Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Рыбок данио кератоцитов Экспланты по изучению коллективной миграции клеток и реэпителизации кожного заживления ран

Published: February 25, 2015 doi: 10.3791/52489
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 2, 1
1Biomedical Sciences Program, Midwestern University, 2Department of Microbiology & Immunology, Midwestern University

Summary

Рыбок данио кератоциты мигрировать в клеточных листов из эксплантов и обеспечить модель в пробирке для изучения механизмов коллективного миграции клеток в контексте эпителия заживления ран. Эти протоколы деталь эффективный способ создать первичные культуры эксплантов для использования в коллективных анализов клеточной миграции.

Abstract

Благодаря своим уникальным подвижных свойств, рыба кератоциты в отрыве от эксплантов культуры уже давно используются для изучения механизмов миграции одной клетки. Однако, когда экспланты установлено, эти клетки также перемещаются вместе, сохраняя многие черты, которые делают индивидуальный кератоциты привлекательную модель для изучения миграции: быстрые темпы моторики, обширные актин-богатых ламеллы с перпендикулярной актина кабеля, а также сравнительно постоянной скоростью и Направление миграции. В начале эксплантов, быстрое взаимное превращение клеток, мигрирующих в индивидуальном порядке с тех, кто мигрирует вместе позволяет изучение роли межклеточных спаек в определении режима миграции, и подчеркивает, молекулярные связи между этими двумя режимами миграции. Клетки в более поздних эксплантов теряют способность быстро и коллективно мигрировать в эпителиальных чтобы мезенхимального перехода происходит, и гены, связанные с заживлением ран и воспаления дифференциально экспрессируются, Таким образом, кератоцитов эксплантаты могут служить в качестве модели в пробирке для реэпителизации, что происходит во время заживления ран кожи и может представлять собой уникальную систему для изучения механизмов коллективного миграции клеток в контексте определенной программы изменения экспрессии генов. Разнообразие мутантных и трансгенных линий данио имеются, которая позволяет эксплантов, который будет создан из рыбы с различными генетическими фонов. Это позволяет роль различных белков в этих процессах, чтобы быть однозначно решить. Протоколы, описанные здесь, описывают простой и эффективный способ создания этих эксплантов культур для использования в различных анализах, связанных с коллективной миграции клеток.

Introduction

Исследования клеточной подвижности традиционно сосредоточено на индивидуальном мигрирующих клеток. Кератоциты культивированный из рыбы и амфибии эксплантов оказались мощным модельной системой для изучения механизмов клеточной подвижности с помощью как экспериментальных, так и математическое моделирование подходов 1-6. Экспериментальная работа по отдельности, мигрирующих клеток автоматизированного быстрым, плавным движением скользящей клеток, сохраняя одинаковую форму, скорость и направление. Тем не менее, в живом организме, клетки часто двигаться вместе при поддержании межклеточных соединений, в частности, в процессе эмбриогенеза, заживления ран, и метастазирования. Таким образом, коллектив миграция клеток является растущей и все более важной областью исследований в рамках области миграции клеток. Коллектив миграция этих клеток недавно были описаны 7 и она имеет много уникальных особенностей, которые делают его мощная система для изучения коллективного миграцию клеток в модели заживления раны.

ove_content "> Когда весы сорвал с наркозом взрослых данио, некоторые эпителиальной ткани остается привязанным к нижней части шкалы. Когда среда для культивирования клеток добавляется, эти эпителиальные клетки, или кератиноциты, быстро мигрируют в качестве коллективного устройства от масштаба. Эксплант можно рассматривать как эпителиального заживления ран модели, в которой клетки мигрируют от эксплантов, как они будут по предварительной матрицы раневое ложе, чтобы восстановить интактный эпителий. Последние данные показывают, что этот экс виво культуры имитирует многие особенности в естественных условиях заживление ран у взрослых рыбок данио. Рана скоростью сближения 8 перевести на скорость миграции аналогичной той, что наблюдается в Экс Vivo системы 7. Кроме того, в раны в естественных условиях модели заживления, лечение варфарином позволяет предположить, что гемостаз не влияет на скорость исцеления, в то время как обработка гидрокортизоном для уменьшения иммунный ответ не задерживает реэпителизацию 8

Протокол, представленные здесь описывает, как установить данио культуры кератоцитов эксплантов, обеспечивающие согласованность и воспроизводимость для использования во многих биологических анализов. Эти эксплантов культуры являются особенно очевидной в пробирке модель для коллективного миграции клеток по нескольким причинам. Во-первых, данио кератоциты являются первичные клетки, используемые в течение нескольких часов создания эксплантов культур. Таким образом, эти клетки не претерпели морфологические и генетические изменения выражение, связанное с прохождением первичных клеток 9-13. Во-вторых, эта система представляет собой модель для изучения реэпителизации в ответ на ранение 14, а в рамках ответа на ранения, эпителиальной к мезенхимальных TRansition (EMT) процесс инициируется о чем свидетельствуют изменения в экспрессии генов и цитоскелета перестроек 14,15. Таким образом, фоновые изменения в экспрессии генов и подвижности, которые происходят в необработанных клеток были охарактеризованы и обеспечивают контекст для интерпретации изменения с лечения. Кроме того, рыба кератоцитов и кератиноцитов человека функционально эквивалентны; оба первичные эпителиальные клетки соответствующих видов и играют ключевую роль в заживлении ран эпителия. В-третьих, взрослых данио приобретают все большее признание в качестве модельной системы для различных заболеваний человека 16-18 в том числе меланомы и других раковых заболеваний 19-21, кожные заживления ран 8,14 и регенерации тканей 22-24.

