Summary
Zebrafisk keratocyter migrera i cellblad från explantat och ge en modell för att studera mekanismerna för kollektiv migrationscell i samband med epitel sårläkning in vitro. Dessa protokoll detalj ett effektivt sätt att etablera primära Explantation kulturer för användning i kollektiva analyser cellmigrations.
Abstract
På grund av sina unika rörliga egenskaper, dissocierade fisk keratocyter från Explantation kulturer har länge använts för att studera mekanismerna för enskild cell migration. Men när explantaten är etablerade, dessa celler flytta också kollektivt, bibehålla många av de egenskaper som gör individen keratocyter en attraktiv modell för att studera migration: snabba priser av motilitet, omfattande aktin rika lameller med en vinkelrät aktin kabel, och relativt konstant hastighet och riktningen migration. I tidiga explants, den snabba omvandling av celler migrerar individuellt med de som migrerar tillsammans möjliggör studier av den roll som cell-cell sammanväxningar att bestämma läget för migration, och betonar de molekylära sambanden mellan de två lägena av migration. Celler i senare explants förlorar sin förmåga att migrera snabbt och kollektivt som en epitelial till mesenkymala övergång sker och gener associerade med sårläkning och inflammation är differentiellt uttryckta. Sålunda kan keratocyte explantat tjäna som en modell för reepithelialization som sker under kutan sårläkning och kan representera ett unikt system för att studera mekanismer för kollektiv migrationscell inom ramen för ett definierat program av genexpressionsförändringar in vitro. En mängd olika muterade och transgena zebrafisk linjer finns tillgängliga, vilket gör att explants skall fastställas från fisk med olika genetisk bakgrund. Detta gör att betydelsen av olika proteiner inom dessa processer att entydigt åtgärdas. De protokoll som beskrivs här beskriva en enkel och effektiv metod för att fastställa dessa Explantation kulturer för användning i en mängd olika analyser som rör kollektiv migration cell.
Introduction
Studier av cellrörlighet har traditionellt fokuserat på individuellt migrerande celler. Keratocyter odlade från fisk och amfibie explants har visat sig vara ett kraftfullt modellsystem för att studera mekanismerna för cellmotilitet med både experimentell och matematisk modellering 1-6. Experimentellt arbete på individuellt migrerande celler underlättas av den snabba, smidigt glid rörelse av cellerna, och samtidigt bibehålla en enhetlig form, hastighet och riktning. Men in vivo, celler flytta ofta kollektivt bibehållen cell-cell korsningar, särskilt under embryogenes, sårläkning, och metastasering. Således är kollektiv migration cell en växande och alltmer framträdande forskningsområde inom området cellmigration. Den kollektiva migrering av dessa celler har nyligen beskrivits 7 och det har många unika egenskaper som gör det till ett kraftfullt system för att studera kollektiva migration cell i en sårläkning modell.
ove_content "> När skalor är plockade från en sövd vuxen zebrafisk, förblir en del epitelvävnad monteras på undersidan av skalan. När cellkulturmedium läggs, dessa epitelceller, eller keratocyter, migrera snabbt som en kollektiv enhet från skalan. Den Explantation kulturen kan ses som en epitelial sårläkning modell, där cellerna migrera bort från explantatet som de skulle över provisoriska matris av ett sår säng att återupprätta en intakt epitel. Nya uppgifter tyder på att detta ex vivo kultur härmar många funktioner i in vivo sårläkning i vuxen zebrafisk. sårtillslutning hastigheter 8 översätta till en migrationshastighet liknande den som observerades i den ex vivo systemet 7. Dessutom, i en in vivo sårläknings modell, föreslår behandling med warfarin att hemostas har någon effekt på hastighet av healing, medan behandling med hydrokortison för att minska immunsvaret inte försena reepithelialization 8Protokollet presenteras här beskriver hur man kan upprätta zebrafisk keratocyte Explantation kulturer som säkerställer konsekvens och reproducerbarhet för användning i många biologiska analyser. Dessa Explantation kulturer är en särskilt övertygande in vitro modell för kollektiv migration cell av flera skäl. Först, zebrafisk keratocyter är primära celler som används inom timmar av upprättandet Explantation kulturer. Därför har dessa celler inte genomgått de morfologiska och genuttryck förändringar i samband med passage av primära celler 9-13. För det andra, innebär detta system en modell för studier av reepithelialization som svar på såra 14 och, som en del av svaret på såra, en epitelial till mesenkymala transition (EMT) initieras, vilket framgår av förändringar i genuttryck och cytoskelettala omdisponeringar 14,15. Sålunda har den bakgrunden förändringar i genuttryck och motilitet vilka uppträder i obehandlade celler karakteriserats och ger ett sammanhang för att tolka förändringar med behandling. Dessutom fisken keratocyte och mänskliga keratinocyte är funktionellt likvärdiga; båda är de primära epitelceller i deras respektive art och spela en nyckelroll i epitelial sårläkning. Tredje, vuxen zebrafisk vinner erkännande som ett modellsystem för en mängd olika mänskliga sjukdomar 16-18 inklusive melanom och andra cancerformer 19-21, kutan sårläkning 8,14 och vävnadsregenerering 22-24.
