Summary
Cheratociti zebrafish migrano in lastre alveolari da espianti e forniscono un modello in vitro per lo studio dei meccanismi di migrazione cellulare collettiva nel contesto di epiteliale guarigione della ferita. Questi protocolli dettaglio un modo efficace per stabilire le culture espianto primarie per l'uso in test di migrazione cellulare collettiva.
Abstract
Grazie alle loro proprietà uniche motilità, cheratociti pesce dissociate da sono da tempo utilizzati culture espianto per studiare i meccanismi della migrazione singola cellula. Tuttavia, quando si stabiliscono espianti, queste cellule si muovono anche collettivamente, mantenendo molte delle caratteristiche che rendono individuo cheratociti un modello interessante per lo studio della migrazione: rapidi tassi di motilità, vasta lamelle ricco di actina con un cavo actina perpendicolari, e di velocità relativamente costante e direzione di migrazione. Nei primi espianti, la rapida interconversione di cellule migranti singolarmente con quelli migrazione collettivamente consente di studiare il ruolo di adesioni cellula-cellula nel determinare la modalità di migrazione e sottolinea i legami molecolari tra le due modalità di migrazione. Le cellule in espianti successivi perdono la loro capacità di migrare rapidamente e collettivamente come la transizione epitelio mesenchimale verifica e geni associati con la guarigione della ferita e l'infiammazione sono espressi in modo differenziale. Così, espianti keratocyte possono servire come modello in vitro per la riepitelizzazione cutanea che si verifica durante la guarigione della ferita e può rappresentare un sistema unico per studiare i meccanismi di migrazione cellulare collettiva nel contesto di un programma definito di cambiamenti di espressione genica. Una varietà di linee di zebrafish mutanti e transgeniche sono disponibili, che consente di espianti di stabilire da pesce con diversi background genetico. Questo permette il ruolo di proteine diverse all'interno di questi processi da affrontare univoco. I protocolli descritti qui descrivono un metodo semplice ed efficace per stabilire queste culture espianto per l'uso in una varietà di saggi legati alla migrazione cellulare collettiva.
Introduction
Studi di motilità cellulare si sono tradizionalmente concentrati sulle cellule migrano individualmente. Cheratociti coltivate dai pesci e anfibi espianti hanno dimostrato di essere un sistema potente modello per studiare i meccanismi di motilità cellulare utilizzando la modellazione sia sperimentale e matematica approcci 1-6. Il lavoro sperimentale sulle cellule migrano singolarmente è aiutata dal rapido movimento scorrevolezza delle cellule, mantenendo uniforme forma, velocità e direzione. Tuttavia, in vivo, le cellule si muovono spesso insieme pur mantenendo giunzioni cellula-cellula, in particolare durante l'embriogenesi, la guarigione delle ferite, e le metastasi. Così, la migrazione cellulare collettiva è un settore in crescita e sempre più importante della ricerca nel campo della migrazione delle cellule. La migrazione collettiva di queste cellule è stata recentemente descritta 7 ed ha molte caratteristiche uniche che lo rendono un potente sistema per studiare la migrazione delle cellule collettiva in un modello di guarigione delle ferite.
ove_content "> Quando le scale vengono pizzicate da un zebrafish adulto anestetizzato, alcuni tessuti epiteliali rimane attaccato alla parte inferiore della scala. Quando si aggiunge mezzo di coltura cellulare, queste cellule epiteliali, o cheratociti, migrano rapidamente come unità collettiva dalla scala. Il Espianto può essere visto come un modello di guarigione delle ferite epiteliale, in cui le cellule migrano dalla espianto come farebbero nella matrice provvisoria del letto della ferita per ristabilire un epitelio intatto. Dati recenti suggeriscono che questa coltura ex vivo imita molte caratteristiche di in vivo la guarigione delle ferite in zebrafish adulto. tassi chiusura della ferita 8 si traducono in una velocità di migrazione simile a quello osservato nella ex vivo sistema 7. Inoltre, in una ferita in vivo guarigione del modello, il trattamento con warfarin suggerisce che l'emostasi non ha alcun effetto sul tasso di di guarigione, mentre il trattamento con idrocortisone per diminuire la risposta immunitaria non ritardare riepitelizzazione 8Il protocollo presentato qui descritto come stabilire le culture zebrafish keratocyte espianto a garantire la coerenza e riproducibilità per l'uso in molti saggi biologici. Queste culture espianto sono particolarmente convincenti modello in vitro per la migrazione delle cellule collettivo per diversi motivi. In primo luogo, cheratociti zebrafish sono pile utilizzate entro ore di stabilire culture espianto. Pertanto, queste cellule non hanno subito i cambiamenti morfologici e espressione genica associati con passaggio di cellule primarie 9-13. In secondo luogo, questo sistema rappresenta un modello per lo studio di riepitelizzazione in risposta al ferimento 14 e, come parte della risposta al ferimento, un epiteliale al mesenchimale transition processo (EMT) è iniziata come evidenziato da cambiamenti nell'espressione genica e riarrangiamenti del citoscheletro 14,15. Così, lo sfondo cambiamenti nell'espressione genica e motilità che si verificano in cellule non trattate sono stati caratterizzati e fornire un contesto per interpretare modifiche con trattamento. Inoltre, il pesce e la keratocyte cheratinociti umani sono funzionalmente equivalenti; entrambi sono le cellule epiteliali primarie dei rispettivi specie e svolgono un ruolo chiave nella epiteliale guarigione della ferita. In terzo luogo, zebrafish adulto stanno guadagnando il riconoscimento come sistema modello per una varietà di malattie umane 16-18 tra cui il melanoma e altri tumori 19-21, ferita cutanea guarigione 8,14 e Rigenerazione Tissutale 22-24.