Технические преимущества этой модельной системы одинаково убедительными. Все большее число мутантных и трансгенных линий доступны из некоммерческих, централизованных. В частности, мутации проекта данио рерио (ZMP) В Wellcome Trust Sanger Institute направлена ​​на создание нокаутом аллель в каждом кодирующей белок гена в данио генома. В настоящее время они мутировали 11892 генов, примерно 45% генома, с 24088 аллелей отличающийся. Кроме того, ZMP принимает предложения и будет генерировать нокауты бесплатно. Последние методы генной нокдаун в личиночной и взрослых данио 25-28 обеспечивают гибкость для изучения функции с развитием важных генов, для которых трансгенные подходы проблематично или нецелесообразно.

Из-за их чрезвычайно быстрыми темпами моторики ~ 145 мкм / ч вскоре после создания культур 29, анализы могут быть быстро завершена (как правило, в 24 ч или менее). Как эксперименты могут быть быстро завершена, и культуры хорошо растут при комнатной температуре, несколько технических препятствий, связанных с миграцией клеток млекопитающих, включающие анализы видеомикроскопия избежать. Кроме того, в эпоху ужесточения исследовательские бюджеты, zebrafМОГ легко и недорого поддерживать.

Структура и поведение эксплантов является сложным. Как рыба не кровоточат, когда шкала удаляется, то маловероятно, что намного больше, чем поверхностные слои эпидермиса удаляются с масштабом. Кератиноциты, по всей видимости, является преобладающим типом клеток в эксплантов, когда весы, первоначально удалены из рыбы, подавляющее большинство клеток, по всей видимости пятно с анти-Е-кадгерина антителом 14. Кроме того, нет никаких доказательств того, фибробластов в первичной культуры можно судить по отсутствию окраски виментина с помощью иммунофлуоресценции 14. Тем не менее, с удалением повторном масштаба, как представляется, быть многочисленные нейтрофилы в эксплантата (смотрите видео 1). Мы определили, как эти клетки нейтрофилов на основе морфологических наблюдений от их размера, быстро подвижности, а также их миграции из клетки листа при воздействии на LPS (данные не показаны). Кроме того, эти клетки окрашиваются ярко остроумиеч антитело к нейтрофилов цитозольного фактора, а также с различными вторичными антителами IgG, что указывает, что они имеют обильные FcRs на своей поверхности (данные не показаны). Несколько слоев клеток присутствуют в эксплантов. Конфокальной микроскопии обнаруживается присутствие одного слоя вблизи переднего края до более чем двух слоев кератоцитов возле шкалы с нейтрофилов видимых сверху, снизу, и между клеткой кератоцитов листов.

В начале временных точках, клетки на краю многослойной эксплантов поляризации, инициирующего коллективного миграции кератоцитов из эксплантов на начальных скоростей ~ 145 мкм / ч. Площадь, покрытая эксплантата быстро возрастает, что приводит к ячейке распространения, напряжение в пределах листа, а пониженная скорость продвижения передней кромки. Быстрые взаимные между лидером и последователем клеток наблюдаются на переднем крае в процессе формирования и закрытия спонтанно образующихся отверстий в листе 7. КакEMT процесс, начатый с эксплантата продолжает лист фрагменты и кератиноциты теряют специализированные, быстрый моторику. Экспрессия генов и морфологические изменения, согласующиеся с EMT, заживление ран и воспалительные реакции происходят в течение 7 дней культуры с экспланты рассматривается жизнеспособность в течение примерно 10 дней 14.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Этот протокол соответствует AVMA защиты животных принципов по уходу и использованию лабораторных животных и был одобрен уходу и использованию комитета за животными (IACUC) на Среднем Западе университета им.

1. Подготовка анестезии, оборудования, и средств массовой информации

  1. Дехлорирование примерно 1,5 л водопроводной воды с использованием либо коммерческий дехлорирующей агента (продается в зоомагазинах) или давая воды позицию в течение 24 часов. Получить три 1 L стаканы и наполнить каждый с 500 мл дехлорированию воды. Пометьте одну для проведения рыбу перед любой процедурой и один для восстановления. К третьему химический стакан, добавить 100 мкг / мл Tricaine метансульфонат; это становится стакан, в котором будет анестезировали рыбы.
  2. Заполните мелкий лоток со льдом, нагревают культуральную среду (RPMI 1640, 10% FBS (эмбриональной бычьей сыворотки), 50 мкг / мл гентамицина, 100 мкг / мл канамицина, 25 мМ HEPES) до комнатной температуры, и собирают пинцетом чистой ювелира. Чистые пинцет по Имерупеть советы в 70% -ном этаноле и пройти через горелки Бунзена, позволяя этанол, чтобы сжечь.
  3. Решите, если процедура будет выполнена без увеличения с коммерческой, настольного зажгли увеличительное стекло с 2 - 10-кратным увеличением, или рассекает микроскопом (целиком зависит от личных предпочтений).