Tekniska fördelar för detta modellsystem är lika övertygande. Ett växande antal muterade och transgena linjer finns tillgängliga från ideell, centraliserade anläggningar. Specifikt Zebrafish Mutation Project (ZMP) Vid Wellcome Trust Sanger Institute syftar till att skapa en knockout allel i varje proteinkodande genen i zebrafisk genomet. För närvarande har de muterade 11892 gener, cirka 45% av genomet, med 24088 alleler karakteriserade. Dessutom accepterar ZMP förslag och kommer att generera knock-outs gratis. Nya metoder i gen knockdown i larv och vuxna zebrafisk 25-28 ger flexibilitet för att studera funktionen av utvecklingsmässigt viktiga gener som transgena metoder är problematiska eller opraktiskt.
På grund av deras extremt snabba hastigheter av motilitet ~ 145 nm / hr strax efter etablering av kulturer 29, kan analyser slutföras skyndsamt (vanligtvis i 24 timmar eller mindre). Som experiment kan genomföras snabbt och kulturer växer bra vid RT, flera av de tekniska hinder som är förknippade med däggdjurscellmigrations analyser involverande videomikroskopi undviks. Dessutom i en ålder av åtstramning forskningsbudgetar, zebrafish är enkelt och billigt underhålls.
Strukturen och beteende explantatet är komplex. Eftersom fisken inte blöder när vågen tas bort, är det osannolikt att mycket mer än de ytliga epidermala lagren avlägsnas med skalan. Keratocyter verkar vara den dominerande celltypen i explantatet när skalor initialt avlägsnas från fisken som de allra flesta celler verkar för att färga med en anti-E-cadherin antikropp 14. Dessutom finns det inga bevis för fibroblaster i det ursprungliga kulturen som bedöms av frånvaron av vimentin färgning genom immunofluorescens 14. Men med upprepad skala bort, det verkar vara många neutrofiler i explantatet (se video 1). Vi har identifierat dessa celler som neutrofiler baserade på morfologiska observationer av deras storlek, snabbt motilitet, och deras migrering ut ur cellen bladet när den utsätts för LPS (data visas ej). Dessutom dessa cellerna färgas ljust with en antikropp mot neutrofil cytosoliskt faktor samt med en mängd sekundära IgG-antikroppar, vilket tyder på att de har rikliga FcR på sin yta (data visas ej). Flera cellskikt är närvarande inom Explantation. Konfokalmikroskopi avslöjar närvaron av ett enda lager nära framkanten till mer än två lager av keratocyter nära skalan med neutrofiler synliga ovanför, under och mellan cell keratocyte arken.
Vid tidiga tidpunkter, celler på kanten av den flerskiktiga explantatet polariserar, initiera kollektiv migration av keratocyter från explantatet vid initiala hastigheter av ~ 145 | im / h. Det område som täcks av explantatet snabbt ökar, vilket leder till cellspridning, spänningar inom arket, och en minskad framflyttningshastighet av framkanten. Snabba omvandlingar mellan ledare och efterföljare celler observeras vid framkanten under bildandet och nedläggning av spontant formade hål i arket 7. SomEMT process som inleddes med Explantation fortsätter, fragmenten ark och keratocyter förlorar sin specialiserade, snabb motilitet. Genuttryck och morfologiska förändringar som överensstämmer med EMT, sårläkning och inflammatoriska svar inträffar inom 7 dagar efter kultur med explantat vägs lönsamt för ungefär 10 dagar 14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Detta protokoll uppfyller AVMA Animal Welfare Principer för vård och användning av försöksdjur och har godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC) vid Midwestern University.
1. Beredning av anestesi, utrustning, & Media
- Deklorera approximativt 1,5 L av kranvatten med användning av antingen en kommersiell dechlorinating medel (finns på djuraffärer) eller genom att låta vattnet stå i 24 h. Skaffa tre 1 L bägare och fyll med vardera 500 ml avklorerat vatten. Märk ett för att hålla fisken innan något förfarande och en för återhämtning. Till den tredje bägare, till 100 ug / ml av tricaine metansulfonat; Detta blir bägaren där fisken kommer att bedövas.
- Fyll en grund skål med is, värma odlingsmediet (RPMI 1640, 10% FBS (fetalt bovint serum), 50 | ig / ml gentamycin, 100 | ig / ml kanamycin, 25 mM HEPES) till RT, och samla ren juveleraraffärer pincett. Rena pincett efter immersjunga tipsen i 70% etanol och passera genom en Bunsen-brännare, så att etanol för att bränna bort.