I vantaggi tecnici di questo modello di sistema sono altrettanto convincenti. Un numero crescente di linee mutanti e transgeniche sono disponibili dal non-profit, servizi centralizzati. In particolare, la mutazione progetto Zebrafish (ZMP) Presso il Wellcome Trust Sanger Institute mira a creare un allele knockout in ogni proteina gene nel genoma zebrafish. Attualmente, hanno mutato 11.892 geni, circa il 45% del genoma, con 24.088 alleli caratterizzati. Inoltre, ZMP accetta proposte e genererà knock-out gratuitamente. Metodi Recenti gene atterramento in larvale e adulto zebrafish 25-28 forniscono la flessibilità per studiare la funzione dei geni evolutivamente importanti per i quali approcci transgenici sono problematici o impraticabili.
Grazie alla loro estremamente rapidi tassi di motilità di ~ 145 micron / h poco dopo creazione di culture 29, analisi possono essere completate rapidamente (di solito in 24 ore o meno). Come esperimenti possono essere concluse rapidamente e culture crescono bene a temperatura ambiente, molti degli ostacoli tecnici associati sono evitati mammiferi test di migrazione delle cellule che coinvolgono microscopio video. Inoltre, in età di serraggio bilanci di ricerca, zebrafish è facile ed economico mantenuto.
La struttura e il comportamento del trapianto è complessa. Come il pesce non sanguinano quando la scala viene rimosso, è improbabile che molto più strati epidermici superficiali vengono rimossi con la scala. Cheratociti sembrano essere il tipo cellulare predominante nel espianto quando squame sono inizialmente rimossi dal pesce come la stragrande maggioranza delle cellule sembra macchiare con un anticorpo anti-E-caderina 14. Inoltre, non vi è alcuna prova di fibroblasti in coltura iniziale come giudicato dalla mancanza di vimentina colorazione mediante immunofluorescenza 14. Tuttavia, con la rimozione ripetuta scala, sembra che vi siano numerosi neutrofili nel espianto (vedi Video 1). Abbiamo identificato queste cellule come neutrofili basati su osservazioni morfologiche delle loro dimensioni, rapidamente motilità e la loro migrazione fuori dello strato di cellule quando esposto a LPS (dati non mostrati). Inoltre, queste cellule si colorano vivacemente with un anticorpo di neutrofili fattore citosolico e con una varietà di anticorpi secondari IgG, che indica che essi hanno FCRS abbondanti sulla loro superficie (dati non mostrati). Strati di cellule multiple sono presenti all'interno del espianto. Microscopia confocale rivela la presenza di un solo strato vicino al bordo superiore per più di due strati di cheratinociti vicino scala con neutrofili visibili sopra, sotto, e tra i fogli keratocyte cellulare.
A momenti iniziali, le cellule sul bordo del multi-layer espianto polarizzare, avviando la migrazione collettiva del cheratociti dalla espianto a tassi iniziali di ~ 145 micron / hr. L'area coperta dal espianto aumenta rapidamente, portando a cellule diffusione, la tensione all'interno del foglio, e un tasso ridotto di avanzamento del bordo d'attacco. Interconversioni rapidi tra le cellule capo e follower si osservano sul bordo di entrata durante la formazione e la chiusura di fori spontaneamente costituiti all'interno del foglio 7. ComeProcesso di EMT avviato con l'espianto continua, i frammenti fogli e le cheratociti perdono la loro specializzazione, rapida motilità. Espressione genica e cambiamenti morfologici coerenti con EMT, la guarigione delle ferite, e le risposte infiammatorie si verificano entro 7 giorni di coltura con espianti presi in considerazione valida per circa 10 giorni 14.
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Protocol
Questo protocollo è conforme al benessere Principi AVMA animali per la cura e l'uso di animali da laboratorio ed è stato approvato dalla cura e l'uso Comitato Istituzionale Animal (IACUC) a Midwestern University.
1. Preparazione di Anestesia, attrezzature, & Media
- Declorurare circa 1,5 L di acqua di rubinetto per mezzo di un agente commerciale declorante (disponibile nei negozi di animali da compagnia) o il ristagno d'acqua per 24 ore. Ottenere tre bicchieri 1 L e riempire ogni con 500 ml di acqua senza cloro. Etichettare una per tenere il pesce prima di qualsiasi procedura e uno per il recupero. Per il terzo bicchiere, aggiungere 100 mg / ml di tricaine methanesulfonate; questo diventa il becher nel quale verranno anestetizzati pesci.
