Summary
Zebravis keratocyten migreren celvellen van explantaten en verschaffen een in vitro model voor de studie van de mechanismen van collectieve celmigratie in de context van epitheliale wondgenezing. Deze protocollen detail een effectieve manier om primaire explantkweken stellen voor gebruik in collectieve celmigratie assays.
Abstract
Vanwege hun unieke beweeglijke eigenschappen, vis keratocyten losgekoppeld van explantkweken zijn lang gebruikt om de mechanismen van cel migratie te bestuderen. Wanneer echter explantaten worden vastgesteld, deze cellen gezamenlijk bewegen ook behoud vele eigenschappen die afzonderlijke keratocyten een aantrekkelijke model migratie studeren: hoge snelheden van motiliteit uitgebreide actine-rijk lamellen met een loodrechte actine kabel, en betrekkelijk constante snelheid en trekrichting. In het begin van explantaten, de snelle onderlinge omzetting van cellen migreren individueel met die migreren collectief maakt de studie van de rol van cel-cel adhesie bij het bepalen van de wijze van migratie, en benadrukt de moleculaire banden tussen de twee modi van de migratie. Cellen in latere explantaten verliezen hun vermogen om snel en gezamenlijk migreren als epitheliale naar mesenchymale overgang plaatsvindt en genen geassocieerd met wondgenezing en ontsteking op differentiële expressie. Aldus kan keratocyte explantaten dienen als een in vitro model voor de reepithelialization die tijdens cutane wondgenezing en een uniek systeem om mechanismen van collectieve celmigratie te onderzoeken in het kader van een bepaald programma van genexpressie verandert vertegenwoordigen. Verschillende mutant en transgene zebravis lijnen beschikbaar, waardoor explantaten worden vastgesteld uit vis met verschillende genetische achtergronden. Hierdoor kan de rol van de verschillende eiwitten in deze processen uniek worden aangepakt. De hier beschreven protocollen beschrijven een eenvoudige en effectieve methode voor het vaststellen van deze explantkweken voor gebruik in verschillende assays inzake collectieve celmigratie.
Introduction
Studies van celmotiliteit traditioneel geconcentreerd op individuele migrerende cellen. Keratocyten gekweekte uit vis en amfibie explants hebben bewezen een krachtig model systeem om de mechanismen van celbeweeglijkheid bestuderen met behulp van zowel experimentele en wiskundige modellering benadert 1-6 zijn. Experimenten op individueel migrerende cellen wordt bevorderd door de snelle, glijden beweging van de cellen, terwijl een gelijkmatige vorm, snelheid en richting. In vivo cellen bewegen vaak samen met behoud van cel-cel contacten, vooral tijdens de embryogenese, wondheling en metastase. Zo collectieve cel migratie is een groeiende en steeds meer prominente gebied van onderzoek binnen het gebied van de cel migratie. De collectieve migratie van deze cellen is onlangs beschreven 7 en het heeft vele unieke eigenschappen die het een krachtig systeem van collectieve cel migratie te bestuderen in een wondgenezing model te maken.
ove_content "> Wanneer schalen worden geplukt van een verdoofde volwassen zebravissen, blijft wat epitheelweefsel op de onderkant van de schaal. Als kweekmedium wordt toegevoegd, deze epitheelcellen of keratocyten, migreren snel collectief eenheid van de schaal. De explantaatkweek kan worden gezien als een epitheliale wondgenezing model, waarin de cellen migreren van het explantaat zoals zij in de voorlopige matrix van een wondbed een intact epitheel herstellen. Recente gegevens suggereren dat deze ex vivo kweken bootst vele functies van in vivo wondgenezing in volwassen zebravissen. wondsluiting bekijken 8 vertalen naar een migratie snelheid vergelijkbaar met die waargenomen in de ex vivo systeem 7. Bovendien, in een in vivo model wondgenezing, behandeling met warfarine suggereert dat hemostase heeft geen effect op koers van genezing, terwijl behandeling met hydrocortison immuunrespons verminderen niet reepithelialization 8 vertragenDe hier gepresenteerde protocol beschrijft hoe zebravis keratocyte explantkweken dat consistentie en reproduceerbaarheid voor gebruik in vele biologische assays kan verzekeren. Deze explantkweken zijn bijzonder dwingend in vitro model voor collectieve celmigratie om verschillende redenen. Ten eerste, de zebravis keratocyten zijn primaire cellen die worden gebruikt binnen enkele uren na oprichting explantkweken. Daarom zijn deze cellen niet de morfologische en genexpressie veranderingen geassocieerd met een passage van primaire cellen 9-13 ondergaan. Ten tweede, dit systeem is een model voor de studie van reepithelialization reactie op verwonding 14 en het kader van de respons op verwonding, een epitheliale naar mesenchymale transition (EMT) wordt geïnitieerd zoals blijkt uit veranderingen in genexpressie en herschikkingen van het cytoskelet 14,15. Zo hebben de achtergrond veranderingen in genexpressie en motiliteit die voorkomen in onbehandelde cellen gekarakteriseerd en een context verandert met behandeling interpreteren. Bovendien, de vis keratocyte en de menselijke keratinocyt functioneel gelijkwaardig; zowel de primaire epitheelcellen van hun respectieve soorten en spelen een belangrijke rol in epitheliale wondgenezing. Ten derde, volwassen zebravissen winnen erkenning als modelsysteem voor diverse humane ziekten waaronder 16-18 melanoom en andere kankers 19-21, cutane wondgenezing 8,14 en weefselregeneratie 22-24.