- Bestäm om förfarandet kommer att genomföras utan förstoring, med en kommersiell, bords upplyst förstoringsglas med 2 - 10x förstoring, eller dissekera mikroskop (helt beroende på personliga preferenser).
2. Upprätta Explantation kulturer
- Fånga önskat antal fiskar och placera i en anläggning bägare. Överför enstaka fisk till anestesi bägaren; är det bäst att söva fisken individuellt.
- Övervaka effekterna av anestesi genom att observera simning och Gill rörelse av fisken. Som anestesi fortskrider, saktar gill rörelse och fisken kommer att simma oregelbundet och ofta upp och ner; överväga fisk sövda så snart gill rörelse upphör. Lämna inte fisken under längre perioder i anestesi badet eftersom det kan leda till döden av fisken.
- Ta fisk från anestesi bägare och överföringtill is, placera fisken horisontellt med svansen mot handen håller pincetten. Om upplevt med tekniken och om flera fiskar ska användas för att göra explants, överväga att placera nästa fisk i anestesi bägaren vid denna tid.
- För att ta bort skalor, positions pincett parallellt med fisk med spets vid kanten av skalan. Tryck platta sidan av pincetten något in i sidan av fisken för att bringa vågen att lyfta från kroppen av fisken. Fatta skala med pincett, kurage och plats (utan inversion) i vävnadsodlingsskål. Upprepa proceduren, avlägsnande högst 12 skalor från en stor vuxen (6 från varje sida), undviker det gäl-regionen, den laterala linjen och fenor.
- Placera fisken i återhämtningen bägare och övervaka så att den återhämtar sig från effekterna av narkos. Vid denna tid, kan fisken överföras till en enskild tank. Låt fisken att återhämta sig i minst 21 dagar för att möjliggöra fullständig skala förnyelse.
- Beroende påexperimentell design, placera upp till 20 skalor per plast 35 mm vävnadskultur behandlade skål eller 4 - 6 skalor per glas nedre skålen. Tillåt skalor för att ansluta sig till skålen innan försiktigt lägga till media för att inte lossna skalor från skålen.
OBS: Med erfarenhet kan flera fiskar bearbetas innan media läggs till den första skålen. - Lägg 1,2 ml av komplett medium (se 1.2 ovan) in i varje 35 mm maträtt.
- Helst inkubera Explantation kulturer vid 28 ° C i 5% CO 2 för önskad tidsperiod med eller utan ytterligare behandling. Alternativt inkubera kulturer på en uppvärmd mikroskop scenen eller inom en levande cellodlingskammare för videomikroskop.
3. Bright och Video Mikroskopi
- Positions rätter som innehåller cellblad på mikroskop scenen och initialt fokus med 4X objektiv.
OBS: Högre förstoringar kan användas, beroende på experimentet. Som markerar platsen förvarje cell blad och / eller orientering av skålen på scenen kommer att underlätta att ta bilder under tiden med arken i ungefär samma riktning. - Ta rätter från inkubatorn och fotografiet vid olika tidpunkter, beroende på varje försöksprotokoll och placera tillbaka in i inkubatorn om bara stillbilder behövs över den experimentella tidsramen.
- När du utför video mikroskopi, uppmärksamma följande:
- Placera skalan / växande cellarket inom synfältet, så att den migrerar cellarket förblir i synfältet under hela videon.
OBS: Det kan ta lite erfarenhet av att observera hur celler migrerar från under skalan. För korta filmer, är detta mindre problematiska än för längre filmer. - För kortare tidsramar, inkubera vid RT. För längre tidsramar (18+ h), använd en uppvärmd skede eller en inkubationstid kammare för att hålla temperaturen, pH-balans, och för att minimera avdunstning av kulturen medium.
- Placera skalan / växande cellarket inom synfältet, så att den migrerar cellarket förblir i synfältet under hela videon.
4. Fixering för immunofluorescensmikroskopi
- Förbered och pre-varma alla lösningar till 28 ° C. För att kunna se keratocyter enligt fluorescens, växa Explantation kulturer som beskrivs ovan att använda glasbottnade 35 mm vävnadsodlingsskålar. Alternativt använda glas kammare diabilder.
- Lägg 0,8 ml av 4% paraformaldehyd i 1.1x PBS till varje maträtt. Ta inte bort odlingsmedier först. Inkubera vid RT i 5 min, sedan aspirera för att avlägsna lösningen.
- Lägg 0,8 ml av 4% paraformaldehyd i 1.1x PBS till varje maträtt. Inkubera vid RT i 5 min, sedan aspirera för att avlägsna lösningen.