- Riempire un vassoio poco profondo con ghiaccio, riscaldare il terreno di coltura (RPMI 1640, il 10% FBS (siero fetale bovino), 50 mg / ml di gentamicina, 100 mg / ml kanamicina, 25 HEPES mM) a RT, e raccogliere pinzette pulito del gioielliere. Pinzette pulite di immercantare le punte in etanolo al 70% e passare attraverso un becco Bunsen, permettendo l'etanolo a bruciare.
- Decidere se la procedura sarà eseguita senza ingrandimento, con uno spot, tavolo illuminato lente di ingrandimento con 2 - 10X di ingrandimento, o dissezione microscopio (interamente dipendente preferenze personali).
2. Stabilire Culture Explant
- Prendere il numero desiderato di pesce e mettere in un bicchiere di partecipazione. Trasferire un singolo pesce al bicchiere anestesia; è meglio per anestetizzare il pesce individualmente.
- Monitorare gli effetti dell'anestesia osservando il nuoto e branchie movimento del pesce. Come anestesia progredisce, il movimento branchia rallenta e il pesce nuoterà in modo irregolare e spesso a testa in giù; considerare pesci anestetizzati, non appena il movimento branchia cessa. Non lasciare il pesce per periodi più lunghi nel bagno anestesia in quanto ciò potrebbe comportare la morte dei pesci.
- Togliere il pesce dal bicchiere anestesia e trasferimentoin ghiaccio, mettendo il pesce orizzontalmente con la coda rivolta verso la mano che tiene le pinzette. Se sperimentato con la tecnica e se più pesci devono essere utilizzati per rendere espianti, è consigliabile inserire il pesce successivo nel becher anestesia in questo momento.
- Per rimuovere squame, pinzette posizione parallela al pesce con punta a bordo della scala. Premere parte piatta delle pinzette leggermente sul lato del pesce a causare la scala di elevare dal corpo del pesce. Afferrare scala con le pinzette, cavalo, e il luogo (senza inversione) nel piatto di coltura di tessuti. Ripetere la procedura, la rimozione di un massimo di 12 scale di una grande per adulti (6 da ogni lato), evitando la regione gill, la linea laterale, e pinne.
- Posizionare il pesce nel becher recupero e monitorare per assicurare che recupera dagli effetti dell'anestesia. In questo momento, i pesci possono essere trasferiti di nuovo ad un serbatoio di individuo. Lasciare che il pesce di recuperare per almeno 21 giorni per consentire la completa rigenerazione scala.
- A seconda delladisegno sperimentale, posizionare fino a 20 scale per 35 millimetri piatto di plastica coltura trattata con tessuti o 4-6 scale per vetro piatto fondo. Consentire scale di aderire al piatto prima di aggiungere delicatamente supporti in modo da non staccare scale dal piatto.
NOTA: Con l'esperienza, più pesci possono essere elaborati prima supporto viene aggiunto al primo piatto. - Aggiungere 1,2 ml di supporti completo (vedi 1.2 sopra) in ogni piatto da 35 mm.
- Preferibilmente incubare culture espianto a 28 ° C in 5% di CO 2 per il periodo di tempo desiderato, con o senza ulteriori trattamenti. In alternativa, incubare le culture su un palco microscopio riscaldata o all'interno di una camera di coltura cellulare dal vivo per la microscopia video.
3. Brightfield e Video Microscopy
- Piatti di posizione contenenti fogli cellulari sul palco microscopio e inizialmente messa a fuoco utilizzando la lente dell'obiettivo 4X.
NOTA: Higher ingrandimenti possono essere utilizzati, a seconda dell'esperimento. Marcatura la posizione diogni foglio e / o l'orientamento del piatto sulla scena cellule agevoleranno prendendo immagini nel tempo con i fogli in circa lo stesso orientamento. - Rimuovere piatti della incubatore e la fotografia in vari momenti, secondo ogni protocollo sperimentale e mettere di nuovo nel incubatore se sono necessari solo immagini fisse nel periodo di tempo sperimentale.
- Durante l'esecuzione di microscopia video, prestare attenzione a quanto segue:
- Posizionare il / emergente strato cellulare scala all'interno del campo visivo tale che il foglio cellule migrazione rimane nel campo di vista per la durata del video.
NOTA: Questo potrebbe richiedere una certa esperienza nell'osservare come le cellule migrano da sotto la scala. Per brevi video, questo è meno di una preoccupazione che per video più lunghi. - Per tempi più brevi, incubare a RT. Per tempi più lunghi (18+ HR), utilizzare un palcoscenico riscaldata o una camera di incubazione per mantenere la temperatura, l'equilibrio del pH, e per ridurre al minimo l'evaporazione della cultura medium.
- Posizionare il / emergente strato cellulare scala all'interno del campo visivo tale che il foglio cellule migrazione rimane nel campo di vista per la durata del video.
4. Fissazione per immunofluorescenza microscopia
- Preparare e pre-caldo tutte le soluzioni a 28 ° C. Per visualizzare cheratociti in fluorescenza, crescere culture espianto come sopra descritto con 35 millimetri piatti con fondo di vetro colture di tessuti. In alternativa, utilizzare le diapositive da camera di vetro.