2. Установите эксплантов культур

  1. Поймать необходимое количество рыбы и места в режиме ожидания стакан. Передача одной рыбы к анестезии стакане; лучше обезболить рыбу индивидуально.
  2. Мониторинга воздействия анестезии, наблюдая бассейн и жаберные движения рыб. По ходу наркоза, движение жаберных замедляется и рыба будет плавать хаотично и часто с ног на голову; рассмотреть рыбу наркозом, как только движение жаберных прекращается. Не оставляйте рыбу в течение длительных периодов в анестезии ванной, так как это может привести к смерти рыбы.
  3. Удалить рыбу из анестезии стакане и передачилед, помещая рыбу горизонтально с хвостом, обращенной к рука пинцет. Если опыт работы с техникой и, если несколько рыб, которые будут использоваться, чтобы сделать эксплантов, рассмотреть вопрос о размещении очередную рыбу в анестезии стакане в это время.
  4. Для удаления чешуек, положение пинцет параллельно с рыбой, с кончиком, у края шкалы. Нажмите плоскую сторону пинцетом слегка в стороне рыбы, чтобы вызвать масштаб, чтобы поднять из тела рыбы. Возьмитесь масштаб с помощью пинцета, смелости и место (без инверсии) в культуре ткани блюдо. Повторите процедуру, удаляя максимум 12 шкал от большого взрослого (6 с каждой стороны), избегая жаберные область, боковой линии, и плавники.
  5. Поместите рыбу в аварийный стакан и контролировать, чтобы гарантировать ее оправится от последствий анестезии. В это время, рыба может быть передано обратно в отдельного резервуара. Разрешить рыбы восстановиться в течение по крайней мере 21 дней, чтобы для полной регенерации шкалы.
  6. В зависимости отопытно-конструкторских, разместить до 20 шкал в пластиковой 35 мм культуры тканей, обработанных блюдо или 4 - 6 шкал на дно стакана блюдо. Разрешить весы придерживаться блюдо, прежде чем осторожно добавляя СМИ, чтобы не отделить шелуху с тарелки.
    Примечание: С опытом, несколько рыб могут быть обработаны до носитель добавляют к первой тарелки.
  7. Добавить 1,2 мл полной среды (см 1,2 выше) в каждом 35 мм блюдо.
  8. Предпочтительно инкубировать эксплантов культур при 28 ° С в 5% СО 2 в течение требуемого периода времени с или без дополнительной обработки. Кроме того, инкубировать культур на нагретом столике микроскопа или в живой культуры клеток камеру для видео микроскопии.

3. Светлое и видео микроскопия

  1. Позиция блюда, содержащие клеточные листы на столике микроскопа и первоначально фокус с помощью объектива 4X.
    ПРИМЕЧАНИЕ: увеличениями могут быть использованы, в зависимости от эксперимента. Маркировка расположениекаждый лист и / или ориентации тарелки на стадии клеток будет способствовать принимать изображения с течением времени с листами примерно в той же ориентации.
  2. Удалить блюда из инкубатора и фотографии в различные моменты времени, в зависимости от каждого экспериментального протокола и поместить обратно в инкубатор, если только для неподвижных изображений необходимы более экспериментальной времени.
  3. При выполнении видеомикроскопия, обратите внимание на следующее:
    1. Поместите масштаб / возникающих клеток листа в пределах поля зрения так, что мигрирующие клетки листа остается в поле зрения в течение всего срока видео.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это может занять некоторый опыт в наблюдении, как клетки мигрируют из-под масштабе. Для коротких видео, это меньше беспокойства, чем для более видео.
    2. Для более коротких временных рамок, инкубировать при комнатной температуре. Для более длительных периодах времени (18+ час), использовать с подогревом этап или инкубационной камере для поддержания температуры, рН-баланс, и свести к минимуму испарение культуры мedium.

4. Фиксация для ИММУНОФЛУОРЕСЦЕНТНОГО микроскопии

  1. Подготовка и предварительно прогреть все решения до 28 ° C. Для того, чтобы просмотреть кератоциты под флуоресценции, расти эксплантов культур, как описано выше, с использованием прозрачным дном 35 мм культуры тканей блюда. Кроме того, использование стеклянной камеры слайды.
  2. Добавить 0,8 мл 4% параформальдегида в 1.1x PBS в каждую чашку. Не снимайте питательных сред в первую очередь. Выдержите при комнатной температуре в течение 5 минут, затем аспирации для удаления раствора.
  3. Добавить 0,8 мл 4% параформальдегида в 1.1x PBS в каждую чашку. Выдержите при комнатной температуре в течение 5 минут, затем аспирации для удаления раствора.
  4. Если не использовать внешние лиганды или внешних эпитопы, проницаемыми клеток путем добавления 0,5 мл 0,2% Тритон Х-100 в 1X PBS. Выдержите при комнатной температуре в течение 5 минут, затем аспирации для удаления раствора.
  5. Добавить 0,5 мл 1% BSA в 1x PBS и инкубировали в течение 1 часа (при комнатной температуре) или O / N (при 4 ° С).
    Примечание: В зависимости от условий эксперимента, PHAlloidin могут быть добавлены на этом этапе.
  6. После инкубации аспирации для удаления раствора и приступить к окрашиванию антителом. С другой стороны, хранить чашки для культивирования при добавлении по меньшей мере, один - 2 мл 1% BSA в PBS 1x в течение 3 - 4 недель при 4 ° С.