- Såvida använder externa ligander eller externa epitoper, permeabilisera celler genom tillsats av 0,5 ml 0,2% Triton X-100 i 1 x PBS. Inkubera vid RT i 5 min, sedan aspirera för att avlägsna lösningen.
- Lägg 0,5 ml 1% BSA i 1 x PBS och inkubera under 1 timme (vid RT) eller O / N (vid 4 ° C).
OBS: Beroende på experimentella förhållanden, phalloidin kan tillsättas vid detta steg. - Efter inkubation för att aspirera bort lösningen och fortsätta med antikroppsfärgning. Alternativt lagrar odlingsskålama genom tillsats av minst 1 till 2 ml av 1% BSA i 1 x PBS under 3-4 veckor vid 4 ° C.
5. Immunofluorescens Protokoll
- Förbered primära och sekundära lösningar antikropp enligt tillverkarens rekommendationer.
OBS: Om tillverkarens rekommendationer inte är tillgängliga, är en bra utgångspunkt utspädning av primära antikroppar (i 1% BSA i 1x PBS) 1: 500 för polyklonala och 1: 1000 för monoklonala antikroppar; en bra utgångspunkt utspädning för sekundära antikroppar är 1: 1000. Justera dessa utspädningar av det ursprungliga aktie från tillverkaren högre om signalen är svag, lägre om signalen är stark och bakgrunden är ett problem. - Aspirera 1% BSA i 1 x PBS-lösning. Lägg 0,5 ml primär antikropp-lösning och inkubera under 1 timme (vid RT) eller O / N (vid 4 ° C). Avlägsna den primära antikroppslösningen, placera i en ren och märkt 1,5 ml mikrocentrifugrör, och frys vid -20 ° C.
NOTERA: Detta möjliggör återanvändning av den primära antikroppen, om det behövs. - Tvätta skålen 3 - 5 gånger med 1x PBS, ta bort och kasta PBS efter varje tvätt.
- Lägg 0,5 ml sekundär antikroppslösning. Om så önskas, tillfluorescensmärkt phalloidin (efter någon tillverkarens rekommenderade koncentration) under detta steg. Inkubera i 1 timme (vid RT) eller O / N (vid 4 ° C).
OBS: Användning av fluorescensmärkt falloidin möjliggör visualisering av aktinfilament; Vi har funnit att 488-märkt falloidin fungerar bäst i våra zebrafisk keratocyter, men andra fluoroforer kan användas. - Ta bort och kasta sekundär antikropp lösningen.
- Tvätta skålen 3 - 5 gånger med 1x PBS, ta bort och kasta PBS efter varje tvätt.
OBS: Skålen kan lagras, täckt från ljus, vid 4 ° C om det inte går att tävlaw omedelbart; se till att 1x PBS läggs i skålen innan förvaring för att säkerställa att cellerna inte torka ut men varmt till RT (20-30 min), ta sedan bort PBS strax innan man går vidare till nästa steg. - När du är redo att observera, lägga 2-3 droppar av en monteringsmedium, med eller utan DAPI, beroende på de experimentella behov, i skålen och låt sitta i 10 min vid RT.
OBS: Vi använder en kommersiellt tillgänglig, glycerol baserat monterings medium med DAPI, men kan användas andra monteringsmedier. Att tillåta 10 min för monteringsmedium för att sitta i skålen möjliggör enkelt avlägsnande av täckglas från botten av skålen. - Efter inkubation, försiktigt pressa på sidorna av skålen för att lossa och ta bort täckglas. Lägg en extra droppe monteringsmedia på en glasskiva och placera täck, celler nedåt, till bilden.
OBS: Tänk täta täck till bilden med hjälp av tydliga nagellack om sliden måste hållas längre än 1 - 2 dagar. - Observera bilden under ett fluorescensmikroskop.
OBS: De flesta av våra bilder togs med hjälp av en 40X eller 63X objektiv under oljeimmersion, men den specifika objektiv som används beror på försöksprotokoll.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Som visas i figur 1, kan observeras ark keratocyter migrera ut underifrån skalan inom timmar upprättandet explantatet kulturen. Ibland kan observeras en individuellt migrera keratocyte som har brutit sig loss från den kollektivt migrera arket. Dessutom, eftersom explantatet etablerades från en fisk som tidigare hade plockat, det finns rikligt neutrofiler migrerar genom arket. Vid längre odlingsperioder, de keratocyte plåtfragment som celler genomgår EMT 14.