- Aggiungere 0,8 ml di paraformaldeide al 4% in PBS 1.1x ad ogni piatto. Non rimuovere il terreno di coltura prima. Incubare a temperatura ambiente per 5 minuti quindi aspirare per rimuovere la soluzione.
- Aggiungere 0,8 ml di paraformaldeide al 4% in PBS 1.1x ad ogni piatto. Incubare a temperatura ambiente per 5 minuti quindi aspirare per rimuovere la soluzione.
- Salvo usando ligandi esterni o epitopi esterni, cellule permeabilize aggiungendo 0,5 ml di 0,2% Triton X-100 in PBS 1X. Incubare a temperatura ambiente per 5 minuti quindi aspirare per rimuovere la soluzione.
- Aggiungere 0,5 ml di 1% BSA in PBS 1x e incubare per 1 ora (a RT) o O / N (a 4 ° C).
NOTA: A seconda delle condizioni sperimentali, phalloidin può essere aggiunto in questa fase. - Dopo l'incubazione, aspirare per rimuovere la soluzione e procedere con l'anticorpo colorazione. In alternativa, memorizzare i piatti di coltura aggiungendo almeno 1 - 2 ml di 1% BSA in PBS 1x per 3 - 4 settimane a 4 ° C.
5. immunofluorescenza protocollo
- Preparare le soluzioni di anticorpi primari e secondari secondo le raccomandazioni del costruttore.
NOTA: Se le raccomandazioni del produttore non sono disponibili, una buona diluizione iniziale di anticorpi primari (in 1% BSA in 1x PBS) è di 1: 500 per policlonali e 1: 1.000 per gli anticorpi monoclonali; una buona partenza per la diluizione degli anticorpi secondari è 1: 1.000. Regolare questi diluizioni del ceppo originario da parte del produttore più alto se il segnale è debole, più basso se il segnale è forte e lo sfondo è un problema. - Aspirare il BSA 1% in soluzione 1x PBS. Aggiungere 0,5 ml di soluzione di anticorpo primario e incubare per 1 ora (a RT) o O / N (a 4 ° C). Rimuovere la soluzione di anticorpo primario, inserire in un ambiente pulito ed etichettato 1,5 ml provetta, e congelare a -20 ° C.
NOTA: Questo permette il riutilizzo dell'anticorpo primario, se necessario. - Lavare il piatto 3 - 5 volte con 1x PBS, la rimozione e scartando il PBS dopo ogni lavaggio.
- Aggiungere 0,5 ml di soluzione di anticorpo secondario. Se lo si desidera, aggiungere falloidina fluorescenza marcata (seguito concentrazione raccomandata di qualsiasi produttore) durante questa fase. Incubare per 1 ora (a RT) o O / N (a 4 ° C).
NOTA: L'uso di falloidina fluorescenza marcata permette la visualizzazione di filamenti di actina; abbiamo scoperto che falloidina 488 marcato funziona meglio nelle nostre cheratociti zebrafish, ma altri fluorofori possono essere utilizzati. - Rimuovere e scartare la soluzione di anticorpo secondario.
- Lavare il piatto 3 - 5 volte con 1x PBS, la rimozione e scartando il PBS dopo ogni lavaggio.
NOTA: Il piatto può essere memorizzato, coperto dalla luce, a 4 ° C se non è possibile view immediatamente; assicurarsi 1x PBS viene aggiunto nel piatto prima della conservazione per assicurare le cellule non si seccano ma caldo a RT (20 - 30 min), quindi rimuovere il PBS appena prima di procedere alla fase successiva. - Al momento di osservare, aggiungere 2 - 3 gocce di un mezzo di montaggio, con o senza DAPI, a seconda delle esigenze sperimentali, nel piatto e lasciate riposare per 10 minuti a RT.
NOTA: Usiamo un mezzo di montaggio disponibile in commercio a base di glicerolo-con DAPI, ma altri mezzi di fissaggio possono essere utilizzati. Consentendo 10 min per il mezzo di montaggio per sedersi nel piatto consente una facile rimozione del vetrino di vetro dal fondo del recipiente. - Dopo l'incubazione, premere delicatamente ai lati del piatto per allentare e rimuovere il vetrino. Aggiungere un ulteriore calo dei mezzi di montaggio su un vetrino e porre il vetrino, celle in basso, sul vetrino.
NOTA: Considerare tenuta il vetrino alla diapositiva con chiara unghia polacco se la diapositiva deve essere mantenuto per più di 1 - 2 giorni. - Osservare il vetrino sotto un microscopio a fluorescenza.
NOTA: La maggior parte delle nostre immagini sono state scattate con una lente obiettivo 40X o 63X in olio da immersione, ma l 'obiettivo specifico utilizzato dipende dal protocollo sperimentale.
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Representative Results
Come illustrato in figura 1, fogli di cheratinociti possono essere osservati migrare da sotto la scala poche ore istituisce cultura espianto. Di tanto in tanto, un keratocyte migrazione personalizzato che si è staccato dal foglio collettivamente la migrazione può essere osservato. Inoltre, come è stato stabilito l'espianto da un pesce precedentemente pizzicate, ci sono abbondanti neutrofili migrano attraverso il foglio. Nei periodi più lunghi di cultura, i frammenti foglio keratocyte le cellule subiscono EMT 14.
La velocità iniziale di foglio avanzamento è estremamente rapida, ma questo tasso rallenta rapidamente cellule diffondono (misurata per area e distanza internucleare che aumentano ~ 1.8 e ~ 3,1 volte rispettivamente) durante il primo 48 ore di coltura (Figura 2A-C). Il rapido aumento non è associato a proliferazione cellulare; dopo etichettatura per 24 ore con il deossiuridina timidina fluorescente etinile analogico (EdU), circa il 10% delle cellule mostra segni di divisione cellulare, un tasso di gran lunga inferiore a quello visto in linee cellulari trasformate, ma più coerente con le cellule coinvolte nella riepitelizzazione in colture organotipiche umani 30. A tempi successivi, i frammenti foglio (fenomeno associato EMT osservata in questo sistema 14) che rende l'anticipo del bordo anteriore difficile da misurare.
L'area coperta da fogli dopo 24 ore, può essere usato come un rapido schermo per la capacità di composti di alterare la migrazione cellulare collettiva 15,31. Quando si aggiunge trattamento al momento espianti sono stabiliti, una dose-risposta in un'area del foglio può essere visto. Alcune citochine di mammifero (per esempio, TGF-1 15), chemochine (come CXCL12) e piccole molecole inibitrici inizialmente caratterizzate nei mammiferi (ad esempio, MMP-2, -9 e -13 inibitori 31) sono stati impiegati con successo. Tuttavia, come aree patrimoniali a 24 ore non sono distribuiti normalmente (
In molti casi, gli effetti del trattamento (s) sulla migrazione collettiva si osservano in brevi periodi di tempo. In questi casi, la microscopia video può essere utilizzato per saggiare la risposta del foglio collettivamente migrazione al trattamento. Quando RGD solubile contenente peptide viene aggiunto al mezzo di coltura (terzo pannello in figura 4) per interrompere unformazione dhesion, le lamelle al bordo anteriore del foglio rapidamente termoretraibile e successivamente il bordo anteriore dei fogli stacchi e ritrae. Poiché l'intero foglio ritrae in meno di 2 min, risposta del foglio al trattamento può essere rapida.
Per valutare la localizzazione delle proteine all'interno del foglio o all'interno delle cellule capo e follower, l'intero foglio può essere fissate e colorate, come mostrato in Figura 5. Si deve prestare attenzione durante il processo di fissaggio come i fogli di cellule vengono facilmente interrotte. Nelle nostre mani, molti anticorpi policlonali ai domini funzionali di proteine di mammiferi (in particolare delle proteine citosoliche) sono stati trovati ad attraversare reagire nelle nostre espianti zebrafish.
Figura 1. migrazione collettiva dei fogli di cella. Dopo la costituzione in Espianto, cheratociti migranoda sotto la scala come unità collettiva. (A) illustra la quantità relativa di cellule che sono migrati dalla bilancia dopo solo 2 ore in coltura, con (BE) preso ogni ora successiva (3 - 6 ore, rispettivamente). Tutte le immagini sono state scattate a ingrandimento 100X. L'intera sequenza è mostrata in Video 1; un fotogramma è stata presa ogni 30 secondi nel periodo di tempo di 6 ore. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Caratteristiche di migrazione collettiva. Tasso iniziale di avanzamento del bordo d'attacco, misurata in più punti, sono rapidi ma rallenta durante le prime 24 ore in coltura (A). Misurazione della distanza internucleare e di cella con cultures fissati a 4 e 24 ore e colorati con DAPI e falloidina come riferimento indicano che durante lo stesso periodo di tempo, sia la distanza internucleare (misurata dal centro di ciascun nucleo) e il livello di cella aumenta (misurata come area racchiusa dal actina corticale citoscheletro, (B) e (C) rispettivamente). Ogni grafico rappresenta la media (± SEM) di tre esperimenti indipendenti in triplice copia. Questa cifra è stata modificata da Rapanan et al. 7 Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Saggio di migrazione collettiva con strato di cellule Area. Quando aggiunto al mezzo di coltura durante creazione della cultura, PEPTide Z-PLG-NHOH (ampio spettro MMP) e piccola molecola SB-3CT (MMP2 e 9 specifici inibitori) diminuire cella zona foglio dopo 24 ore di cultura (A). Poiché l'area di fogli di cellule non trattate è distribuita esponenzialmente (B), i dati devono essere riportati in mediana con errore standard della mediana determinato come descritto nel testo e indicato in blu (limite di riferimento superiore o URL e il limite inferiore o LRL; ( C)). La differenza tra la media e l'URL e LRL determinare le dimensioni delle barre di errore sul grafico (ombreggiata in verde chiaro). Questa cifra è stata modificata da McDonald et al. 31 , cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. Aggiunta del Solubile RGD Peptide conduce a foglio di svincolo. Durante pretrattamento e dopo l'aggiunta di un peptide RGE contenente, strato cellulare continua ad avanzare. 15 sec dopo l'aggiunta di un peptide-RGD contenente, vi è una diminuzione nella lamelle sul bordo di entrata (inserti). Dopo un ulteriore 30 sec, il foglio comincia a ritrattare, una ritrattazione che continua per tutta la durata del video (video lunghezza totale ~ 5 min, vedere Video 2). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5. immunofluorescenza. Le cellule sono state colorate con un anticorpo al dominio catalitico di MMP14a (rosso) e di contrasto con (488) falloidina fluorescenza marcata (verde) e / o DAPI(Blu). (A) e (B) rappresentano un tipico foglio 4 hr emergente dalla scala mentre (C) e (D) mostrano una porzione di un tipico foglio 24 hr. Tutte le immagini sono state scattate a 400X di ingrandimento. Si noti che l'intensità della colorazione MMP14a è superiore al bordo anteriore dei fogli cellulari emergenti (visto in (B) e (D)) e lamellipodia prominente si vedono nelle cellule capo (A) e (C)). Fare click qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
La fase più critica per il successo della cultura keratocyte espianto sta permettendo la scala di aderire al piatto di coltura per circa 2 - 3 minuti prima dell'aggiunta del terreno di coltura. Circa il 75% di scale aderire e crescere fogli (il numero di culture stabiliti per ogni esperimento dovrà essere adeguato di conseguenza). Fogli Keratocyte non formano intorno ad ogni scala rimosso dal pesce e messo in coltura per diversi motivi. In primo luogo, DAPI colorazione di espianti rivela che alcune scale hanno poche cellule collegate e quindi si prevede che queste scale non avranno fogli di cheratociti. In secondo luogo, la capacità di espianti di aderire al piatto di coltura tissutale è un prerequisito essenziale per la migrazione foglio. Un fattore determinante se scale aderiscono e una cultura espianto di successo è stabilito è il tempo che intercorre tra l'immissione della scala sulla superficie di crescita e l'aggiunta di supporto. Tempo insufficiente per aderire senza mezzi porterà a scale floating in mezzi (talvolta con il tessuto visibile allegata) durante un periodo troppo lungo provocherà scale aderenti con nessuna crescita (presumibilmente a causa di essiccazione del trapianto con residui cellulari visibili sul bordo della vendita). Il tempo tra posizionamento scala nel piatto e l'aggiunta di terreno di crescita può essere necessario determinare sperimentalmente, come fattori quali la temperatura e l'umidità all'interno della camera di laboratorio può influenzare come cellule veloce può aderire al piatto senza seccare.
Sebbene il numero di anticorpi specifici, zebrafish disponibili in commercio è in aumento, la varietà di reagenti disponibili può essere limitante. Un 85% di omologia tra immunogeno e proteine bersaglio è in genere ritenuto necessario per il cross-reattività. Tuttavia, domini funzionali come siti attivi, siti di interazione proteina-proteina, e siti di modificazione sono più conservati di altre regioni della proteina, anticorpi policlonali anti-peptide diretti a queste regioni possono essere frequentementeutilizzato anche se l'omologia complessiva è bassa. Ad esempio, anche se MMP14a zebrafish ha un'identità globale il 68% con il suo ortologo umano (aspettatevi value = 0), la frazione di aumenti di identità a 79-96% nei siti catalitici e vincolante di proteine, mentre i punti tagliati sono ugualmente altamente conservati 31. I dati suggeriscono che un anticorpo diretto verso il sito cataliticamente attiva di MMP14a umana cross-reagisce con zebrafish cheratociti culture. Il suggerimento che la colorazione in fogli zebrafish può localizzarsi alle celle allungate all'avanguardia 31 è coerente con altri dati suggeriscono che MMP14 può servire come un sensore meccanico 32.
Non è possibile creare un espianto del tutto sterile da un pesce che nuota in acqua acquari sterili. Come la maggior parte dei nostri esperimenti sono stati completati entro 24 ore, noi sperimentiamo problemi con contaminazione batterica o fungina di espianti. Tuttavia, quando si desiderano tempi di incubazione più lungo, mantenendo la sterilità oespianti f possono diventare un problema. Quando si pianifica un esperimento che coinvolge 3 o più giorni di incubazione, sono prese alcune precauzioni per aumentare la probabilità che le culture rimangono incontaminata. In primo luogo, per ridurre la carica batterica, il pesce è consentito di nuotare per circa 1 ora a 3 cambi di fresco, senza cloro acqua del rubinetto con o senza l'aggiunta di 100 ug / ml kanamicina. In secondo luogo, il supporto viene scambiato su base giornaliera per mantenere adeguati livelli di antibiotico e ridurre il numero di batteri presenti. Per particolarmente lunghi di incubazione (> 5 giorni) tre lavaggi con PBS 1x vengono eseguite con ogni scambio media. Tuttavia, questo introduce una variabile che deve essere considerato nella progettazione sperimentale quando la cultura espianto viene trattato con un composto esogeno come questo dovrà essere sostituito con i media. Inoltre, citochine e fattori di crescita secreti dal espianto verranno rimossi con ogni scambio media. Tuttavia, poiché il numero di cellule è bassa e il volume dei mezziè grande in un tipico espianto keratocyte, questo effetto può non essere sostanziale.