5. Иммунофлуоресценции протокол

  1. Готовят растворы первичных и вторичных антител в соответствии с рекомендациями завода-изготовителя.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если рекомендации производителя не доступен, хорошая отправная разбавления первичных антител (в 1% BSA в 1X PBS) составляет 1: 500 для поликлональных и 1: 1000 для моноклональных антител; Хорошей отправной разбавления вторичных антител 1: 1000. Настройте эти разведения исходного материала, полученного от производителя выше, если сигнал слабый, ниже, если сигнал сильный и фон проблема.
  2. Аспирируйте 1% BSA в 1X PBS растворе. Добавить 0,5 мл раствора первичного антитела и инкубировать в течение 1 часа (при комнатной температуре) или O / N (при 4 ° С). Удалить раствор первичного антитела, поместить в чистый и помечены 1,5 мл микроцентрифужных трубку, и заморозить при температуре -20 ° С.
    Примечание: Это позволяет для повторного использования первичного антитела, если это необходимо.
  3. Вымойте блюдо 3 - 5 раз 1х PBS, удаления и отбрасывая PBS после каждой промывки.
  4. Добавить 0,5 мл раствора вторичного антитела. При желании, добавить флуоресцентно-меченый фаллоидина (рекомендуются следующие любого производителя концентрации) на этом этапе. Инкубируют в течение 1 ч (при комнатной температуре) или O / N (при 4 ° C).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Использование флуоресцентно-меченых фаллоидином позволяет выводить нитей актина; мы обнаружили, что 488-меченные фаллоидином лучше всего работает в нашей данио кератоцитов, но и другие флуорофоров могут быть использованы.
  5. Снимите и выбросьте решение вторичное антитело.
  6. Вымойте блюдо 3 - 5 раз 1х PBS, удаления и отбрасывая PBS после каждой промывки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: блюдо можно хранить, покрыто от света месте при температуре 4 ° С, если не в состоянии соперничатьW немедленно; убедитесь, что 1x PBS добавляют в блюдо перед хранением, чтобы обеспечить клетки не высыхают, но нагреться до комнатной температуры (20 - 30 мин), затем снимите PBS непосредственно перед переходом к следующему шагу.
  7. Когда все будет готово, чтобы наблюдать, добавить 2 - 3 капли монтажной среды, с или без DAPI, в зависимости от экспериментальных потребностей, в блюдо и оставьте на 10 минут при комнатной температуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мы используем имеющиеся в продаже, на основе глицерина гистологическая среда с DAPI, но и другие монтажные средства массовой информации могут быть использованы. Разрешение 10 мин для монтажа среды, чтобы сидеть в блюдо облегчает удаление покровного стекла в нижней части блюда.
  8. После инкубации слегка сжать по бокам тарелки, чтобы ослабить и удалить покровное. Добавить дополнительное падение монтажных СМИ на предметное стекло и поместите покровное, клетки вниз, на слайде.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рассмотрим герметизации покровное к слайду с использованием четких лака для ногтей, если слайд должен быть дольше, чем 1 - 2 дней.
  9. Обратите внимание на слайд под флуоресцентным микроскопом.
    Примечание: Большинство наших изображений были приняты с использованием 40X или 63x объектив под масляной иммерсией, но конкретный объектив будет зависеть от экспериментального протокола.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Как показано на фиг.1, листы кератоцитов можно наблюдать миграцию из-под шкалы в течение нескольких часов установления Эксплант. Иногда индивидуально миграции кератоцитов который оторвался от коллективно миграции листа можно наблюдать. Кроме того, как было установлено эксплантов из рыбы, которую предварительно щипковый инструмент, обильные нейтрофилы, мигрирующие через лист. В более длительных периодов культуры, кератоцитов лист фрагменты как клетки подвергаются ЕМТ 14.

Начальная скорость продвижения листа чрезвычайно быстрым, но этот показатель быстро замедляется, как распространить клетки (измерено по площади и межъядерного расстояния, которые увеличивают ~ 1,8 и ~ 3,1 раза соответственно) в течение первых 48 ч культуры (Фиг.2А-С). Быстрое увеличение не связано с пролиферацией клеток; после маркировки в течение 24 ч с флуоресцентным аналог тимидина этинильная дезоксиуридина (Edu), ~ 10% клеток существуют доказательства клеточного деления, скорость намного ниже, чем видели в трансформированных клеточных линий, но в большей степени соответствовать клеток, участвующих в reepithelization в человеческих органотипических культур 30. В более поздние времена, лист фрагменты (явление, связанное с EMT, наблюдаемого в этой системе 14), что делает продвижение переднего края трудно измерить.