Den initiala takten plåt avancemang är extremt snabb, men den här takten snabbt saktar som celler sprids (mätt med området och internuclear avstånd som ökar ~ 1,8 och ~ 3,1 faldig) under den första 48 h av kultur (Figur 2A-C). Den snabba ökningen är inte associerat med celltillväxt; Efter märkning i 24 h med fluorescerande tymidinanalogen etynyl deoxiuridin (EDU), ~ 10% av celler visar tecken på celldelning, en hastighet betydligt lägre än ses i transformerade cellinjer men mer i linje med de celler som är inblandade i reepithelization i mänskliga organotypiska kulturer 30. Vid senare tider, att fragmenten plåt (ett fenomen i samband med EMT observerats i detta system 14) vilket gör det förskott på framkanten svårt mäta.
Det område som täcks av lakan efter 24 timmar, kan användas som en snabb skärm för förmågan hos föreningar att förändra kollektiva cellmigration 15,31. När behandlingen läggs vid tidpunkten explants är etablerade, kan en dos-respons i tunnplåtsområdet ses. Vissa däggdjurs cytokiner (t.ex. TGF-1 15), kemokiner (såsom CXCL12) och små molekylinhibitorer ursprungligen kännetecknad i däggdjurssystem (t.ex., MMP-2, -9 och -13 inhibitorer 31) har framgångsrikt använts. Men som plåtområden vid 24 tim inte är normalfördelade (
I många fall är effekter av behandling (s) om kollektiv migration observerats i kortare perioder. I dessa fall kan video mikroskopi användas för att analysera svaret av den kollektivt migrera arket till behandling. När löslig RGD innehållande peptid tillsätts till odlingsmediet (tredje panelen i figur 4) för att störa endhesion bildning, lamellerna i framkant av arket snabbt krympa och därefter framkanten av lossnar och inåt ark. Eftersom hela arket dras på mindre än 2 minuter, kan svar av arket till behandlingen vara snabb.
För att bedöma lokalisering av proteiner inom tunnplåts eller inom ledar- och efterföljare celler, kan hela arket fixeras och färgas, som visas i Figur 5. Man måste vara försiktig under fixeringsprocessen som cellblad är lätt störs. I våra händer, har många polyklonala antikroppar mot de funktionella domäner av däggdjursproteiner (särskilt om cytosoliska proteiner) visats passera reagera på våra zebrafisk explantat.
Figur 1. Kollektiv migration av cellblad. Efter etablering i Explantation kultur, keratocyter migreraut från undersidan av skalan som en kollektiv enhet. (A) illustrerar den relativa mängden av celler som har migrerat bort från skalan efter endast 2 h i kultur, med (BE) tas varje timme därefter (3-6 h, respektive). Alla bilder togs vid 100 gångers förstoring. Hela sekvensen visas i Video 1; en ram togs var 30 sekund under 6 h tid. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Egenskaper hos Collective migration. Initial takt före framkanten, mätt på flera ställen, är snabb men saktar ner under den första 24 tim i kultur (A). Mätning av internuclear avstånd och cellområdet med hjälp av cultures fastställts till 4 och 24 timmar och färgades med DAPI och falloidin som referens visar att under samma tidsperiod, både internuclear avståndet (mätt från mitten av varje kärna) och ökar cellområdet (mätt som område som avgränsas av den kortikala aktin cytoskelettet, (B) och (C) respektive). Varje diagram representerar medelvärdet (± SEM) av tre oberoende försök i tre exemplar. Denna siffra har modifierats Rapanan et al. 7 Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Analys av Collective Migration använder Cell Blad Area. När till odlingsmediet under etablering av kulturen, Peptide Z-PLG-NHOH (brett spektrum MMP) och liten molekyl SB-3CT (MMP2 & 9 specifika hämmare) minskar cellblad område efter 24 timmar i kultur (A). Eftersom området för obehandlade cellblad är exponentialfördelad (B), bör uppgifter ritas som medianer med standardfel av median bestäms enligt beskrivningen i texten och anges i blått (övre referensgränsen eller URL och undre referensgränsen eller LRL; ( C)). Skillnaden mellan medianen och URL och LRL bestämma storleken på felet barer på grafen (skuggade i ljusgrönt). Denna siffra har ändrats från McDonald et al. 31 Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Tillsats av lösliga RGD peptid Leder till ark Retraktion. Under förbehandling och efter tillsats av en RGE-innehållande peptid, fortsätter cellarket att avancera. 15 sek efter tillsats av en RGD-innehållande peptid, finns det en minskning i lamellerna på den ledande kanten (infogningar). Efter ytterligare 30 sek börjar arket att dra, en dementi som fortsätter under den tid som videon (total videolängd ~ 5 min, se Video 2). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. immunofluorescensanalys. Celler färgades med en antikropp till den katalytiska domänen i MMP14a (röd) och motfärgades med fluorescensmärkt (488) falloidin (grön) och / eller DAPI(Blå). (A) och (B) representerar en typisk 4 tim ark som kommer ut från skala när (C) och (D) visar en del av en typisk 24 tim arket. Alla bilder togs vid 400 gångers förstoring. Observera att intensiteten i MMP14a färgning är högre i framkant av den framväxande cellblad (sett i (B) och (D)) och framträdande lamellipodia ses i ledaren cellerna (A) och (C)). Klicka här för en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det mest kritiska steget för framgång keratocyte Explantation kulturen tillåter skalan att hålla sig till kulturen skålen för cirka 2-3 minuter före tillsats av odlingsmediet. Cirka 75% av skalor kommer att fästa och växa blad (antalet kulturer som fastställts för varje experiment kommer att behöva justeras därefter). Keratocyte ark bildar inte runt varje skala avlägsnas från fisken och placerades i odling av flera skäl. Först DAPI färgning av explantat visar att vissa skalor har få celler fästa och därmed det förväntas att dessa skalor slipper ark keratocyter. För det andra, är förmågan hos explantat att vidhäfta till vävnadsodlingsskål en väsentlig förutsättning för ark migrering. En avgörande faktor för om skalor fastnar och en framgångsrik Explantation kultur är etablerad är tiden mellan att placera skalan på tillväxtytan och tillägg av media. Otillräcklig tid att hålla sig utan media kommer att leda till skalor floatingi media (ibland med synlig vävnad bifogas) medan en alltför lång period kommer att resultera i vidhäftande skalor med ingen tillväxt (förmodligen på grund av uttorkning av Explantation med cellrester synliga vid kanten av försäljningen). Tiden mellan skal placering i skålen och tillsatsen av tillväxtmediet kan behöva bestämmas experimentellt, eftersom faktorer såsom temperatur och fuktighet inom labbet rummet kan påverka hur snabbt celler kan vidhäfta till skålen utan att torka ut.
Fastän det antal kommersiellt tillgängliga, zebrafisk specifika antikroppar ökar, kan begränsa den mängd tillgängliga reagens. En 85% homologi mellan immunogen och målprotein typiskt anses nödvändigt för korsreaktivitet. Emellertid, såsom funktionella domäner såsom aktiva säten, protein-proteininteraktionsställen och ställen för modifiering är mer konserverade än andra regioner av proteinet, kan anti-peptid polyklonala antikroppar riktade mot dessa regioner ofta varaanvändas även om övergripande homologi är låg. Till exempel, även zebrafisk MMP14a har en övergripande 68% identitet med dess mänskliga ortolog (förväntar värde = 0), den del av identitets ökar till 79 - 96% i katalytiska och proteinbindningsställen medan snittställen på liknande högkonserverade 31. Data tyder på att en antikropp riktad mot den katalytiskt aktiva stället i humant MMP14a korsreagerar med zebrafisk keratocyter kulturer. Påståendet att färgning i zebrafisk ark kan lokalisera de sträckta cellerna i framkant 31 är förenlig med andra uppgifter som tyder på att MMP14 kan tjäna som en mekanisk sensor 32.
Det är inte möjligt att skapa en helt steril explant från en fisk som simmar i osteril akvarier vatten. Eftersom de flesta av våra experiment slutförs inom 24 timmar, vi upplever inga problem med bakterier eller svamp förorening av explantat. Men när längre inkubationstider önskas, bibehålla sterilitet of explants kan bli ett problem. När du planerar ett experiment som involverar tre eller fler dagars inkubation, finns flera försiktighetsåtgärder vidtagits för att öka sannolikheten att kulturerna förblir förorenat. Först, för att minska bakteriebelastningen, är fisken får bada i ca 1 h i tre byten av färsk, avklorerat kranvatten med eller utan tillsats av 100 | j, g / ml kanamycin. För det andra, är medierna utbyts dagligen för att upprätthålla tillräckliga nivåer av antibiotika och minska antalet eventuella bakterier. För särskilt långa inkubationer (> 5 dagar) tre tvättar med 1x PBS utförs med varje medieutbyte. Men inför detta en variabel som måste beaktas i den experimentella designen när Explantation kulturen behandlas med en exogen förening eftersom detta kommer att behöva ersättas med media. Dessutom kommer cytokiner och tillväxtfaktorer som utsöndras av explantatet tas bort med varje medieutbyte. Eftersom cellantalet är lågt och volymen av mediaär stor i en typisk keratocyte Explantation, kan denna effekt inte vara betydande.
Som fiskfjäll kräver 3 veckor att helt regenerera 33, rekommenderar vi att låta fisken att återhämta sig under denna tidsperiod innan upprepad användning av fisken i experiment. Även reformera epitelskiktet sker mycket snabbare, antar vi att vänta så lång tid mellan att använda samma fisk minimerar risken för systemiska inflammatoriska effekter som har rapporterats i kutan sårläkning i fisk 34.