Come squame di pesce richiedono 3 settimane per rigenerare completamente 33, si consiglia di permettere il pesce di recuperare per questo periodo di tempo prima che l'uso ripetuto del pesce in esperimenti. Anche se la riforma dello strato epiteliale avviene molto più rapidamente, si presume che l'attesa questo lasso di tempo tra l'utilizzo dello stesso pesce riduce al minimo la possibilità di effetti infiammatori sistemici che sono stati riportati in cutanea guarigione delle ferite nei pesci 34.
Espianti sono stati a lungo utilizzati per studiare il comportamento delle cellule epiteliali. Espianti da una vasta gamma di specie di pesci e anfibi hanno simili proprietà mobili a singoli e collettivi migrazione cellulare 3-6,35-37. Queste cellule hanno distintamente differenti proprietà rispetto motilità espianti mammiferi ma la struttura e l'organizzazione complessiva sembrano avere un alto grado di somiglianza 8,30,38 14.
Abbiamo scoperto che questo protocollo ci permette di studiare la migrazione collettiva di cheratociti zebrafish utilizzando espianti cellulari primarie che modellano le prime fasi di guarigione delle ferite 14. Condurre esperimenti con colture primarie di nuova costituzione evita le questioni connesse con il passaggio di serie di pile o l'uso di linee di cellule trasformate. Espianti possono essere utilizzati per studiare il ruolo di EMT in cutanea guarigione delle ferite come è iniziata EMT quando sono stabiliti culture. I nostri studi suggeriscono che questi espianti primari imitano più accuratamente il comportamento naturale e la migrazione dei cheratinociti nello strato epiteliale feriti in vivo. Questo protocollo fornisce la base per stabilire colture primarie per l'uso in test di migrazione nonché per l'esame cambiamenti nel gene e / o l'espressione della proteina in una serie infinita di Condit sperimentaleioni. Le procedure sono veloce, facile, poco costoso, riproducibile, e adatto per l'uso in qualsiasi istituto di ricerca.
In sintesi, questa tecnica espianto fornisce un rapido saggio per la migrazione cellulare collettiva nel contesto di un modello cicatrizzazione che è in fase EMT. La presenza di diversi tipi di cellule in strati multipli con una scala orientamento fornisce complessità di questo sistema di coltura ex vivo.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da fondi Midwestern University College of Health Sciences Research facilitazione sovvenzione concessa a EEH e Midwestern University Ufficio di Ricerca e Programmi sponsorizzati intramurale sovvenzione concessa a KJL.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm Glass Bottom Culture Dishes (Poly-D Lysine Coated) | MatTek | P35GC-1.5-14-C | 1.5 mm thickness is best for coverslip removal. 14 mm diameter provides more culture area. |
| Swiss Jewelers Style Forceps, Integra, Miltex 17-303 | VWR | 21909-460 | We find that narrow, fine forceps work the best for scale removal. |
References
- Burton, K., Park, J. H., Taylor, D. L. Keratocytes generate traction forces in two phases. Molecular Biology of the Cell. 10, 3745-3769 (1999).
- Keren, K., et al. Mechanism of shape determination in motile cells. Nature. 453, 475-480 (2008).
- Lacayo, C. I., et al. Emergence of large-scale cell morphology and movement from local actin filament growth dynamics. PLOS Biology. 5, 233 (2007).
- Lee, J., Ishihara, A., Theriot, J. A., Jacobson, K. Principles of locomotion for simple-shaped cells. Nature. 362, 167-171 (1993).
- Kolega, J.
- Kolega, J. Effects of mechanical tension on protrusive activity and microfilament and intermediate filament organization in an epidermal epithelium moving in culture. The Journal of Cell Biology. 102, 1400-1411 (1986).
- Rapanan, J. L., Cooper, K. E., Leyva, K. J., Hull, E. E. Collective cell migration of primary zebrafish keratocytes. Experimental Cell Research. 326, 155-165 (2014).
- Richardson, R., et al. Adult Zebrafish as a Model System for Cutaneous Wound-Healing Research. Journal of Investigative Dermatology. 133, 1655-1665 (2013).
- Cheon, H., et al. Increased expression of pro-inflammatory cytokines and metalloproteinase-1 by TGF-b1 in synovial fibroblasts from rheumatoid arthritis and normal individuals. Clinica., & Experimental Immunology. 127, 547-552 (2002).
- Sandeman, S. R., Faragher, R. G. A., Allen, M. C. A., Liu, C., Lloyd, A. W. Does MMP-2 expression and secretion change with increasing serial passage of keratocytes in culture. Mechanisms of Ageing and Development. 122, 157-167 (2001).
- Schnaper, H. W., et al. Increased expression of extracellular matrix proteins and decreased expression of matrix proteases after serial passage of glomerular mesangial cells. Journal of Cell Science. 109, 2521-2528 (1996).
- Tondreau, T., et al. In vitro study of matrix metalloproteinase/tissue inhibitor of metalloproteinase production by mesenchymal stromal cells in response to inflammatory cytokines: the role of their migration in injured tissues. Cytotherapy. 11, 559-569 (2009).