Область покрыта листов после 24 ч, могут быть использованы в качестве экрана для быстрого способности соединений для изменения коллективного клеточную миграцию 15,31. Когда лечение добавляют во время эксплантаты установлено, доза-ответ в листовой области могут быть видны. Некоторые цитокины млекопитающих (например, TGF-1 15), хемокины (такие как CXCL12) и низкомолекулярные ингибиторы изначально отличающийся тем системах млекопитающих (например, ММР-2, -9, -13 и ингибиторы 31) были успешно использованы. Однако, как лист площади в 24 часов не являются нормально распределенными ( рисунке 3в).

Во многих случаях, эффекты лечения (ов) на коллективной миграции наблюдаются в более короткие периоды времени. В этих случаях, видео микроскопии могут быть использованы для анализа отклика вместе миграции листа к лечению. При растворимы RGD содержащий пептид добавл ют к культуральной среде (третьей панели на фиг.4), чтобы разрушитьОбразование dhesion, ламели на передней кромке листа быстро сжать, а затем передний край листа отделяется и убирается. Как весь лист отводит менее чем 2 мин, отклик листа на лечение может быть быстрым.

Для оценки локализации белков внутри листа или внутри лидера и ведомых элементов, весь лист может быть фиксировали и окрашивали, как показано на рисунке 5. Необходимо соблюдать осторожность во время процесса фиксации, как клеточные листы легко разрушается. В наших руках, многие поликлональные антитела к функциональных доменов белков млекопитающих (в частности, из цитозольных белков), как было установлено перекрестно реагируют в наших данио эксплантов.

Рисунок 1
Рисунок 1. Коллективная миграция клеток листов. После установления в Эксплант, кератиноциты мигрироватьиз-под масштабе как коллективного устройства. (А) показывает относительное количество клеток, которые мигрировали от масштаба только после 2 ч в культуре, с (BE) принимать каждый час после этого (3 - 6 ч соответственно). Все снимки были сделаны в 100-кратном увеличении. Вся последовательность показана в видео 1; один кадр был сделан через каждые 30 сек в течение периода времени 6 ч. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Фиг.2
Рисунок 2. Характеристика коллективной миграции. Начальная скорость продвижения передней кромки, измеренное в нескольких точках, является быстрое, но замедляет течение первых 24 ч в культуре (A). Измерение межъядерного расстояния и площади клеток с использованием Cultures зафиксирован на 4 и 24 ч и окрашивали DAPI и фаллоидином как ссылки указывают, что в течение того же периода времени, как расстояние межъядерное (измеряется от центра каждого ядра) и увеличивается площадь клеток (измеренный как площадь, ограниченная кортикальной актина цитоскелета, (В) и (С) соответственно). Каждый график представляет собой среднее (± SEM) из трех независимых экспериментов в трех экземплярах. Эта цифра была изменена с Rapanan и др. 7 Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 3
Рисунок 3. Анализ коллективной миграции с помощью мобильного Область листа. При добавлении к культуральной среде при установлении культуры, PeptIDE Z-ПЛГ-NHOH (широкий спектр ММР) и небольшую молекулу СО-3СТ (ММР2 и 9 специфических ингибиторов) уменьшить площадь ячейки листа после 24 ч в культуре (A). Как площадь необработанных клеток листов распределено экспоненциально (B), данные должны быть нанесены виде медианы со стандартной ошибкой медианы определяется, как описано в тексте и выделены синим цветом (верхний опорного предела или URL и нижней опорной предела или LRL; ( С)). Разница между средним и URL и LRL определить размер планки погрешностей на графике (заштрихованная светло-зеленым цветом). Эта цифра была изменена с McDonald и др. 31 Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 4Рисунок 4. добавление растворимого RGD пептида ведет к листовой отвода. Во предварительной обработки и после добавления RGE-содержащего пептида, клетка листа продолжает двигаться вперед. 15 сек после добавления RGD-содержащего пептида, есть уменьшение пластинок на переднем крае (вставки). После дополнительного 30 сек, лист начинает втягиваться, опровержение, которая продолжается в течение срока действия видео (общая длина видео ~ 5 мин, смотрите видео 2). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 5
Рисунок 5. Реакция иммунофлюоресценции. Клетки окрашивали антителами к каталитического домена MMP14a (красный) и контрастно флуоресцентно помечены (488) фаллоидином (зеленый) и / или DAPI(Синий). (А) и (В) представляет собой типичную 4 ч листа, выходящего из шкалы, а (С) и (D) показана часть типичной 24 ч листа. Все снимки были сделаны в 400 раз увеличения. Следует отметить, что интенсивность окрашивания MMP14a выше на переднем крае новых клеток листов (если смотреть в (B) и (D)) и известного ламеллиподий видны в лидерных клеток (а) и (с)). Пожалуйста, нажмите здесь для просмотра большего размера этой цифры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Наиболее важным шагом для успеха кератоцитов эксплантов культуры позволяет масштаб, чтобы присоединиться к культуральной чашке в течение приблизительно 2 - 3 мин перед добавлением в культуральную среду. Приблизительно 75% весов будет прилипать и расти листов (количество культур, установленных для каждого эксперимента должны быть соответствующим образом скорректированы). Кератоцитов листов не образуют вокруг каждого масштаба удаляется из рыбы и помещали в культуру по нескольким причинам. Во-первых, DAPI окрашивание эксплантов показывают, что некоторые весы имеют несколько клеток прикреплен и, таким образом, можно ожидать, что эти весы не будут иметь листы кератоцитов. Во-вторых, способность эксплантов придерживаться блюдо культуры ткани является необходимым условием для листового миграции. Ключевым фактором, определяющим придерживаться весы и успешно Эксплант устанавливается время между помещением шкалу на поверхности роста и сложения СМИ. Недостаточное время придерживаться без средств массовой информации приведет к масштабах floatinг в средствах массовой информации (иногда с видимым ткани прилагается), а слишком долго будет приводить к адгезивных масштабах, не имеющих роста (предположительно из-за сушки из эксплантов с клеточных остатков видимых на краю продажи). Время между размещением масштабе в блюдо и добавлением ростовой среде, возможно, потребуется быть определена экспериментально, такие факторы, как температура и влажность в лаборатории комнате могут повлиять, как быстро клетки могут прилипать к чашке без высыхания.