Explantat har länge använts för att studera beteendet hos epitelceller. Explantat från ett brett utbud av fiskarter och groddjur har liknande rörliga egenskaper vid de individuella och kollektiva cell migrationen 3-6,35-37. Dessa celler har distinkt olika rörliga egenskaper än däggdjurs explantat men den övergripande strukturen och organisationen tycks ha en hög grad av likhet 8,30,38 14.
Vi har funnit att detta protokoll ger oss möjlighet att studera den kollektiva migration av zebrafisk keratocyter använder primära cell explantat som modellera de tidiga stadierna av sårläknings 14. Ledande experiment med nyetablerade primära kulturer undviker frågor i samband med seriepassage av primära celler eller användning av transformerade cellinjer. Explantat kan användas för att studera rollen av EMT i kutan sårläkning som EMT initieras när kulturer är etablerade. Våra studier tyder på att dessa primära explantat härma mer exakt den naturliga beteende och migrering av keratocyter inom sårade epitelskiktet in vivo. Detta protokoll utgör grunden för upprättande primärkulturer för användning vid migrationsanalyser samt för att undersöka förändringar i genen och / eller proteinuttryck i en till synes oändlig mängd experimentell conditjoner. Procedurerna är snabbt, enkelt, billigt, reproducerbar och lämplig för användning vid någon forskningsinstitution.
Sammanfattningsvis ger denna Explantation tekniken en snabb analys för kollektiv cellmigration i samband med en sårläkning modell som genomgår EMT. Förekomsten av flera celltyper i flera lager med en orienterande skala ger komplexitet till denna ex vivo odlingssystem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av medel från Mellanvästern Högskolan för hälsovetenskap Forsknings Facilitering Grant delas EEH och Midwestern University Office of Research och sponsrade program Intramural Grant delas KJL.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm Glass Bottom Culture Dishes (Poly-D Lysine Coated) | MatTek | P35GC-1.5-14-C | 1.5 mm thickness is best for coverslip removal. 14 mm diameter provides more culture area. |
| Swiss Jewelers Style Forceps, Integra, Miltex 17-303 | VWR | 21909-460 | We find that narrow, fine forceps work the best for scale removal. |
References
- Burton, K., Park, J. H., Taylor, D. L. Keratocytes generate traction forces in two phases. Molecular Biology of the Cell. 10, 3745-3769 (1999).
- Keren, K., et al. Mechanism of shape determination in motile cells. Nature. 453, 475-480 (2008).
- Lacayo, C. I., et al. Emergence of large-scale cell morphology and movement from local actin filament growth dynamics. PLOS Biology. 5, 233 (2007).
- Lee, J., Ishihara, A., Theriot, J. A., Jacobson, K. Principles of locomotion for simple-shaped cells. Nature. 362, 167-171 (1993).
- Kolega, J. The Movement of Cell Clusters. J. Cell Sci. 49, 15-32 (1981).
- Kolega, J. Effects of mechanical tension on protrusive activity and microfilament and intermediate filament organization in an epidermal epithelium moving in culture. The Journal of Cell Biology. 102, 1400-1411 (1986).
- Rapanan, J. L., Cooper, K. E., Leyva, K. J., Hull, E. E. Collective cell migration of primary zebrafish keratocytes. Experimental Cell Research. 326, 155-165 (2014).
- Richardson, R., et al. Adult Zebrafish as a Model System for Cutaneous Wound-Healing Research. Journal of Investigative Dermatology. 133, 1655-1665 (2013).
- Cheon, H., et al. Increased expression of pro-inflammatory cytokines and metalloproteinase-1 by TGF-b1 in synovial fibroblasts from rheumatoid arthritis and normal individuals. Clinica., & Experimental Immunology. 127, 547-552 (2002).
- Sandeman, S. R., Faragher, R. G. A., Allen, M. C. A., Liu, C., Lloyd, A. W. Does MMP-2 expression and secretion change with increasing serial passage of keratocytes in culture. Mechanisms of Ageing and Development. 122, 157-167 (2001).
- Schnaper, H. W., et al. Increased expression of extracellular matrix proteins and decreased expression of matrix proteases after serial passage of glomerular mesangial cells. Journal of Cell Science. 109, 2521-2528 (1996).
- Tondreau, T., et al. In vitro study of matrix metalloproteinase/tissue inhibitor of metalloproteinase production by mesenchymal stromal cells in response to inflammatory cytokines: the role of their migration in injured tissues. Cytotherapy. 11, 559-569 (2009).
- Zimmermann, T., et al. Isolation and characterization of rheumatoid arthritis synovial fibroblasts from primary culture - primary culture cells markedly differ from fourth-passage cells. Arthritis Research. 3, 72-76 (2001).
- McDonald, T. M., et al. Zebrafish keratocyte explant cultures as a wound healing model system: differential gene expressio., & morphological changes support epithelial–mesenchymal transition. Experimental Cell Research. 319, 1815-1827 (2013).
