 21909-460 | We find that narrow, fine forceps work the best for scale removal. |
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