- Zimmermann, T., et al. Isolation and characterization of rheumatoid arthritis synovial fibroblasts from primary culture - primary culture cells markedly differ from fourth-passage cells. Arthritis Research. 3, 72-76 (2001).
- McDonald, T. M., et al. Zebrafish keratocyte explant cultures as a wound healing model system: differential gene expressio., & morphological changes support epithelial–mesenchymal transition. Experimental Cell Research. 319, 1815-1827 (2013).
- Tan, B., Pascual, A., de Beus, A., Cooper, K., Hull, E. TGFb (transforming growth factor b) and keratocyte motility in 24-hour zebrafish explant cultures. Cell Biology International. 35, 1131-1139 (2011).
- Barut, B. A., Zon, L. I. Realizing the potential of zebrafish as a model for human disease. Physiological Genomics. 2, 49-51 (2000).
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nature Reviews Genetics. 8, 353-367 (2007).
- Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. The Journal of Clinical Investigation. 122, 2337-2343 (2012).
- Etchin, J., Kanki, J. P., Look, A. T. Methods in Cell Biology. Westerfield, M., Detric, H. W., Zon, L. I. 105, Academic Press. 309-337 (2011).
- Li, P., White, R. M., Zon, L. I. Methods in Cell Biology. Westerfield, M., White, H. W., Zon, L. I. 105, Academic Press. 403-417 (2011).
- Yen, J., et al. The genetic heterogeneity and mutational burden of engineered melanomas in zebrafish models. Genome Biology. 14, R113 (2013).
- Bouzaffour, M., Dufourcq, P., Lecaudey, V., Haas, P., Vriz, S. Fgf and Sdf-1 Pathways Interact during Zebrafish Fin Regeneration. PLoS One. 4, e5824 (2009).
- Dufourcq, P., Vriz, S. The chemokine SDF-1 regulates blastema formation during zebrafish fin regeneration. Development Genes and Evolution. 216, 635-639 (2006).
- Lee, Y., Grill, S., Sanchez, A., Murphy-Ryan, M., Poss, K. D. Fgf signaling instructs position-dependent growth rate during zebrafish fin regeneration. Development. 132, 5173-5183 (2005).
- Hyde, D. R., Godwin, A. R., Thummel, R. In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin. Journal of Visualized Experiments. 61, e3632 (2012).
- Kizil, C., Iltzsche, A., Kaslin, J., Brand, M. Micromanipulation of Gene Expression in the Adult Zebrafish Brain Using Cerebroventricular Microinjection of Morpholino Oligonucleotides. Journal of Visualized Experiments. 75, e50415 (2013).
- Konantz, J., Antos, C. L. Reverse Genetic Morpholino Approach Using Cardiac Ventricular Injection to Transfect Multiple Difficult-to-target Tissues in the Zebrafish Larva. Journal of Visualized Experiments. 88, e51595 (2014).
- Rambabu, K. M., Rao, S. H., Rao, N. M. Efficient expression of transgenes in adult zebrafish by electroporation. BMC Biotechnology. 5, 29 (2005).
- Rapanan, J. L., Cooper, K. E., Leyva, K. J., Hull, E. E. During collective migration, leader keratocytes generate tension in sheet and may become follower or individually migrating cells. Experimental Cell Research. In press, (2014).
- Safferling, K., et al. Wound healing revised: A novel reepithelialization mechanism revealed by in vitro and in silico models). The Journal of Cell Biology. 203, 691-709 (2013).
- McDonald, T. M., et al. Matrix metalloproteinases and collective cell migration in 24 primary zebrafish explant cultures: MMP13 plays an inhibitory role and MMP14 may respond to stretch during reepithelialisation. Cell Biology International Reports. 20, 24-36 (2013).
- Haage, A., Nam, D. H., Ge, X., Schneider, I. C. Matrix metalloproteinase-14 is a mechanically regulated activator of secreted MMPs and invasion. Biochemical and Biophysical Research Communications. , (2014).
- Sire, J. -Y., Girondot, M., Babiar, O. Marking zebrafish, Danio rerio (cyprinidae), using scale regeneration. The Journal of Experimental Zoology. 286, 297-304 (2000).
- Xu, Z., et al. Teleost skin, an ancient mucosal surface that elicits gut-like immune responses. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110, 13097-13102 (2013).
- Keren, K., Yam, P. T., Kinkhabwala, A., Mogilner, A., Theriot, J. A. Intracellular fluid flow in rapidly moving cells. Nature Cell Biology. 11, 1219-1224 (2009).
- Bereiter-Hahn, J., Strohmeier, R., Kunzenbacher, I., Beck, K., Voth, M. Locomotion of Xenopus epidermis cells in primary culture. Journal of Cell Science. 52, 289-311 (1981).
- Nishikawa, A., Shimizu-Nishikawa, K., Miller, L. Isolation, characterization, and in vitro culture of larval and adult epidermal cells of the frog Xenopus laevis. In Vitro Cellula., & Developmental Biology. 26, 1128-1134 (1990).
- Schober, M., et al. Focal adhesion kinase modulates tension signaling to control actin and focal adhesion dynamics. The Journal of Cell Biology. 176, 667-680 (2007).