- Tan, B., Pascual, A., de Beus, A., Cooper, K., Hull, E. TGFb (transforming growth factor b) and keratocyte motility in 24-hour zebrafish explant cultures. Cell Biology International. 35, 1131-1139 (2011).
- Barut, B. A., Zon, L. I. Realizing the potential of zebrafish as a model for human disease. Physiological Genomics. 2, 49-51 (2000).
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nature Reviews Genetics. 8, 353-367 (2007).
- Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. The Journal of Clinical Investigation. 122, 2337-2343 (2012).
- Etchin, J., Kanki, J. P., Look, A. T. Methods in Cell Biology. Westerfield, M., Detric, H. W., Zon, L. I. 105, Academic Press. 309-337 (2011).
- Li, P., White, R. M., Zon, L. I. Methods in Cell Biology. Westerfield, M., White, H. W., Zon, L. I. 105, Academic Press. 403-417 (2011).
- Yen, J., et al. The genetic heterogeneity and mutational burden of engineered melanomas in zebrafish models. Genome Biology. 14, R113 (2013).
- Bouzaffour, M., Dufourcq, P., Lecaudey, V., Haas, P., Vriz, S. Fgf and Sdf-1 Pathways Interact during Zebrafish Fin Regeneration. PLoS One. 4, e5824 (2009).
- Dufourcq, P., Vriz, S. The chemokine SDF-1 regulates blastema formation during zebrafish fin regeneration. Development Genes and Evolution. 216, 635-639 (2006).
- Lee, Y., Grill, S., Sanchez, A., Murphy-Ryan, M., Poss, K. D. Fgf signaling instructs position-dependent growth rate during zebrafish fin regeneration. Development. 132, 5173-5183 (2005).
- Hyde, D. R., Godwin, A. R., Thummel, R. In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin. Journal of Visualized Experiments. 61, e3632 (2012).
- Kizil, C., Iltzsche, A., Kaslin, J., Brand, M. Micromanipulation of Gene Expression in the Adult Zebrafish Brain Using Cerebroventricular Microinjection of Morpholino Oligonucleotides. Journal of Visualized Experiments. 75, e50415 (2013).
- Konantz, J., Antos, C. L. Reverse Genetic Morpholino Approach Using Cardiac Ventricular Injection to Transfect Multiple Difficult-to-target Tissues in the Zebrafish Larva. Journal of Visualized Experiments. 88, e51595 (2014).
- Rambabu, K. M., Rao, S. H., Rao, N. M. Efficient expression of transgenes in adult zebrafish by electroporation. BMC Biotechnology. 5, 29 (2005).
- Rapanan, J. L., Cooper, K. E., Leyva, K. J., Hull, E. E. During collective migration, leader keratocytes generate tension in sheet and may become follower or individually migrating cells. Experimental Cell Research. In press, (2014).
- Safferling, K., et al. Wound healing revised: A novel reepithelialization mechanism revealed by in vitro and in silico models). The Journal of Cell Biology. 203, 691-709 (2013).
- McDonald, T. M., et al. Matrix metalloproteinases and collective cell migration in 24 primary zebrafish explant cultures: MMP13 plays an inhibitory role and MMP14 may respond to stretch during reepithelialisation. Cell Biology International Reports. 20, 24-36 (2013).
- Haage, A., Nam, D. H., Ge, X., Schneider, I. C. Matrix metalloproteinase-14 is a mechanically regulated activator of secreted MMPs and invasion. Biochemical and Biophysical Research Communications. , (2014).
- Sire, J. -Y., Girondot, M., Babiar, O. Marking zebrafish, Danio rerio (cyprinidae), using scale regeneration. The Journal of Experimental Zoology. 286, 297-304 (2000).
- Xu, Z., et al. Teleost skin, an ancient mucosal surface that elicits gut-like immune responses. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110, 13097-13102 (2013).
- Keren, K., Yam, P. T., Kinkhabwala, A., Mogilner, A., Theriot, J. A. Intracellular fluid flow in rapidly moving cells. Nature Cell Biology. 11, 1219-1224 (2009).
- Bereiter-Hahn, J., Strohmeier, R., Kunzenbacher, I., Beck, K., Voth, M. Locomotion of Xenopus epidermis cells in primary culture. Journal of Cell Science. 52, 289-311 (1981).
- Nishikawa, A., Shimizu-Nishikawa, K., Miller, L. Isolation, characterization, and in vitro culture of larval and adult epidermal cells of the frog Xenopus laevis. In Vitro Cellula., & Developmental Biology. 26, 1128-1134 (1990).
- Schober, M., et al. Focal adhesion kinase modulates tension signaling to control actin and focal adhesion dynamics. The Journal of Cell Biology. 176, 667-680 (2007).