Хотя число коммерчески доступных, данио специфических антител растет, разнообразие доступных реагентов может быть ограничивающим. 85% гомологии между иммуногена и белка-мишени, как правило, считается необходимым для перекрестной реактивности. Тем не менее, в качестве функциональных доменов, таких как активные сайты, сайты белок-белковых взаимодействий, и сайтов модификации являются более консервативными, чем в других регионах белка, анти-пептид поликлональные антитела, направленные в этих регионах может часто бытьиспользовать, даже если в целом гомологии является низким. Например, хотя данио MMP14a имеет общую идентичность 68% с его человеческой ортолога (ожидается значение = 0), что доля удостоверений увеличивается до 79 - 96% в каталитических и связывания с белками-сайтов во время вырубках аналогичным высоко консервативными 31. Эти данные свидетельствуют о том, что антитело, направленное к каталитически активного участка человеческого MMP14a перекрестно реагирует с данио кератиноциты культур. Предположение о том, что окрашивание в данио листов может локализовать на вытянутых клеток на переднем крае 31 согласуется с другими данными, предполагая, что ММР14 может служить механическим датчиком 32.

Это не возможно, чтобы создать совершенно стерильный эксплантов из рыбы, плавание в нестерильной аквариумов водой. Поскольку большинство наших экспериментов будут завершены в течение 24 часов, мы не испытывают никаких проблем с бактериальной или грибковой контаминации эксплантов. Однако, когда длительные периоды инкубации желании, для сохранения стерильности оF эксплантов может стать проблемой. При планировании эксперимента с участием 3 и более дней инкубации, несколько меры предосторожности, чтобы увеличить вероятность того, что культуры остаются чистыми. Во-первых, для снижения бактериальной нагрузки, рыба разрешается плавать в течение приблизительно 1 ч в 3 изменений свежий, дехлорирование водопроводную воду с добавлением или без добавления 100 мкг / мл канамицина. Во-вторых, средства массовой информации обмен на ежедневной основе, чтобы поддерживать надлежащий уровень антибиотика и уменьшить количество любых присутствующих бактерий. Для особо длинных инкубации (> 5 дней) три промывки с 1x PBS выполняются с каждого обмена медиа. Тем не менее, это вводит переменную, которая должна рассматриваться в опытно-конструкторских, когда Эксплант обрабатывают экзогенного соединения, так как это нужно будет заменить со средствами массовой информации. Кроме того, цитокины и факторы роста, секретируемые эксплантов будут удалены с каждого обмена носителей. Однако, как число клеток с низким и объем массовой информациивелико в типичном кератоцитов эксплантов, этот эффект не может быть существенным.

Как рыбья чешуя требуют 3 недели, чтобы полностью восстановить 33, мы рекомендуем позволяя рыбе оправиться за этот период времени до повторного использования рыбы в экспериментах. Хотя реформирования эпителиального слоя происходит гораздо быстрее, мы исходим из того, что ждет эту длину времени между использованием той же рыбы минимизирует шанс для системных воспалительных эффектов, которые были зарегистрированы в кожной заживления ран у рыб 34.

Экспланты уже давно используются для изучения поведения эпителиальных клеток. Экспланты из широкого разнообразия видов рыб и амфибий имеют схожие подвижные свойства на индивидуальном и коллективном уровнях клеточной миграции 3-6,35-37. Эти клетки имеют совершенно разные подвижные свойства, чем эксплантов млекопитающих, но общая структура и организация по-видимому, имеют высокую степень сходства 8,30,38 14.