Technische voordelen van dit model systeem zijn even overtuigend. Een groeiend aantal mutant en transgene lijnen zijn verkrijgbaar bij non-profit, gecentraliseerde faciliteiten. Met name de zebravis Mutation Project (ZMP) En het Wellcome Trust Sanger Institute beoogt een knockout allel in elk eiwit coderende gen in de zebravis genoom maken. Momenteel hebben zij gemuteerde 11.892 genen, ongeveer 45% van het genoom, met 24.088 allelen gekarakteriseerd. Daarnaast ZMP accepteert voorstellen en zal knock-outs kosteloos te genereren. Recente werkwijzen gen knockdown in larven en volwassen zebravissen 25-28 flexibiliteit bieden om de functie van ontwikkelings belangrijk genen waarvoor transgene benaderingen problematisch of onpraktisch bestuderen.
Vanwege hun extreem hoge snelheden van beweeglijkheid van ~ 145 um / uur kort na instelling van culturen 29 kunnen assays snel af (gewoonlijk 24 uur of minder). Zoals experimenten snel kan worden afgerond en culturen groeien goed bij RT, een aantal van de technische hindernissen in verband met zoogdiercellen migratie assays waarbij videomicroscopie worden vermeden. Bovendien, in de leeftijd van aanscherping onderzoeksbudgetten, zebrafachtig zijn gemakkelijk en goedkoop onderhouden.
De structuur en het gedrag van de explantatie is complex. Als de vis niet bloeden wanneer de schaal wordt verwijderd, is het onwaarschijnlijk dat meer dan de oppervlakkige epidermale lagen worden verwijderd met de schaal. Keratocyten lijken het overheersende celtype in het explantaat wanneer weegschaal eerst worden verwijderd uit de vis als de meeste cellen blijken vlek met een anti-E-cadherine antilichaam 14. Bovendien is er geen bewijs van fibroblasten in de initiële kweek zoals beoordeeld door de afwezigheid van vimentine kleuring met immunofluorescentie 14. Echter, met herhaalde schaal verwijderen, lijken er tal van neutrofielen in de explantatie (zie video 1). We hebben deze cellen zoals neutrofielen gebaseerd op morfologische waarnemingen van hun grootte, snel motiliteit en de migratie van de cellaag die bij blootstelling aan LPS (gegevens niet getoond). Bovendien, deze cellen vlek helder with een antilichaam tegen neutrofiel cytosol factor en met een verscheidenheid van secundaire IgG antilichamen, wat aangeeft dat zij over grote FcR op hun oppervlak (gegevens niet getoond). Meerdere cellagen aanwezig zijn binnen de explantatie. Confocale microscopie onthult de aanwezigheid van een enkele laag bij bovenrand meer dan twee lagen van keratocyten nabij de schaal neutrofielen zichtbaar boven, onder en tussen de cellen keratocyte vellen.
Op vroege tijdstippen cellen op de rand van de meerlaagse explantaat polariseren, initiëren collectieve migratie van keratocyten van het explantaat op beginsnelheden van ~ 145 um / uur. Het gebied dat door de explantatie snel toe, wat leidt tot cel verspreiden, spanning in het vel, en een verminderde snelheid van tevoren van de voorrand. Rapid interconversies tussen leider en volger cellen worden waargenomen op de voorste rand tijdens de vorming en de sluiting van spontaan gevormde gaten in de plaat 7. Aangezien deEMT proces gestart met de explantatie blijft, het vel fragmenten en de keratocyten verliezen hun gespecialiseerde, snelle beweeglijkheid. Genexpressie en morfologische veranderingen overeenstemming met EMT, wondgenezing en ontstekingsreacties optreden binnen 7 dagen kweken met explantaten wordt nog gedurende ongeveer 10 dagen 14 beschouwd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dit protocol voldoet aan de AVMA Dierenwelzijn Principes voor de verzorging en het gebruik van proefdieren en is goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) in het Midwesten University goedgekeurd.
1. Voorbereiding van de anesthesie, apparatuur, & Media
- Dechloreren ongeveer 1,5 liter leidingwater met behulp van een commercieel dechlorinating middel (verkrijgbaar bij dierenwinkels) of door te laten water staan voor 24 uur. Verkrijgen drie 1 L bekers en vul elk met 500 ml gedechloreerd water. Label één voor het bewaren van vis vóór elke procedure en één voor herstel. Om de derde beker, 100 ug / ml tricaïne methaansulfonaat; wordt dit de beker waarin vis zal worden verdoofd.
- Vul een ondiepe bak met ijs, warm het kweekmedium (RPMI 1640, 10% FBS (foetaal serum), 50 ug / ml gentamycine, 100 ug / ml kanamycine, 25 mM HEPES) aan RT, en het verzamelen van een pincet schoon juwelier. Schoon pincet door immerzingen de tips in 70% ethanol en passeren een bunsenbrander, waardoor de ethanol te branden uit.
- Beslissen of de procedure zal worden uitgevoerd zonder vergroting, met een commerciële, table-top verlichte vergrootglas met 2 - 10x vergroting, of dissectiemicroscoop (geheel afhankelijk van persoonlijke voorkeur).
2. Vaststellen explantkweken
- Vang het gewenste aantal vissen en plaats in een bedrijf beker. Transfer een enkele vis aan de anesthesie beker; is het het beste om de vissen afzonderlijk verdoven.
- De effecten van de verdoving door naar het zwemmen en kieuw beweging van de vis. Als anesthesie vordert, kieuw beweging vertraagt en de vis zal onregelmatig en vaak ondersteboven zwemmen; beschouwen vis verdoofd zodra kieuw beweging ophoudt. Laat de vis niet voor langere tijd achter in de anesthesie bad, omdat dit kan leiden tot de dood van de vis.
- Verwijder vis uit de narcose beker en overdrachtom ijs, het plaatsen van de vis horizontaal met de staart geconfronteerd met de hand houden van de pincet. Als ervaren met de techniek en als er meerdere vissen worden gebruikt om explantaten maken, overwogen om de volgende vissen in de anesthesie bekerglas op dit moment.
- Om schilfers te verwijderen, positie pincet parallel aan de vis met tip aan de rand van de schaal. Druk platte kant van de pincet enigszins in de zijkant van de vis te veroorzaken de schaal verheffen van het lichaam van de vis. Pak schaal met een pincet, plukken, en plaats (zonder inversie) in weefselkweek schotel. Herhaal de procedure verwijdert maximaal 12 schalen van een grote volwassen (6 aan elke kant), het vermijden van de kieuw gebied, de laterale lijn en vinnen.
- Leg de vis in het herstel bekerglas en om te garanderen dat herstelt van de effecten van narcose. Op dit moment kan vissen worden overgebracht naar een afzonderlijke tank. Laat de vis om te herstellen gedurende ten minste 21 dagen voor volledige schaal regeneratie.
- Afhankelijk van deexperimenteel ontwerp, plaatsen tot 20 schalen per plastic 35 mm weefselkweek behandeld gerecht of 4-6 schalen per glazen bodem schotel. Laat schalen te houden aan de schotel voordat voorzichtig toevoegen van media, zodat er geen schubben van de schotel los.
OPMERKING: Met ervaring kunnen meerdere vissen worden verwerkt voordat medium wordt toegevoegd aan de eerste schotel. - Voeg 1,2 ml van complete media (zie 1.2 hierboven) in elke 35 mm schaal.
- Bij voorkeur explantkweken incuberen bij 28 ° C in 5% CO2 gedurende de gewenste tijdsduur met of zonder verdere behandeling. Als alternatief, incubeer culturen op een verwarmde microscoop podium of in een live celcultuurkamer voor video-microscopie.
3. Helderveld en Video Microscopie
- Positie gerechten bevatten cel vellen op de microscoop podium en in eerste instantie richten met behulp van de 4X objectief.
OPMERKING: hogere vergrotingen kunnen worden gebruikt, afhankelijk van het experiment. Markeren van de locatie vanelke cel en / of de oriëntatie van de schotel op het podium zal vergemakkelijken het maken van opnamen in de tijd met de lakens in ongeveer dezelfde oriëntatie. - Verwijder gerechten uit de couveuse en een foto op verschillende tijdstippen, volgens elke experimentele protocol en plaats terug in de couveuse als alleen stilstaande beelden zijn nodig over de experimentele periode.
- Tijdens het uitvoeren van video-microscopie, let dan op het volgende:
- Plaats de schaal / opkomende cellaag binnen het gezichtsveld zodanig dat de migrerende cellaag blijft het gezichtsveld voor de duur van de video.
LET OP: Dit kan enige ervaring in het observeren van hoe cellen migreren van onder de schaal te nemen. Voor korte video's, dit is minder groot probleem dan voor langere video's. - Voor kortere termijnen, incuberen bij kamertemperatuur. Voor langere termijnen (18+ uur), gebruik maken van een verwarmd podium of een incubatiekamer om op temperatuur te houden, pH-balans, en om verdamping van de cultuur m minimaliserenedium.
- Plaats de schaal / opkomende cellaag binnen het gezichtsveld zodanig dat de migrerende cellaag blijft het gezichtsveld voor de duur van de video.
4. Fixatie voor Immunofluorescentiemicroscopie
- Bereid en voorverwarmen alle oplossingen tot 28 ° C. Om keratocyten bekijken onder fluorescentie, groeien explantkweken zoals hierboven met behulp van een glazen bodem 35 mm weefselkweekschalen beschreven. U kunt ook gebruik maken van glazen kamer dia's.
- Voeg 0,8 ml van 4% paraformaldehyde in 1,1 x PBS elk gerecht. Laat de cultuur media niet eerst te verwijderen. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 min zuigen vervolgens de oplossing te verwijderen.
- Voeg 0,8 ml van 4% paraformaldehyde in 1,1 x PBS elk gerecht. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 min zuigen vervolgens de oplossing te verwijderen.
- Tenzij met externe liganden of externe epitopen permeabilize cellen door toevoeging van 0,5 ml 0,2% Triton X-100 in 1X PBS. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 min zuigen vervolgens de oplossing te verwijderen.
- Voeg 0,5 ml van 1% BSA in 1x PBS en incubeer gedurende 1 uur (bij kamertemperatuur) of O / N (bij 4 ° C).
OPMERKING: Afhankelijk van de experimentele omstandigheden, phalloidin worden toegevoegd in deze stap. - Na incubatie, aspireren om de oplossing te verwijderen en doorgaan met antilichaamkleuring. Alternatief, slaan de kweekschalen door toevoegen van ten minste 1-2 ml van 1% BSA in 1x PBS gedurende 3-4 weken bij 4 ° C.
5. Immuunfluorescentie Protocol
- Bereid primaire en secundaire antilichaam-oplossingen op basis van aanbevelingen van de fabrikant.
OPMERKING: Als fabrikant aanbevelingen zijn niet beschikbaar, een goed uitgangspunt verdunning van primaire antilichamen (in 1% BSA in 1x PBS) is 1: 500 voor polyklonale en 1: 1.000 voor monoklonale antilichamen; een goed uitgangspunt verwatering voor secundaire antilichamen is 1: 1.000. Pas deze verdunningen van de oorspronkelijke voorraad bij de fabrikant hoger als het signaal zwak is, lager als het signaal is sterk en de achtergrond is een probleem. - Zuig het 1% BSA in 1x PBS oplossing. Voeg 0,5 ml primair antilichaam oplossing en incubeer gedurende 1 uur (bij kamertemperatuur) of O / N (bij 4 ° C). Verwijder het primaire antilichaam oplossing, te plaatsen in een schone en gelabelde 1,5 ml microcentrifugebuis en invriezen bij -20 ° C.
Opmerking: Dit maakt het hergebruik van het primaire antilichaam, indien nodig. - Was de schaal 3-5 keer met 1x PBS, het verwijderen en weggooien van de PBS na elke wasbeurt.
- Voeg 0,5 ml secundair antilichaam oplossing. Voeg desgewenst fluorescentie-gemerkt falloïdine (na aanbevolen concentratie elke fabrikant) tijdens deze stap. Incubeer gedurende 1 uur (bij kamertemperatuur) of O / N (bij 4 ° C).
OPMERKING: gebruik van fluorescentie-gemerkt falloïdine maakt visualisatie van actine filamenten; We hebben gevonden dat 488-gelabelde phalloidin werkt het best in onze zebravis keratocyten, maar andere fluoroforen worden gebruikt. - Verwijderen en het secundaire antilichaam oplossing weggooien.
- Was de schaal 3-5 keer met 1x PBS, het verwijderen en weggooien van de PBS na elke wasbeurt.
OPMERKING: Het gerecht kan worden opgeslagen, gedekt uit licht, bij 4 ° C, indien niet in staat te wedijverenw onmiddellijk; zorg ervoor dat 1x PBS wordt toegevoegd in de schaal voor het opslaan om ervoor te zorgen de cellen niet uitdrogen, maar warm aan RT (20 - 30 min), verwijder de PBS net voor u verder gaat met de volgende stap. - Wanneer klaar te observeren, voeg 2-3 druppels fixeermiddel, met of zonder DAPI, afhankelijk van de experimentele behoeften in de schaal en laat zitten voor 10 minuten bij kamertemperatuur.
LET OP: We maken gebruik van een in de handel verkrijgbaar, glycerol op basis van montage medium met DAPI, maar andere montage media kunnen worden gebruikt. Rekening 10 min voor het fixeermiddel te zitten in de schaal vergemakkelijkt verwijdering van de glazen dekglaasje van de bodem van de schaal. - Na incubatie knijp aan de zijkanten van de schaal los te maken en verwijderen dekglaasje. Voeg een extra druppel fixeermiddelen op een glasplaatje en plaats het dekglaasje, cellen beneden op de glijbaan.
OPMERKING: Overweeg het afdichten van de dekglaasje aan de dia met behulp van duidelijke nagellak als de dia moet langer dan 1 moeten worden gehouden - 2 dagen. - Let op de dia onder een fluorescentie microscoop.
NB: De meeste van onze beelden werden genomen met een 40x of 63x objectief met olie-immersie, maar de specifieke objectieflens zal afhangen van het experimentele protocol.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Zoals geïllustreerd in figuur 1, kunnen vellen keratocyten opgemerkt migreren uit onder de omvang binnen uren van vaststelling van explantaatkweek. Af en toe kan een individueel migreren keratocyte die weg heeft gebroken van het collectief migreren plaat in acht worden genomen. Bovendien, als het explantaat werd vastgesteld uit een vis die eerder geplukt, zijn er overvloedige neutrofielen migreren door het vel. Bij periodes langer cultuur, de keratocyte vel fragmenten als cellen ondergaan EMT 14.
De initiële snelheid van blad vooruitgang is extreem snel, maar dit percentage snel vertraagt als cellen verspreid (gemeten per gebied en internucleaire afstand die toenemen ~ 1,8 en ~ respectievelijk 3,1 vouwen) gedurende de eerste 48 uur van de cultuur (Figuur 2A-C). De snelle toename is niet geassocieerd met celproliferatie; na labeling 24 uur fluorescentielicht thymidine analoge ethynyl deoxyuridine (EDU), ~ 10% van de cellen een bewijs vertonen van de celdeling, een percentage veel lager dan gezien in getransformeerde cellijnen, maar meer in overeenstemming met de bij reepithelization in menselijke organotypische culturen 30 cellen. Op latere tijdstippen, het vel fragmenten (een fenomeen dat in verband met de EMT waargenomen in dit systeem 14), die de opmars van de leading edge moeilijk maakt om te meten.
Het gebied onder de platen na 24 uur, kan worden gebruikt als een snelle scherm voor het vermogen van verbindingen collectief celmigratie 15,31 veranderen. Als de behandeling wordt toegevoegd op het moment explantaten worden vastgesteld, kan een dosis-respons in bladgebied zien. Sommige cytokinen zoogdier (bijvoorbeeld TGF-1, 15), chemokinen (zoals CXCL12) en kleine molecule inhibitoren oorspronkelijk kenmerk zoogdiersystemen (bijvoorbeeld MMP-2, -9 en -13 remmers 31) zijn met succes toegepast. Zoals vel zones van 24 uur niet normaal verdeeld (
In veel gevallen worden de effecten van de behandeling (en) op collectieve migratie waargenomen in kortere tijd. In deze gevallen kan video microscopie worden gebruikt om de reactie van de collectieve plaat migreren behandeling assay. Wanneer oplosbare RGD bevattend peptide wordt toegevoegd aan het kweekmedium (derde paneel in figuur 4) naar een verstorendhesion formatie, de lamellen aan de voorste rand van het vel snel krimpen en vervolgens de voorste rand van het vel los en trekt. Omdat het hele blad terugtrekt in minder dan 2 minuten, kan reactie van het vel behandeling snel zijn.
Om lokalisatie van eiwitten in de plaat of binnen leider en volger cellen bepalen, kan het gehele vel wordt gefixeerd en gekleurd, zie figuur 5. Zorg moet worden genomen tijdens de fixatie proces de celvellen gemakkelijk verstoord. In onze handen hebben vele polyklonale antilichamen voor de functionele domeinen van zoogdiereiwitten (vooral van cytosolische eiwitten) bleken kruisreactie in onze zebravis explantaten.
Figuur 1. Collectieve migratie van cellen vellen. Na de oprichting in explantaatkweek, keratocyten migrerenuit onder de schaal als een collectieve eenheid. (A) illustreert de relatieve hoeveelheid cellen die weg van de weegschaal na 2 uur zijn gemigreerd in kweek, met (BE) die elk uur daarna (3-6 uur, respectievelijk). Alle beelden werden genomen bij 100X vergroting. De hele reeks is te zien in Video 1; één frame werd genomen om de 30 sec over de 6 uur tijd. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2. Kenmerken van Collective Migratie. Initiële snelheid van de opmars van de leading edge, gemeten op verschillende punten, is een snelle maar vertraagt tijdens de eerste 24 uur in kweek (A). Meting van internucleaire afstand en mobiele gebied met behulp van cultures vastgesteld op 4 en 24 uur en gekleurd met DAPI en falloïdine als referentie vermeld dat gedurende dezelfde periode, zowel internucleaire afstand (gemeten vanaf het midden van elke kern) en het celoppervlak toeneemt (gemeten als gebied binnen de corticale actine cytoskelet, (B) en (C) respectievelijk). Elke grafiek geeft de gemiddelde (± SEM) van drie onafhankelijke experimenten in triplo. Dit cijfer is gewijzigd van Rapanan et al. 7 Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3. Analyse van Collective Migration behulp cellaag Area. Toen aan het kweekmedium toegevoegd tijdens oprichting van de cultuur, Peptide Z-PLG-NHOH (breed spectrum MMP) en kleine moleculen SB-3CT (MMP2 & 9 specifieke remmers) te verlagen cellaag gebied na 24 uur in de cultuur (A). Omdat het gebied van onbehandelde cel vellen exponentieel verdeeld is (B), moeten de gegevens worden uitgezet als medianen met standaard error van het gemiddelde bepaald zoals beschreven in de tekst en aangegeven in blauw (bovenste verwijzing beperken of URL en lagere verwijzing beperken of LRL; ( C)). Het verschil tussen de mediaan en de URL en LRL bepalen de grootte van de foutbalken in de grafiek (gearceerd lichtgroen). Dit cijfer is gewijzigd van McDonald et al. 31 Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4. Toevoeging van oplosbare RGD Peptide Leidt tot Gezinsblad terugtrekken. Tijdens de voorbehandeling en na toevoeging van een RGE-bevattend peptide, de cellaag blijft om verder te gaan. 15 seconden na toevoeging van een RGD-bevattend peptide, er een afname in de lamellen aan de voorrand (inserts). Na nog eens 30 sec, het blad begint te trekken, een terugloop die blijft tijdens de duur van de video (totale lengte van de video ~ 5 min, zie video 2). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 5. immunofluorescentietest. Cellen werden gekleurd met een antilichaam tegen het katalytische domein van MMP14a (rood) en tegengekleurd met fluorescent-gelabelde (488) phalloidin (groen) en / of DAPI(Blauw). (A) en (B) vertegenwoordigen een typische 4 hr plaat die uit de schaal, terwijl (C) en (D) tonen een gedeelte van een typische 24 uur vel. Alle beelden werden genomen bij 400X vergroting. Merk op dat de intensiteit van kleuring MMP14a hoger aan de voorrand van de nieuwe cel vellen (waargenomen in (B) en (D)) en prominente lamellipodia worden gezien in de leader cellen (A) en (C)). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De meest kritische stap voor het succes van keratocyte explantaatkweek is waardoor de schaal te houden aan de kweekschaal gedurende ongeveer 2-3 min vóór toevoeging van het kweekmedium. Ongeveer 75% van de schalen zal zich houden en te groeien vellen (het aantal vastgesteld voor elk experiment culturen zullen moeten worden aangepast). Keratocyte vellen geen deel om elke schaal verwijderd uit de vis en in cultuur om verschillende redenen. Eerst DAPI kleuring van explantaten blijkt dat sommige schalen weinig gehechte cellen en aldus wordt verwacht dat deze schalen niet vellen keratocyten zal hebben. Ten tweede, het vermogen van explantaten zich te houden aan de weefselkweek gerecht is een essentiële voorwaarde voor vel migratie. Een belangrijke determinant van de vraag of schubben hechten en een succesvolle explantaatkweek vaststaat is de tijd tussen het plaatsen van de schaal op de groei van het oppervlak en de toevoeging van de media. Onvoldoende tijd om zich te houden zonder de media zal leiden tot schalen zweeftg media (soms met zichtbare weefsel aangesloten) terwijl te lange tijd resulteert in hechtende schalen zonder groei (waarschijnlijk door uitdrogen van het explantaat met celrestanten zichtbaar aan de rand van de verkoop). De tijd tussen schaal plaatsing in de schaal en het toevoegen van groeimedium moet experimenteel bepaald worden, als factoren zoals temperatuur en vochtigheid in de laboratoriumruimte kan beïnvloeden snel cellen kunnen hechten aan de schaal zonder uitdrogen.
Ofschoon het aantal commercieel beschikbare zebravis antilichamen toeneemt, kan het aantal beschikbare reagentia beperkend. Een 85% homologie tussen immunogeen en doelproteïne is typisch voor cross-reactiviteit noodzakelijk geacht. Aangezien functionele domeinen, zoals actieve plaatsen, eiwit-eiwit interactie plaatsen en plaatsen van modificatie meer geconserveerd dan andere gebieden van het eiwit, kan anti-peptide polyklonale antilichamen gericht tegen deze gebieden ligt vaakgebruikt, zelfs als de totale homologie is laag. Hoewel bijvoorbeeld zebravis MMP14a een totale 68% identiteit met humane ortholoog (verwachten value = 0), de fractie van identiteit stijgt tot 79-96% in katalytische en eiwitbindingsplaatsen terwijl knipplaatsen zijn eveneens sterk geconserveerd 31. De gegevens suggereren dat een antilichaam gericht tegen de katalytisch actieve plaats van humaan MMP14a kruisreageert met zebravissen keratocyten culturen. De suggestie dat de kleuring in zebravis bladen aan de voorrand 31 kan lokaliseren aan de gestrekte cellen is in overeenstemming met andere gegevens suggereren dat MMP14 een mechanische sensor 32 kan dienen.
Het is niet mogelijk een volledig steriele explantaat creëren van een vis zwemmen in steriel water aquariums. Zoals de meeste van onze experimenten binnen 24 uur klaar zijn, ervaren we geen problemen met bacteriën of schimmels besmetting van explantaten. Wanneer echter langere incubatietijd gewenst, handhaven steriliteit of explants kan een probleem worden. Bij het plannen van een experiment met 3 of meer dagen incubatie, zijn verschillende maatregelen genomen om de kans dat de culturen onbesmet blijven toenemen. Ten eerste, om de bacteriële verontreiniging te verminderen, wordt de vis te zwemmen toegestaan voor ongeveer 1 uur in 3 veranderingen van verse, gedechloreerd kraanwater met of zonder de toevoeging van 100 ug / ml kanamycine. Ten tweede is de media uitgewisseld op een dagelijkse basis om een adequaat niveau van antibiotica te behouden en vermindering van het aantal bacteriën aanwezig. Voor bijzonder lange incubatie (> 5 dagen) drie wassingen met 1x PBS worden uitgevoerd met elke media-uitwisseling. Echter wordt een variabele die moet worden onderzocht proefopzet wanneer de explantaatkweek behandeld met een exogeen verbinding als deze moet worden vervangen met de media. Daarnaast zullen cytokinen en groeifactoren uitgescheiden door de explantatie worden verwijderd met elke media-uitwisseling. Aangezien het aantal cellen is laag en de hoeveelheid mediagroot is typisch keratocyte explantaat, kan dit effect niet substantieel.
Als vis schubben nodig 3 weken volledig te regenereren 33, raden wij waardoor de vis om te herstellen voor deze periode van tijd voordat herhaald gebruik van de vis in experimenten. Hoewel veel sneller hervormen van de epitheellaag optreedt, veronderstellen we dat wachten deze tijdsduur tussen het gebruik van dezelfde vis minimaliseert de kans op systemische inflammatoire effecten die zijn gemeld bij cutane wondgenezing in vis 34.
Explantaten zijn lang gebruikt om het gedrag van epitheliale cellen te bestuderen. Explantaten uit een breed scala aan vissoorten en amfibieën hebben vergelijkbare beweeglijke eigenschappen bij de individuele en collectieve cel migratie 3-6,35-37. Deze cellen hebben duidelijk verschillende bewegende objecten dan zoogdieren explantaten maar de algehele structuur en organisatie lijken een grote gelijkenis hebben 8,30,38 14.
Wij hebben gevonden dat dit protocol kunnen we de collectieve migratie van zebravis keratocyten gebruikmakend van primaire cel explantaten dat de vroege stadia van wondgenezing 14 modelstudie. Het uitvoeren van experimenten met behulp van nieuw gevestigde primaire culturen voorkomt problemen in verband met seriële passage van primaire cellen of het gebruik van getransformeerde cellijnen. Explantaten kan worden gebruikt om de rol van EMT bestuderen cutane wondgenezing als EMT begint wanneer kweken worden vastgesteld. Onze studies suggereren dat deze primaire explants nauwkeuriger het natuurlijke gedrag en de migratie van keratocyten binnen de gewonden epitheellaag in vivo na te bootsen. Dit protocol vormt de basis voor om primaire kweken voor gebruik in migratie assays en voor de behandeling veranderingen in gen en / of eiwitexpressie in een schijnbaar eindeloze reeks van experimentele Conditionen. De procedures zijn snel, gemakkelijk, goedkoop, reproduceerbaar, en geschikt voor gebruik op elke onderzoeksinstelling.
Samengevat, deze explantaat verschaffen een snelle test voor collectieve celmigratie in de context van een wondgenezing model dat ondergaat EMT. De aanwezigheid van verschillende celtypes in meerdere lagen met een oriënterende schaal geeft de complexiteit van deze ex vivo kweeksysteem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door fondsen van het Midwesten University College of Health Sciences Research Faciliteren Grant toegekend aan EEH en Midwesten Universiteit Bureau voor Onderzoek en gesponsorde programma's Intramurale Grant toegekend aan KJL.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm Glass Bottom Culture Dishes (Poly-D Lysine Coated) | MatTek | P35GC-1.5-14-C | 1.5 mm thickness is best for coverslip removal. 14 mm diameter provides more culture area. |
| Swiss Jewelers Style Forceps, Integra, Miltex 17-303 | VWR | 21909-460 | We find that narrow, fine forceps work the best for scale removal. |
References
- Burton, K., Park, J. H., Taylor, D. L. Keratocytes generate traction forces in two phases. Molecular Biology of the Cell. 10, 3745-3769 (1999).
- Keren, K., et al. Mechanism of shape determination in motile cells. Nature. 453, 475-480 (2008).
- Lacayo, C. I., et al. Emergence of large-scale cell morphology and movement from local actin filament growth dynamics. PLOS Biology. 5, 233 (2007).
- Lee, J., Ishihara, A., Theriot, J. A., Jacobson, K. Principles of locomotion for simple-shaped cells. Nature. 362, 167-171 (1993).
- Kolega, J.
- Kolega, J. Effects of mechanical tension on protrusive activity and microfilament and intermediate filament organization in an epidermal epithelium moving in culture. The Journal of Cell Biology. 102, 1400-1411 (1986).
- Rapanan, J. L., Cooper, K. E., Leyva, K. J., Hull, E. E. Collective cell migration of primary zebrafish keratocytes. Experimental Cell Research. 326, 155-165 (2014).
- Richardson, R., et al. Adult Zebrafish as a Model System for Cutaneous Wound-Healing Research. Journal of Investigative Dermatology. 133, 1655-1665 (2013).
- Cheon, H., et al. Increased expression of pro-inflammatory cytokines and metalloproteinase-1 by TGF-b1 in synovial fibroblasts from rheumatoid arthritis and normal individuals. Clinica., & Experimental Immunology. 127, 547-552 (2002).
- Sandeman, S. R., Faragher, R. G. A., Allen, M. C. A., Liu, C., Lloyd, A. W. Does MMP-2 expression and secretion change with increasing serial passage of keratocytes in culture. Mechanisms of Ageing and Development. 122, 157-167 (2001).
- Schnaper, H. W., et al. Increased expression of extracellular matrix proteins and decreased expression of matrix proteases after serial passage of glomerular mesangial cells. Journal of Cell Science. 109, 2521-2528 (1996).
- Tondreau, T., et al. In vitro study of matrix metalloproteinase/tissue inhibitor of metalloproteinase production by mesenchymal stromal cells in response to inflammatory cytokines: the role of their migration in injured tissues. Cytotherapy. 11, 559-569 (2009).
- Zimmermann, T., et al. Isolation and characterization of rheumatoid arthritis synovial fibroblasts from primary culture - primary culture cells markedly differ from fourth-passage cells. Arthritis Research. 3, 72-76 (2001).
- McDonald, T. M., et al. Zebrafish keratocyte explant cultures as a wound healing model system: differential gene expressio., & morphological changes support epithelial–mesenchymal transition. Experimental Cell Research. 319, 1815-1827 (2013).
- Tan, B., Pascual, A., de Beus, A., Cooper, K., Hull, E. TGFb (transforming growth factor b) and keratocyte motility in 24-hour zebrafish explant cultures. Cell Biology International. 35, 1131-1139 (2011).
- Barut, B. A., Zon, L. I. Realizing the potential of zebrafish as a model for human disease. Physiological Genomics. 2, 49-51 (2000).
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nature Reviews Genetics. 8, 353-367 (2007).
- Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. The Journal of Clinical Investigation. 122, 2337-2343 (2012).
- Etchin, J., Kanki, J. P., Look, A. T. Methods in Cell Biology. Westerfield, M., Detric, H. W., Zon, L. I. 105, Academic Press. 309-337 (2011).
- Li, P., White, R. M., Zon, L. I. Methods in Cell Biology. Westerfield, M., White, H. W., Zon, L. I. 105, Academic Press. 403-417 (2011).
- Yen, J., et al. The genetic heterogeneity and mutational burden of engineered melanomas in zebrafish models. Genome Biology. 14, R113 (2013).
- Bouzaffour, M., Dufourcq, P., Lecaudey, V., Haas, P., Vriz, S. Fgf and Sdf-1 Pathways Interact during Zebrafish Fin Regeneration. PLoS One. 4, e5824 (2009).
- Dufourcq, P., Vriz, S. The chemokine SDF-1 regulates blastema formation during zebrafish fin regeneration. Development Genes and Evolution. 216, 635-639 (2006).
- Lee, Y., Grill, S., Sanchez, A., Murphy-Ryan, M., Poss, K. D. Fgf signaling instructs position-dependent growth rate during zebrafish fin regeneration. Development. 132, 5173-5183 (2005).
- Hyde, D. R., Godwin, A. R., Thummel, R. In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin. Journal of Visualized Experiments. 61, e3632 (2012).
- Kizil, C., Iltzsche, A., Kaslin, J., Brand, M. Micromanipulation of Gene Expression in the Adult Zebrafish Brain Using Cerebroventricular Microinjection of Morpholino Oligonucleotides. Journal of Visualized Experiments. 75, e50415 (2013).
- Konantz, J., Antos, C. L. Reverse Genetic Morpholino Approach Using Cardiac Ventricular Injection to Transfect Multiple Difficult-to-target Tissues in the Zebrafish Larva. Journal of Visualized Experiments. 88, e51595 (2014).
- Rambabu, K. M., Rao, S. H., Rao, N. M. Efficient expression of transgenes in adult zebrafish by electroporation. BMC Biotechnology. 5, 29 (2005).
- Rapanan, J. L., Cooper, K. E., Leyva, K. J., Hull, E. E. During collective migration, leader keratocytes generate tension in sheet and may become follower or individually migrating cells. Experimental Cell Research. In press, (2014).
- Safferling, K., et al. Wound healing revised: A novel reepithelialization mechanism revealed by in vitro and in silico models). The Journal of Cell Biology. 203, 691-709 (2013).
- McDonald, T. M., et al. Matrix metalloproteinases and collective cell migration in 24 primary zebrafish explant cultures: MMP13 plays an inhibitory role and MMP14 may respond to stretch during reepithelialisation. Cell Biology International Reports. 20, 24-36 (2013).
- Haage, A., Nam, D. H., Ge, X., Schneider, I. C. Matrix metalloproteinase-14 is a mechanically regulated activator of secreted MMPs and invasion. Biochemical and Biophysical Research Communications. , (2014).
- Sire, J. -Y., Girondot, M., Babiar, O. Marking zebrafish, Danio rerio (cyprinidae), using scale regeneration. The Journal of Experimental Zoology. 286, 297-304 (2000).
- Xu, Z., et al. Teleost skin, an ancient mucosal surface that elicits gut-like immune responses. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110, 13097-13102 (2013).
- Keren, K., Yam, P. T., Kinkhabwala, A., Mogilner, A., Theriot, J. A. Intracellular fluid flow in rapidly moving cells. Nature Cell Biology. 11, 1219-1224 (2009).
- Bereiter-Hahn, J., Strohmeier, R., Kunzenbacher, I., Beck, K., Voth, M. Locomotion of Xenopus epidermis cells in primary culture. Journal of Cell Science. 52, 289-311 (1981).
- Nishikawa, A., Shimizu-Nishikawa, K., Miller, L. Isolation, characterization, and in vitro culture of larval and adult epidermal cells of the frog Xenopus laevis. In Vitro Cellula., & Developmental Biology. 26, 1128-1134 (1990).
- Schober, M., et al. Focal adhesion kinase modulates tension signaling to control actin and focal adhesion dynamics. The Journal of Cell Biology. 176, 667-680 (2007).