Мы обнаружили, что этот протокол позволяет изучать коллективный миграции данио кератоцитов с использованием эксплантов первичных клеток, которые моделируют на ранних стадиях заживления ран 14. Проведение экспериментов с использованием вновь созданных первичных культур избежать проблем, связанных с последовательного прохождения первичных клеток или с использованием трансформированных клеточных линий. Экспланты могут быть использованы для изучения роли EMT при кожном заживления ран, как инициируется EMT, когда культуры устанавливаются. Наши исследования показывают, что эти первичные эксплантаты более точно имитировать естественное поведение и миграцию кератоцитов в пределах раненого эпителиального слоя в естественных условиях. Этот протокол обеспечивает основу для создания первичных культур для использования в миграционных анализов, а также для изучения изменений в ген и / или экспрессии белка в, казалось бы, бесконечное множество экспериментальных Conditионы. Процедуры быстро, легко, недорого, воспроизводимым, и подходит для использования в любой научно-исследовательского института.

Таким образом, этот метод эксплантов обеспечивает быстрый анализ для коллективной миграции клеток в контексте заживления ран модели, которая претерпевает ЕМТ. Наличие нескольких типов клеток в несколько слоев с ориентирующим масштабе обеспечивает сложность этого экс виво системе культуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана за счет средств Среднем Западе Университетского колледжа наук о здоровье Исследования по упрощению гранта, предоставленного для EEH и Среднем Западе университета Управления научных исследований и программ, финансируемых Внутренние гранта, предоставленного для KJL.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
35 mm Glass Bottom Culture Dishes (Poly-D Lysine Coated) MatTek P35GC-1.5-14-C 1.5 mm thickness is best for coverslip removal. 14 mm diameter provides more culture area.
Swiss Jewelers Style Forceps, Integra, Miltex 17-303 VWR 21909-460 We find that narrow, fine forceps work the best for scale removal.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Burton, K., Park, J. H., Taylor, D. L. Keratocytes generate traction forces in two phases. Molecular Biology of the Cell. 10, 3745-3769 (1999).
  2. Keren, K., et al. Mechanism of shape determination in motile cells. Nature. 453, 475-480 (2008).
  3. Lacayo, C. I., et al. Emergence of large-scale cell morphology and movement from local actin filament growth dynamics. PLOS Biology. 5, 233 (2007).
  4. Lee, J., Ishihara, A., Theriot, J. A., Jacobson, K. Principles of locomotion for simple-shaped cells. Nature. 362, 167-171 (1993).
  5. Kolega, J. The Movement of Cell Clusters. J. Cell Sci. 49, 15-32 (1981).
  6. Kolega, J. Effects of mechanical tension on protrusive activity and microfilament and intermediate filament organization in an epidermal epithelium moving in culture. The Journal of Cell Biology. 102, 1400-1411 (1986).
  7. Rapanan, J. L., Cooper, K. E., Leyva, K. J., Hull, E. E. Collective cell migration of primary zebrafish keratocytes. Experimental Cell Research. 326, 155-165 (2014).
  8. Richardson, R., et al. Adult Zebrafish as a Model System for Cutaneous Wound-Healing Research. Journal of Investigative Dermatology. 133, 1655-1665 (2013).
  9. Cheon, H., et al. Increased expression of pro-inflammatory cytokines and metalloproteinase-1 by TGF-b1 in synovial fibroblasts from rheumatoid arthritis and normal individuals. Clinica., & Experimental Immunology. 127, 547-552 (2002).
  10. Sandeman, S. R., Faragher, R. G. A., Allen, M. C. A., Liu, C., Lloyd, A. W. Does MMP-2 expression and secretion change with increasing serial passage of keratocytes in culture. Mechanisms of Ageing and Development. 122, 157-167 (2001).
  11. Schnaper, H. W., et al. Increased expression of extracellular matrix proteins and decreased expression of matrix proteases after serial passage of glomerular mesangial cells. Journal of Cell Science. 109, 2521-2528 (1996).
  12. Tondreau, T., et al. In vitro study of matrix metalloproteinase/tissue inhibitor of metalloproteinase production by mesenchymal stromal cells in response to inflammatory cytokines: the role of their migration in injured tissues. Cytotherapy. 11, 559-569 (2009).
  13. Zimmermann, T., et al. Isolation and characterization of rheumatoid arthritis synovial fibroblasts from primary culture - primary culture cells markedly differ from fourth-passage cells. Arthritis Research. 3, 72-76 (2001).
  14. McDonald, T. M., et al. Zebrafish keratocyte explant cultures as a wound healing model system: differential gene expressio., & morphological changes support epithelial–mesenchymal transition. Experimental Cell Research. 319, 1815-1827 (2013).
  15. Tan, B., Pascual, A., de Beus, A., Cooper, K., Hull, E. TGFb (transforming growth factor b) and keratocyte motility in 24-hour zebrafish explant cultures. Cell Biology International. 35, 1131-1139 (2011).
  16. Barut, B. A., Zon, L. I. Realizing the potential of zebrafish as a model for human disease. Physiological Genomics. 2, 49-51 (2000).
  17. Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nature Reviews Genetics. 8, 353-367 (2007).
  18. Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. The Journal of Clinical Investigation. 122, 2337-2343 (2012).
  19. Etchin, J., Kanki, J. P., Look, A. T. Methods in Cell Biology. Westerfield, M., Detric, H. W., Zon, L. I. 105, Academic Press. 309-337 (2011).
  20. Li, P., White, R. M., Zon, L. I. Methods in Cell Biology. Westerfield, M., White, H. W., Zon, L. I. 105, Academic Press. 403-417 (2011).
  21. Yen, J., et al. The genetic heterogeneity and mutational burden of engineered melanomas in zebrafish models. Genome Biology. 14, R113 (2013).
  22. Bouzaffour, M., Dufourcq, P., Lecaudey, V., Haas, P., Vriz, S. Fgf and Sdf-1 Pathways Interact during Zebrafish Fin Regeneration. PLoS One. 4, e5824 (2009).
  23. Dufourcq, P., Vriz, S. The chemokine SDF-1 regulates blastema formation during zebrafish fin regeneration. Development Genes and Evolution. 216, 635-639 (2006).
  24. Lee, Y., Grill, S., Sanchez, A., Murphy-Ryan, M., Poss, K. D. Fgf signaling instructs position-dependent growth rate during zebrafish fin regeneration. Development. 132, 5173-5183 (2005).
  25. Hyde, D. R., Godwin, A. R., Thummel, R. In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin. Journal of Visualized Experiments. 61, e3632 (2012).
  26. Kizil, C., Iltzsche, A., Kaslin, J., Brand, M. Micromanipulation of Gene Expression in the Adult Zebrafish Brain Using Cerebroventricular Microinjection of Morpholino Oligonucleotides. Journal of Visualized Experiments. 75, e50415 (2013).
  27. Konantz, J., Antos, C. L. Reverse Genetic Morpholino Approach Using Cardiac Ventricular Injection to Transfect Multiple Difficult-to-target Tissues in the Zebrafish Larva. Journal of Visualized Experiments. 88, e51595 (2014).
  28. Rambabu, K. M., Rao, S. H., Rao, N. M. Efficient expression of transgenes in adult zebrafish by electroporation. BMC Biotechnology. 5, 29 (2005).
  29. Rapanan, J. L., Cooper, K. E., Leyva, K. J., Hull, E. E. During collective migration, leader keratocytes generate tension in sheet and may become follower or individually migrating cells. Experimental Cell Research. In press, (2014).
  30. Safferling, K., et al. Wound healing revised: A novel reepithelialization mechanism revealed by in vitro and in silico models). The Journal of Cell Biology. 203, 691-709 (2013).
  31. McDonald, T. M., et al. Matrix metalloproteinases and collective cell migration in 24 primary zebrafish explant cultures: MMP13 plays an inhibitory role and MMP14 may respond to stretch during reepithelialisation. Cell Biology International Reports. 20, 24-36 (2013).
  32. Haage, A., Nam, D. H., Ge, X., Schneider, I. C. Matrix metalloproteinase-14 is a mechanically regulated activator of secreted MMPs and invasion. Biochemical and Biophysical Research Communications. , (2014).
  33. Sire, J. -Y., Girondot, M., Babiar, O. Marking zebrafish, Danio rerio (cyprinidae), using scale regeneration. The Journal of Experimental Zoology. 286, 297-304 (2000).
  34. Xu, Z., et al. Teleost skin, an ancient mucosal surface that elicits gut-like immune responses. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110, 13097-13102 (2013).
  35. Keren, K., Yam, P. T., Kinkhabwala, A., Mogilner, A., Theriot, J. A. Intracellular fluid flow in rapidly moving cells. Nature Cell Biology. 11, 1219-1224 (2009).
  36. Bereiter-Hahn, J., Strohmeier, R., Kunzenbacher, I., Beck, K., Voth, M. Locomotion of Xenopus epidermis cells in primary culture. Journal of Cell Science. 52, 289-311 (1981).
  37. Nishikawa, A., Shimizu-Nishikawa, K., Miller, L. Isolation, characterization, and in vitro culture of larval and adult epidermal cells of the frog Xenopus laevis. In Vitro Cellula., & Developmental Biology. 26, 1128-1134 (1990).
  38. Schober, M., et al. Focal adhesion kinase modulates tension signaling to control actin and focal adhesion dynamics. The Journal of Cell Biology. 176, 667-680 (2007).

Tags

Биология развития выпуск 96 миграция общую камеру reepithelization данио кератоцитов эпителиальные чтобы мезенхимальных перехода межклеточной адгезии кожный заживления раны
Рыбок данио кератоцитов Экспланты по изучению коллективной миграции клеток и реэпителизации кожного заживления ран
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rapanan, J. L., Pascual, A. S.,… More

Rapanan, J. L., Pascual, A. S., Uppalapati, C. K., Cooper, K. E., Leyva, K. J., Hull, E. E. Zebrafish Keratocyte Explants to Study Collective Cell Migration and Reepithelialization in Cutaneous Wound Healing. J. Vis. Exp. (96), e52489, doi:10.3791/52489 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter