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Developmental Biology

अभिकर्मक, चयन, और मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल की कालोनी उठा AAVS1 सुरक्षित हार्बर में एक GFP जीन के साथ talen-लक्षित

Published: February 1, 2015 doi: 10.3791/52504
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1National Institute of Arthritis, Musculoskeletal and Skin Diseases, National Institutes of Health, 2Q Therapeutics

Introduction

भ्रूण स्टेम सेल की तरह प्रेरित स्टेम कोशिकाओं में (IPSCs) मानव दैहिक कोशिकाओं reprogram करने की क्षमता पहले ताकाहाशी एट अल द्वारा की खोज की थी। 2007 में 1। रेट्रोवायरस चार प्रतिलेखन कारक व्यक्त के साथ transduced मानव त्वचीय fibroblasts (इतनी-करार दिया यामानाका Oct3 कारकों / 4, Sox2, सी Myc, और Klf4) आकृति विज्ञान, परमाणु प्रसार, जीन अभिव्यक्ति, और epigenetic स्थिति पर आधारित मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (hESCs) को अत्यधिक समान होना दिखाया गया; महत्वपूर्ण, IPSCs भी तीनों जनन परतें एक की कोशिकाओं में फर्क करने में सक्षम हैं। IPSCs की proliferative संभावित और भेदभाव क्षमता उन्हें बहुत आकर्षक औजार बनाता है; विशिष्ट रोगों से पीड़ित रोगियों से कोशिकाओं reprogramming द्वारा, IPSCs इन विट्रो रोग मॉडल प्रणाली के रूप में और संभावित चिकित्सा विज्ञान के रूप में दोनों का इस्तेमाल किया जा सकता है।

बाद के प्रयोजन के लिए, कई मुद्दों IPSCs की पूरी क्षमता से पहले संबोधित किया जाना चाहिएएक नैदानिक ​​सेटिंग में महसूस किया जा सकता है; इन विट्रो सुसंस्कृत hESCs और IPSCs, reprogramming और सेल रखरखाव के दौरान xenogenic डेरिवेटिव के उपयोग की tumorigenic क्षमता है, और इन विवो में प्रतिरोपित कोशिकाओं ट्रैक करने की आवश्यकता पर Hentze एट द्वारा समीक्षित स्टेम सेल के नैदानिक ​​आवेदन (करने के लिए सभी महत्वपूर्ण बाधा दौड़ रहे हैं। 2)। विभेदित कोशिकाओं बाद प्रत्यारोपण पर नज़र रखने के लिए जरूरत के लिए एक आदर्श समाधान की परवाह किए बिना आवेदन के मुंह बंद करने और विचित्र रंगना को तैयार नहीं है कि एक नेत्रहीन पता लगाने योग्य मार्कर शामिल होगा। बहिर्जात डीएनए सुरक्षित बंदरगाह स्थल में पेश किया जाता है जब एकीकृत transgenes की मजबूत और निरंतर अभिव्यक्ति सबसे आसानी से प्राप्त है; वह यह है कि एक एकीकृत वेक्टर के पर्याप्त प्रतिलेखन सक्षम है कि जीनोमिक साइटों पड़ोसी जीन 3 में अभिव्यक्ति की perturbations को कम ही समय में जबकि। बहुत अच्छी तरह से अपनी खोज के बाद से बताया गया है कि एक ऐसी साइट एडिनो से जुड़े वायरस integr हैप्रोटीन फॉस्फेट एक विनियामक सबयूनिट 12C (PPP1R12C) जीन की पहली Intron में समझना साइट 1 (AAVS1),। यह ठिकाना निरंतर और विस्तारित समय के माध्यम से एकीकृत transgenes की मजबूत अभिव्यक्ति संस्कृति में और इन विट्रो भेदभाव 3 में, लेकिन यह भी ट्रांसक्रिप्शनल गड़बड़ी 4 से जीन के आस-पास की रक्षा के लिए अनुमति देने के लिए न केवल दिखाया गया है; दोनों सुविधाओं की वजह से AAVS1 साइट 5 flanking अंतर्जात क्रोमेटिन इन्सुलेटर तत्वों की उपस्थिति के लिए माना जाता है।

सिर्फ पिछले एक दशक में जीनोम इंजीनियरिंग उपकरण के क्षेत्र में अग्रिम बहुत किसी भी प्रकार की कोशिका में आनुवंशिक जोड़तोड़ प्राप्त किया जा सकता है जिसके साथ आसानी और दक्षता में मदद की है। जल्दी सफल प्रयोगों ESCs 6,7 में लक्षित जीन को प्राप्त करने के लिए एक शुरुआत की दाता के साथ अंतर्जात मुताबिक़ पुनर्संयोजन (एचआर) के बेहद निम्न स्तर पर भरोसा करते हैं, जैसे जिंक उंगली न्युक्लिअसिज़ (ZFNs), signi रूप में है कि साइट विशेष न्युक्लिअसिज़, का उपयोगficantly ऐसे प्रयोगों 8,9 की दक्षता में वृद्धि हुई एक डबल असहाय डीएनए को तोड़ने की पीढ़ी के माध्यम से मुताबिक़ पुनर्संयोजन प्रेरित। दोनों प्रतिलेखन उत्प्रेरक की तरह प्रभावोत्पादक संयंत्र रोगजनक xanthomonas पीढ़ी की (कहानियाँ) और प्रोकार्योटिक क्लस्टर नियमित रूप से interspaced कम मुरजबंध संबंधी दोहराता (CRISPR) कुशल साइट विशेष डिजाइनर न्युक्लिअसिज़ में / Cas9 प्रणाली की repurposing स्टेम सेल में लक्षित जीन बना दिया है एक सुलभ और साध्य कार्यप्रणाली 10-13।

हाल ही में एक कागज कहानी न्युक्लिअसिज़ (TALENS) 14 का उपयोग करते हुए मानव IPSCs में AAVS1 सुरक्षित बंदरगाह ठिकाना में एक हरे रंग फ्लोरोसेंट संवाददाता कैसेट के स्थिर एकीकरण के लिए एक कारगर तरीका वर्णित है। इन लक्षित IPSCs ऐसी की उपयोगिता के लिए पुख्ता सबूत उपलब्ध कराने के भी रोधगलन (एमआई) के एक माउस मॉडल में cardiomyocytes और प्रत्यारोपण के लिए निर्देशित भेदभाव के बाद उनके प्रतिदीप्ति बनाए रखाstably फ्लोरोसेंट स्टेम सेल 14। लक्षित कालोनियों को प्राप्त करने के लिए, एक जीन-जाल विधि एक splicing के स्वीकर्ता (एसए), 2A आत्म cleaving पेप्टाइड अनुक्रम अंतर्जात PPP1R12C प्रमोटर के नियंत्रण के तहत puromycin एन एसिटाइल-ट्रांस्फ़्रेज़ (पीएसी) जीन रखता है जिसमें इस्तेमाल किया गया था; इस प्रकार, AAVS1 ठिकाना पर डीएनए दाता को शामिल किया है कि केवल IPSCs puromycin प्रतिरोध के आधार पर चयन उन्हें प्रतिपादन, पीएसी व्यक्त; (चित्रा 1, 15)। इस प्रोटोकॉल के आधार पर IPSCs, AAVS1-GFP के IPSCs TALENS साथ IPSCs transfecting की प्रक्रिया और AAVS1 सुरक्षित बंदरगाह ठिकाना में एक 4.2kb डीएनए टुकड़ा एकीकृत करने के लिए एक 9.8 केबी दाता सहित हाल के पेपर 14 में रिपोर्ट पैदा करने के चयन की प्रक्रिया का विवरण puromycin प्रतिरोध, और क्लोनल विस्तार के लिए उठा कालोनियों। इस के साथ साथ वर्णित तकनीकों कई जीनोम इंजीनियरिंग प्रयोगों के लिए लागू किया जा सकता है।

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Protocol

1. तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स की तैयारी और plasticware के कोटिंग

  1. बर्फ पर -20 डिग्री सेल्सियस से जमे हुए तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स शेयर प्लेस और 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात पिघलना।
  2. विगलन के बाद, पूर्व ठंडा Eppendorf ट्यूबों में तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स के पिपेट 2 मिलीग्राम aliquots। जब तक जरूरत -20 डिग्री सेल्सियस पर इन स्टोर।
  3. तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स लेपित प्लेटें तैयार Eppendorf ट्यूब गायब हो जाता है में बर्फ के अंतिम टुकड़ा (आमतौर पर 2 ~ भीतर मानव संसाधन) जब तक बर्फ पर एक विभाज्य पिघलना करने के लिए।
  4. विगलन के बाद, तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स कोटिंग समाधान बनाने के लिए ठंडा (4 डिग्री सेल्सियस) DMEM / F12 के 12 मिलीलीटर तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स जोड़ें।
  5. उचित संस्कृति पोत को तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स समाधान जोड़ें। 6 अच्छी तरह से थाली के लिए, अच्छी तरह से प्रति 1 मिलीलीटर बांटना। तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स समाधान पूरी तरह से प्रत्येक अच्छी तरह से शामिल किया गया है सुनिश्चित करने के लिए थाली ज़ुल्फ़।
  6. Parafilm के तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स में लिपटे थाली / पकवान सील, और roo पर सेतेउपयोग करने से पहले एक घंटे के लिए एम तापमान। वैकल्पिक रूप से, दुकान के तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स लेपित प्लेटें / 4 डिग्री सेल्सियस पर व्यंजन और कोटिंग के दो सप्ताह के भीतर का उपयोग करें।
    नोट: सुखाने को रोकने के तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स लेपित प्लेट / डिश के लिए अतिरिक्त DMEM / F12 जोड़ें। 4 डिग्री सेल्सियस संग्रहीत तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स में लिपटे थाली / पकवान का उपयोग करने से पहले, एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट में जगह और यह कम से कम 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान के लिए आने के लिए अनुमति देते हैं।
  7. पूरी तरह से मध्यम और कोशिकाओं के अलावा पहले महाप्राण तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स।

E8 माध्यम की 2. तैयारी

  1. 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात E8 पूरक विगलन द्वारा E8 संस्कृति के माध्यम से तैयार करें।
  2. 500 मिलीलीटर स्टॉक से E8 बेसल माध्यम के 10 एमएल निकालें और त्यागने।
  3. सीधे E8 बेसल माध्यम की 490 मिलीलीटर में E8 पूरक के पूरे 10 एमएल की शीशी पिपेट। दोहराया तापमान के उतार चढ़ाव comple में bFGF नीचा कर सकते हैं, जैसा कि एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में नहीं गर्म पूरा E8 मध्यम करोते E8 मध्यम।
  4. पूरक के अलावा के दो सप्ताह के भीतर पूरा E8 माध्यम का उपयोग।

IPSCs 3. विगलन

  1. सूखी बर्फ पर तरल नाइट्रोजन और जगह से जमे हुए IPSCs की एक शीशी निकालें।
  2. तेजी से एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में शीशी पिघलना; बर्फ अवशेष का केवल एक सा टुकड़ा जब तक पानी के स्नान में शीशी ज़ुल्फ़।
  3. एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट के लिए 70% इथेनॉल और हस्तांतरण के साथ शीशी स्प्रे।
  4. सीधे शीशी को कमरे के तापमान E8 मध्यम dropwise के 1 मिलीलीटर जोड़ें।
  5. एक 2 एमएल पिपेट का उपयोग, एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में E8 माध्यम के 9 मिलीलीटर में सेल निलंबन dropwise हस्तांतरण। कोशिकाओं और मध्यम जल्दी मिश्रण अच्छी तरह से है कि यह सुनिश्चित करने के लिए अक्सर ट्यूब ज़ुल्फ़।
  6. 5 मिनट के लिए 200 XG पर कोशिकाओं अपकेंद्रित्र।
  7. सतह पर तैरनेवाला Aspirate, और 10 माइक्रोन वाई 27,632 के साथ पूरक E8 का एक उचित मात्रा में सेल गोली resuspend।
  8. तहखाने का एक उपयुक्त संख्या कोशिकाओं जोड़ें membranरातोंरात एक 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में ई मैट्रिक्स लेपित कुओं, और जगह। यह विगलन के बाद जल्दी ठीक होने के लिए सक्षम करने के लिए एक 6 अच्छी तरह से थाली के प्रति अच्छी तरह से कम से कम 0.2 एक्स 10 6 IPSC थाली करने के लिए सिफारिश की है।

4. रखरखाव और IPSCs की नियमित Passaging

  1. दैनिक E8 मध्यम ताज़ा करें।
  2. एक औंधा माइक्रोस्कोप के साथ आकृति विज्ञान और कोशिकाओं के confluency मॉनिटर। उच्च गुणवत्ता के IPSCs अलग सीमाओं के साथ फ्लैट कालोनियों में बढ़ने; अलग-अलग कालोनियों एक "पत्थर की तरह" उपस्थिति के पास है।
  3. पैसेज IPSCs कोशिकाओं वे ~ 70% confluency तक पहुँचने।
  4. 0.9 छ NaCl और 500 मिलीलीटर DPBS के लिए 500 μl 0.5 एम EDTA जोड़कर एक EDTA के passaging के समाधान तैयार है। बाँझ NaCl, और वैक्यूम फिल्टर भंग करने के लिए अच्छी तरह से मिलाएं। Passaging करने से पहले एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में passaging के समाधान के एक विभाज्य गर्म।
  5. पारित होने के लिए, महाप्राण संस्कृति के माध्यम से खर्च किया और गर्म सहूलियत के एक बराबर मात्रा के साथ एक बार कोशिकाओं को धोनेसमाधान saging। कोट करने के लिए महाप्राण, और पिपेट पर्याप्त EDTA के passaging के समाधान कोशिकाओं (6 अच्छी तरह से थाली के प्रति अच्छी तरह से 1 मिलीलीटर)।
  6. एक औंधा माइक्रोस्कोप के तहत कोशिकाओं प्लेस और IPSC कालोनियों का निरीक्षण। कालोनियों और उठाया सीमाओं के भीतर छेद की उपस्थिति 2 से 5 मिनट के भीतर स्पष्ट हो जाना चाहिए।
  7. ध्यान से EDTA के passaging के समाधान aspirate।
  8. सीधे अच्छी तरह से passaged होने के लिए प्रत्येक में उच्च दबाव के तहत (6 अच्छी तरह से थाली अगर) का उपयोग एक 10 एमएल पिपेट का उपयोग, E8 मध्यम के 4 मिलीलीटर बांटना।
  9. IPSC गुच्छों लीजिए, और एक से विभाजित अनुपात के आधार पर कुओं की एक उचित संख्या में विभाजित: 1:12 से 8। ओवर-पिपेट, के रूप में सेल clumps के disaggregation गरीब व्यवहार्यता में परिणाम होगा न करें।
  10. एक मशीन में थाली प्लेस, और कोशिकाओं को फैलाने के लिए पीछे और आगे और पक्ष की ओर से कई बार थाली रॉक।

Tansfection के लिए MEFs और IPSCs 5. तैयारी

  1. Transfectio को 48 घंटा पूर्वएन, बीतने IPSCs ~ 1 पर: एक तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स लेपित 6 अच्छी तरह से थाली के चार या अधिक कुओं में 6 वे दो दिन इसलिए 70% मिला हुआ होना होगा।
  2. अगले दिन, 10% FBS और 1x सदस्य NEAA के साथ पूरक DMEM (उच्च ग्लूकोज) से मिलकर MEF माध्यम में DR4 MEFs पिघलना।
  3. ~ 2 एक्स 10 4 कोशिकाओं / 2 सेमी से कम दो 10 सेमी बर्तन में थाली DR4 MEFs और रात भर में 37 डिग्री सेल्सियस सेते हैं।
  4. अभिकर्मक के दिन, 30 मिनट IPSCs पर अभिकर्मक प्रदर्शन से पहले 10 माइक्रोन वाई 27,632 के साथ पूरक E8 के लिए MEF मध्यम बदल जाते हैं।
  5. वैकल्पिक: IPSCs बाद अभिकर्मक के प्रवाह cytometric विश्लेषण वांछित है, कमरे में अस्थायी पर एक तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स में लिपटे 4 डिग्री सेल्सियस से थाली और जगह को हटा दें।
  6. वैकल्पिक: 4 ​​घंटा पूर्व अभिकर्मक के लिए, 10 माइक्रोन के अंतिम एकाग्रता में वाई 27,632 के साथ पूर्व अभिकर्मक IPSC संस्कृति के पूरक है।

6. कोमल-सेल हदबंदी अभिकर्मक उपचार एकएन डी अभिकर्मक IPSCs की एक Electroporation सिस्टम का उपयोग

  1. 4 डिग्री सेल्सियस से पी 3 प्राथमिक सेल अभिकर्मक समाधान निकालें और यह ~ के लिए कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए आने के लिए अनुमति देते हैं। का उपयोग करने से पहले अभिकर्मक समाधान करने के लिए पूरे 100 μl पूरक जोड़ें।
  2. एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में गर्म कोमल-सेल हदबंदी अभिकर्मक।
  3. AAVS1 TALENS (PZT-AAVS1-एल 1 और PZT-AAVS1-आर 1) -20 डिग्री सेल्सियस से और AAVS1-कैग-EGFP दाता प्राप्त करते हैं।
  4. इनक्यूबेटर से IPSCs निकालें और DPBS के साथ एक बार धो लें।
  5. अच्छी तरह से प्रति कोमल-सेल हदबंदी अभिकर्मक के 1 मिलीलीटर जोड़ें, और 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर IPSCs सेते हैं, या कोशिकाओं के 50% से अधिक संस्कृति पोत से अलग कर दिया है जब तक।
  6. ऊपर और संस्कृति पोत से किसी भी शेष कोशिकाओं को अलग कर देना, और IPSC clumps को तोड़ने के लिए एक P1000 पिपेट का उपयोग कर एक बार कुछ नीचे कोशिकाओं पिपेट।
  7. Furth करने के लिए एक 10 एमएल पिपेट का उपयोग कर प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए E8 मध्यम 2 मिलीलीटर जोड़ें, और विंदुक ऊपर और नीचे कई बारएर एकल कक्षों में सेल clumps disaggregate
    नोट: सेल clumps पर्याप्त disaggregated नहीं कर रहे हैं अगर अभिकर्मक दक्षता में काफी गिरावट आती है।
  8. 3 मिनट के लिए 100 XG पर एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में IPSCs, और अपकेंद्रित्र लीजिए।
  9. E8 माध्यम की एक न्यूनतम राशि में महाप्राण सतह पर तैरनेवाला, और resuspend कोशिकाओं।
  10. एक महत्वपूर्ण दाग जैसे 0.4% Trypan नीले के आवेदन के बाद एक hemocytometer का उपयोग कोशिकाओं की गणना। ("पेड़ों का झुरमुट 'के अनुसार 1-3 कोशिकाओं) की गिनती जबकि कोशिकाओं को पर्याप्त अलग कर रहे हैं कि सुनिश्चित करें।
  11. दो 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में से प्रत्येक में 3 एक्स 10 6 कोशिकाओं बांटना, और 3 मिनट के लिए 100 XG पर नीचे फिर से स्पिन।
    नोट: कम गति centrifugation के सेल तनाव कम कर देता है और electroporation से पहले IPSCs की आसान फिर से निलंबन की अनुमति देता है।
  12. मानव भ्रूण स्टेम सेल लाइन H9 (कार्यक्रम सीबी-150) के लिए सेल प्रकार विशिष्ट कार्यक्रम के लिए electroporation के सिस्टम सेट।
  13. Centrifugation के बाद, सेल से सतह पर तैरनेवाला महाप्राणएल छर्रों। एक गोली के लिए, नियंत्रण नमूना के रूप में मानव संसाधन दाता के 10 माइक्रोग्राम प्रति जोड़ें। अन्य गोली के 5 माइक्रोग्राम प्रति के साथ साथ मानव संसाधन दाता के 10 माइक्रोग्राम प्रति जोड़ने के लिए, प्रत्येक प्रयोगात्मक नमूने के रूप में talen (PZT-AAVS1-एल 1 और PZT-AAVS1-आर 1)।
  14. पी 3 प्राथमिक सेल अभिकर्मक समाधान के 100 μl में प्रत्येक कोशिका गोली Resuspend, और एक क्युवेट के लिए स्थानांतरण।
  15. अभिकर्मक प्रदर्शन और तुरंत प्रत्येक क्युवेट करने के लिए कमरे के तापमान E8 माध्यम के 500 μl जोड़ें।
  16. कदम 5.4 में तैयार DR4 MEFs युक्त एक 10 सेमी डिश के लिए ट्रांसफ़ेक्ट IPSCs dropwise स्थानांतरण।
  17. वैकल्पिक: अभिकर्मक दक्षता की anaylsis प्रवाह cytometry वांछित है अगर एक तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स लेपित 6 अच्छी तरह से थाली में से एक कुएं में एक प्रयोग से कई बूँदें जोड़ें।
  18. दोहराएँ दोनों नमूनों को समाप्त करने के लिए 6.15-6.17 कदम। अगले दिन, DPBS के साथ कोशिकाओं में दो बार धोने और E8 से फीडरों पर बेहतर IPSC संस्कृति का समर्थन करने के लिए प्रकट होता है, जो NutriStem, करने के लिए संस्कृति के माध्यम से स्विच।
  19. Tr48 घंटा बाद अभिकर्मक से 72 पर ansient EGFP अभिव्यक्ति चोटियों; के रूप में वांछित अभिकर्मक दक्षता का आकलन करें।

लक्षित IPSCs 7. puromycin चयन

  1. IPSCs 70 confluency% तक पहुँच जाने puromycin चयन अभिकर्मक के बाद 72 घंटा शुरू करो।
  2. NCRM5 IPSCs के लिए, NutriStem संस्कृति माध्यम में पतला 0.5 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / puromycin (1/2 पूरी खुराक) में puromycin चयन शुरू करते हैं। इष्टतम puromycin एकाग्रता 0.25 से कुछ IPSC लाइनों के लिए 1 माइक्रोग्राम प्रति / एमएलएल के लिए भिन्न हो सकते हैं।
  3. दैनिक मध्यम ताज़ा कर 3 दिनों के लिए NutriStem + 0.5 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / puromycin में संस्कृति IPSCs,।
  4. तीन दिनों के बाद, एक माइक्रोग्राम प्रति / मिलीलीटर puromycin की एकाग्रता में वृद्धि।
  5. / एमएल puromycin चयन एक माइक्रोग्राम प्रति तहत संस्कृति IPSCs एक और 7-8 दिनों के लिए, या जब तक अलग कालोनियों कॉलोनी चुनने के लिए काफी बड़े दिखाई देते हैं।

8. कालोनी उठा और लक्षित IPSCs का विस्तार

  1. इस्तेमाल की तहखाने झिल्लीकोट करने के लिए मैट्रिक्स अच्छी तरह से प्रत्येक में (12 मिलीलीटर DMEM / F12 में पतला 2 मिलीग्राम तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स) तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स कोटिंग समाधान के 50 μl वितरण से एक 96 अच्छी तरह से थाली। 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात उपयोग करने से पहले थाली स्टोर।
  2. तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स में लिपटे थाली कमरे के तापमान को आने की अनुमति के बाद, तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स महाप्राण और 10 माइक्रोन वाई 27,632 प्रत्येक कुएं में साथ पूरक 100 μl E8 बांटना।
  3. एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट में एक औंधा माइक्रोस्कोप, जगह और बाँझ 70% EtOH के साथ हल्के से स्प्रे।
  4. नोक पर एक छोटे "हुक" है कि एक आदर्श कॉलोनी उठा उपकरण प्राप्त करने के लिए एक लेम्प बर्नर पर एक गिलास पाश्चर विंदुक खींचो। 70% EtOH के साथ बाँझ, और सूखे के लिए हुड में जगह है।
  5. इनक्यूबेटर से लक्षित IPSC कालोनियों युक्त पकवान निकालें, और माइक्रोस्कोप के तहत हुड में जगह है।
  6. कॉलोनी उठा उपकरण के साथ कॉलोनी सीमा के चारों ओर एक चक्र अनुरेखण द्वारा IPSCs उठाओ।
  7. धीरे परिमार्जन और थाली की सतह से IPSC कॉलोनी दूर करने के लिए कॉलोनी उठा उपकरण के "हुक" का प्रयोग करें। बड़े कालोनियों के लिए, कॉलोनी फिर से चढ़ाना के बाद सेल के विकास की सुविधा होगी तिमाही के लिए कॉलोनी उठा उपकरण के साथ एक एक्स आकर्षित किया था।
  8. सेल clumps अलग और स्वतंत्र रूप से चल रहे हैं एक बार, IPSCs इकट्ठा करने के लिए ~ 30 μl सेट एक P200 पिपेट का उपयोग करें। सीधे 96 अच्छी तरह से थाली में प्लेट कोशिकाओं।
  9. वैकल्पिक: फिर 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए पचाने के लिए 50 μl कोमल-सेल हदबंदी अभिकर्मक जोड़ने के लिए, एक Eppendorf ट्यूब में IPSCs इकट्ठा करने के लिए ~ 5 μl करने के लिए सेट एक P20 पिपेट का उपयोग करें। पाचन के बाद, कोमल-सेल हदबंदी अभिकर्मक पतला और 5 मिनट के लिए एक मानक टेबल टॉप microcentrifuge में 200 XG पर कोशिकाओं नीचे स्पिन करने के लिए Eppendorf ट्यूब में 500 μl E8 मध्यम जोड़ें। तो मध्यम के सबसे महाप्राण और ~ resuspend और 96 अच्छी तरह से थाली में कोशिकाओं को स्थानांतरित करने के लिए 30 μl छोड़ दें।
    नोट: यहदृष्टिकोण सेल पेड़ों का झुरमुट और उठाया कॉलोनी के त्वरित विस्तार की हदबंदी की सुविधा होगी।
  10. IPSC कालोनियों के लिए पर्याप्त संख्या में एकत्र किया गया है, जब तक कॉलोनी उठा जारी रखें (मोटे तौर पर प्रयोग के प्रति 20-30 कालोनियों की सिफारिश की है)।
  11. कॉलोनी चुनने के बाद, रात भर एक मशीन में 96 अच्छी तरह से थाली जगह है। पूरा E8 मध्यम अगले दिन, और संस्कृति 70 ~ जब तक% मिला हुआ साथ ताज़ा।
  12. में 96 अच्छी तरह से पारित होने कोशिकाओं को एक 24-ठीक है, तो में 6 अच्छी तरह से, कदम 4.5-4.10 में वर्णित है।
    नोट: 6 अच्छी तरह से थाली की तुलना में छोटे कुओं का उपयोग करते समय EDTA समाधान और E8 मध्यम की मात्रा आनुपातिक कम किया जाना चाहिए।
  13. बेतरतीब ढंग से डाला वैक्टर 16 के लक्षित कैसेट एकीकरण और गैर-मौजूदगी की पुष्टि करने के लिए जंक्शन पीसीआर और दक्षिणी धब्बा विश्लेषण द्वारा लक्षित कर सफलता का आकलन करें।

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Representative Results

प्रोटोकॉल के एक दृश्य IPSCs NutriStem के लिए या तो e8 के लिए हरे या नीले रंग से प्रकाश डाला अलग माध्यम में संवर्धित कर रहे हैं जिसके दौरान समय के साथ, चित्रा 2 में प्रदान की जाती है। यह केवल उच्च गुणवत्ता वाले IPSCs transfect करने के लिए महत्वपूर्ण है; नियमित रखरखाव के दौरान संस्कृति व्यंजन की जांच करने और IPSC संस्कृतियों एक cobblestone-जैसे आकृति विज्ञान असर मुख्य रूप से अलग कालोनियों (चित्रा 3 ए) को शामिल सत्यापित करें कि; विभेदित कोशिकाओं संस्कृति का अधिक से अधिक 10% पर कब्जा नहीं करना चाहिए। IPSCs की Transfectability की वजह से अपने छोटे आकार के लिए आम तौर पर अधिकतम प्राप्त दक्षता का प्रतिनिधित्व करता है pMax-GFP के साथ अभिकर्मक के रूप में छोटे pMax-GFP वेक्टर (चित्रा -4 ए-बी), का उपयोग मूल्यांकन और अनुकूलित है। उदाहरण के लिए, हम pMax-GFP (4B चित्रा) के साथ 68.6% अभिकर्मक दक्षता हासिल की। AAVS1 सुरक्षित बंदरगाह को लक्षित करने के लिए, IPSCs एक सज्जन एकल कोशिका हदबंदी अभिकर्मक का उपयोग कर passaged कर रहे हैं और AAVS1-TALENS और AAVS1- साथ ट्रांसफ़ेक्ट हैंकैग-EGFP (चित्रा 1 ए में दर्शाया प्लास्मिड)। ट्रांसफ़ेक्ट IPSCs तो DR4 MEFs (3B चित्रा) का एक उपयुक्त घनत्व पर चढ़ाया जाता है। 48 से 72 घंटे बाद अभिकर्मक (चित्रा -3 सी) में AAVS1-कैग-EGFP चोटियों के क्षणिक अभिव्यक्ति; अगर वांछित, ट्रांसफ़ेक्ट IPSCs के एक छोटे से हिस्से में FACS विश्लेषण किया जा सकता है। NCRM5 IPSCs AAVS1-कैग-EGFP दाता (चित्रा 4C) का उपयोग कर 60.9% की दक्षता के साथ ट्रांसफ़ेक्ट किया जा सकता है। अभिकर्मक दक्षता काफी भिन्न हो सकते हैं; + GFP अंश भी रूप में कम के रूप में 10% है जिसमें प्रयोगों के लिए, puromycin चयन करने के लिए जारी है। Puromycin चयन प्रदर्शन के बाद, वर्दी प्रतिदीप्ति प्रदर्शित करने के अलग-अलग क्लोन कॉलोनी उठा (चित्रा 3 डी) के लिए इतना बड़ा होना चाहिए। क्लोन लेने के लिए एक उपयुक्त कॉलोनी कम बढ़ाई (3E चित्रा) के नीचे स्थित है और पहली अनुरेखण द्वारा पृथक और यह (आंकड़े 3F-जी) quartering है। quartered कालोनियों फिर धीरे से नोच कर रहे हैंसंस्कृति पोत (चित्रा 3H) से डी। एक P200 विंदुक का प्रयोग, सेल clumps तो एक तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स में लिपटे 96 अच्छी तरह से थाली में से एक कुएँ में स्थानांतरित कर रहे हैं। IPSCs चढ़ाना के 2-4 घंटे (चित्रा 3I) के भीतर संलग्न करना चाहिए। कुर्की 24 घंटे के भीतर नहीं मनाया जाता है, तो तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स कोटिंग या वाई 27,632 उपचार संभावना उप इष्टतम थे; तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स-कोट एक नया 96 अच्छी तरह से थाली और किसी भी अधिक कालोनियों पहले उठा ताजा E8 + 10 माइक्रोन वाई 27,632 तैयार करते हैं। एक बार एक 96 अच्छी तरह प्रारूप में, IPSC क्लोन विस्तार कर रहे हैं और GFP (आंकड़े 4D-ई) के स्थिर और वर्दी अभिव्यक्ति का प्रदर्शन करना चाहिए निशाना बनाया।

चित्रा 1
चित्रा 1: जीन वैक्टर को लक्षित और योजनाबद्ध को लक्षित। इस अध्ययन में इस्तेमाल AAVS1-कैग-EGFP के (ए) अभ्यावेदन, और PZT-AAVS1-एल 1 / आर 1 TALENS प्लास्मिड। सा-AAVS1-कैग-EGFP प्लाज्मिड में 2A तत्व लक्षित एकीकरण की घटनाओं के लिए puromycin एन एसिटाइल-ट्रांस्फ़्रेज़ (पीएसी) जीन अभिव्यक्ति को सीमित करने के लिए इस्तेमाल ब्याह-स्वीकर्ता और 2A आत्म cleaving पेप्टाइड का प्रतिनिधित्व करता है। चिकन β-actin के ग्लोबिन (सीएजी) के प्रमोटर EGFP के अभिव्यक्ति ड्राइव करने के लिए प्रयोग किया जाता है। (बी) PPP1R12C जीन की इंट्रॉन एक के भीतर निहित AAVS1 सुरक्षित बंदरगाह, एक डबल असहाय डीएनए को तोड़ने उत्पन्न करने के लिए TALENS का उपयोग कर लक्ष्य रखा गया है। यह तो मरम्मत के लिए एक सब्सट्रेट के रूप में AAVS1-कैग-EGFP दाता (कट साइट flanking असर अनुरूपता हथियार) का उपयोग करता है जो मुताबिक़ पुनर्संयोजन (मानव संसाधन) की मरम्मत मशीनरी, सक्रिय। कैसेट एकीकृत है और पीएसी जीन अंतर्जात PPP1R12C प्रमोटर के नियंत्रण के तहत रखा गया है।

चित्रा 2
चित्रा 2। जीन को लक्षित प्रयोग की समय रेखा। IPSCs संवर्धित कर रहे हैं70 confluency% और करने के लिए ~ 1 passaged: दिन -2 (डी -2) पर 6। MEFs डी -1 पर चढ़ाया जाता है, और IPSCs एकत्र की है और D0 पर ट्रांसफ़ेक्ट हैं। डी 1 में, मीडिया NutriStem के लिए बंद किया गया है, और puromycin D3 पर मध्यम से जोड़ा जाता है पहले IPSCs दो और दिनों के लिए सुसंस्कृत हैं। कालोनियों में आम तौर पर D12 से चुनने के लिए तैयार हैं। NutriStem संस्कृति की अवधि के नीले रंग में हैं, जबकि IPSCs E8 मध्यम में संवर्धित कर रहे हैं जिसके दौरान काल, हरी डाला जाता है।

चित्रा 3
चित्रा 3: प्रतिनिधि छवियों को लक्षित IPSC जीन उच्च गुणवत्ता IPSCs (ए) चरण छवि।। चरण-उज्ज्वल सीमा और cobblestone-जैसे आकृति विज्ञान पर ध्यान दें। (बी) DR4 MEFs दो चौबीस घंटे विगलन के बाद 2 एक्स 10 4 कोशिकाओं / सेमी पर चढ़ाया। (सी) बहत्तर घंटे बाद अभिकर्मक, EGFP + कोशिकाओं स्पष्ट रूप से स्पष्ट कर रहे हैं एक प्रतिदीप्ति माइकर के तहत जब देखाoscope। 14 दिनों के ~ लिए puromycin आधारित चयन के बाद (डी), वर्दी GFP प्रतिदीप्ति प्रदर्शित करने कालोनियों उठाया जा करने के लिए काफी बड़े हैं। (एह) कॉलोनी उठा प्रक्रिया के प्रतिनिधि छवियाँ। कालोनियों छोटे सेल clumps प्राप्त करने के लिए यह quartering से तो कॉलोनी रूपरेखा के द्वारा, और सबसे पहले, एक खींचा पाश्चर विंदुक का उपयोग कर उठाया जाता है। (मैं) IPSC कालोनियों के लिए 2 भीतर 96 अच्छी तरह से थाली के तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स लेपित सतह को देते उठाया 4 घंटा। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4: अभिकर्मक दक्षता और प्रतिरूप लक्षित IPSCs की FACS विश्लेषण। किसी भी प्लाज्मिड के अभिकर्मक के बिना (ए) के नियंत्रण NCRM5 IPSCs। (बी) NCRM5छोटी परीक्षण वेक्टर pMax-GFP के साथ ट्रांसफ़ेक्ट IPSCs (सी) AAVS1-कैग-EGFP प्लाज्मिड की क्षणिक अभिव्यक्ति। FACS GFP अभिव्यक्ति के लिए विश्लेषण कर रहे हैं FACS द्वारा मूल्यांकन किया है। (घ) NCRM5-AAVS1-कैग-EGFP क्लोन प्रदर्शित करता है FACS द्वारा assayed के रूप में समान रूप से सकारात्मक EGFP अभिव्यक्ति। सी की तुलना में) का विश्लेषण किया IPSCs की तंग क्लस्टरिंग ध्यान दें। (एक विस्तारित NCRM5-AAVS1-कैग-EGFP लक्षित क्लोन की ई) प्रतिदीप्ति छवि।

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Discussion

(1) कुशलतापूर्वक अभिकर्मक से IPSCs में talen और दाता प्लास्मिड पहुंचाने;: AAVS1 सुरक्षित बंदरगाह के सफल पीढ़ी के लिए सबसे महत्वपूर्ण कदम मानव IPSCs कर रहे हैं लक्षित (2) अभिकर्मक के बाद अभिकर्मक और चढ़ाना घनत्व पहले एकल कक्षों में IPSCs की हदबंदी के अनुकूलन; (3) खुराक और IPSC लाइन के विकास के आधार पर दवा चयन के समय के अनुकूलन; (4) ध्यान से विदारक और लक्षित कालोनियों उठा और अच्छी तरह / नई प्लेट को स्थानांतरित। Hockemeyer का अखबार 10 में इस्तेमाल इसी तरह के तरीकों की तुलना में, इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया IPSCs की संख्या को कम करने में मदद मिली है, जो एक खुला स्रोत AAVS1-TALENS की जोड़ी, अलग IPSC हदबंदी अभिकर्मक, और, TALENS और दाता वैक्टर देने के लिए अलग अभिकर्मक डिवाइस का इस्तेमाल किया प्रयोग उच्च अभिकर्मक को प्राप्त करने और क्षमता को लक्षित करते हुए।

मानव IPSCs में उच्च दक्षता जीन संपादन को प्राप्त करने के लिए, यह पहली बार जीन ईडीआई के वितरण का अनुकूलन के लिए आवश्यक हैतीव्र कोशिका मृत्यु वितरण पद्धति संतुलन और जब ting अभिकर्मकों (डीएनए / आरएनए), अभिकर्मकों IPSCs के कारण। लक्ष्य कोशिका मृत्यु का एक यों ही निम्न स्तर को बनाए रखते हुए वितरण क्षमता को अधिकतम करने के लिए है। यह मानव IPSCs में दवा-चयन की मदद से> 50% मानव संसाधन दक्षता हासिल कर सकते हैं कि AAVS1-talen plasmids के बड़ी मात्रा में तैयार करने के लिए बहुत आसान है, यह talen प्लास्मिड से mRNAs बनाने के लिए आवश्यक नहीं है। वितरण की चुनौती इस मामले में ~ 10 KB है जो बड़े दाता प्लास्मिड से आता है। PMaxGFP एक ~ 3.5 KB छोटे प्लाज्मिड और किसी भी कोशिकाओं में वितरित करने के लिए बहुत आसान है, क्योंकि यह विशिष्ट मानव IPSC लाइनों के बजाय pMaxGFP अभिकर्मक किट में शामिल का उपयोग करने में प्रसव दक्षता परीक्षण करने के लिए AAVS1-कैग-EGFP दाता उपयोग करने के लिए सिफारिश की है। AAVS1-कैग-EGFP दाता AAVS1 ठिकाना में अलग ट्रांसजीन लक्षित करने के लिए चित्रा 1 ए में दिखाया गया प्रतिबंध एंजाइमों का उपयोग कर संशोधित किया जा सकता है। कैग-EGFP बदलने के लिए एक 6.4 केबी कैसेट में शामिल है, जो एक और 12 केबी दाता, हो गया हैएन समान अभिकर्मक और लक्ष्य दक्षता (नहीं दिखाया डेटा) प्राप्त करने के लिए सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया। सामान्य में, मानव IPSCs मुश्किल-transfect प्रकार की कोशिकाओं के बीच में हैं और GFP + कोशिकाओं का विश्लेषण प्रवाह cytometry द्वारा मापा के रूप में बड़े प्लास्मिड के लिए वितरण दक्षता 5-10% तक कम हो सकता है। सेल clumps प्रत्येक कोशिका में जीन संपादन अभिकर्मकों पहुंचाने का मौका कम हो जाएगा क्योंकि अभिकर्मक दक्षता के आगे अनुकूलन, एकल कक्षों में मानव IPSCs की उचित हदबंदी पर निर्भर है। इस प्रोटोकॉल एक सज्जन और तेजी से काम कर रहे सेल हदबंदी अभिकर्मक का उपयोग करता है, लेकिन अधिक से अधिक 10 मिनट के लिए IPSCs के इलाज की सिफारिश नहीं है। आमतौर पर IPSC संस्कृति कम से कम 80% मिला हुआ है, तो चरण 5.1, कोमल pipetting के साथ एकल कक्षों में IPSCs अलग कर देना करने के लिए आमतौर पर पर्याप्त पूर्व गर्म कोमल-सेल हदबंदी अभिकर्मक के साथ एक 5 मिनट ऊष्मायन बनाने के बाद। नहीं सभी कोशिकाओं के इलाज के 10 मिनट के बाद एकल कक्षों में अलग किया जा सकता है, तो सेल संस्कृति पर चुनाव है क्योंकिधाराप्रवाह या कालोनियों बहुत कॉम्पैक्ट बन जाते हैं, बस अधिक कुओं / प्लेटों से एकल कक्षों की सिफारिश की संख्या को इकट्ठा करने और पीछे कसकर जुड़ी कोशिकाओं को छोड़ दें। यांत्रिक बाल काटना एंजाइमी हदबंदी से कोशिकाओं के लिए अधिक हानिकारक है क्योंकि भारी pipetting सिफारिश नहीं है। (बीतने # 15 से पहले) जल्दी-बीतने IPSCs के साथ काम करना कोशिकाओं पहले से ही देर से पारित होने के IPSCs से अभिकर्मक तनाव को और अधिक संवेदनशील होते हैं, कोमल हदबंदी अभ्यास सेल अस्तित्व के लिए बहुत महत्वपूर्ण है। यह दोनों अभिकर्मक और सेल अस्तित्व में उच्च दक्षता प्राप्त करने के लिए मुश्किल है, उच्चतम अभिकर्मक दक्षता देता है कि अभ्यास के लिए चुनते हैं। अभिकर्मक के बाद, कोशिकाओं दवा चयन शुरू होता है जब 3 दिन में 50-80 confluency% तक पहुँच जाएगा कि घनत्व पर चढ़ाया जाना चाहिए। प्रत्येक IPSC लाइन अलग ढंग से बढ़ता है के बाद से, बाद अभिकर्मक चढ़ाना घनत्व प्रत्येक कोशिका लाइन के लिए अनुकूलित करने की आवश्यकता हो सकती है। एक उच्च चढ़ाना घनत्व DRU की प्रभावकारिता को कम कर देता है कि अधिक-confluency को जन्म दे सकती हैG-चयन, एक अति कम चढ़ाना घनत्व देरी वसूली और दवा प्रतिरोधी कालोनियों के विकास का कारण हो सकता है। आमतौर पर 3 लाख से शुरू होने IPSCs अस्तित्व और विशिष्ट IPSCs के विकास के आधार पर साढ़े करने के लिए 2 से 10 सेमी बर्तन में चढ़ाया जा करने के लिए पर्याप्त हैं। इसी तरह, आवश्यक हो सकता है untransfected कोशिकाओं में सबसे कम प्रभावी खुराक की स्थापना के लिए एक puromycin मार डालो वक्र, एक नव सृजित या रूप में अभी तक untested IPSC लाइन का उपयोग कर पैदा करने अगर; IPSC लाइनों puromycin चयन करने के लिए अपनी संवेदनशीलता में काफी भिन्न हो सकते हैं। वे दवा चयन के दौरान कुछ कोशिकी matrices के तुलना में बेहतर IPSC विकास का समर्थन करने के लिए दिखाई देते हैं क्योंकि MEFs चयन के लिए इस्तेमाल किया गया। अंगूठे का एक नियम है, मिलीलीटर चयन पूरा करने के लिए आवश्यक हैं 0.5 माइक्रोग्राम प्रति / पर एक माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / या 7 दिनों में puromycin के 5 दिनों की एक न्यूनतम के रूप में। अंत में, कॉलोनी उठा तकनीक दवा चयन के बाद सभी लक्षित कालोनियों की रक्षा के लिए महत्वपूर्ण है। कोमल pipetting या हदबंदी अभिकर्मक उपचार समान रूप से कई टुकड़ों में कालोनियों को तोड़ने में मदद करता हैनए कुएं में वितरित, और इसलिए कॉलोनी विस्तार तेज हो सकती है। एक हदबंदी अभिकर्मक का उपयोग कर चढ़ाना करने से पहले उठाया कालोनियों disaggregate करने के लिए, तो रातोंरात पर अगर छोड़ दिया अवशिष्ट हदबंदी अभिकर्मक हस्तांतरित कोशिकाओं को मार सकता है, क्योंकि यह पर्याप्त उपचार के बाद> 10x मध्यम के साथ पतला है सुनिश्चित करें। असली प्रयोगों से पहले उठा कॉलोनी का अभ्यास किया जाता है, जो तकनीक कोई फर्क नहीं पड़ता अत्यधिक प्रोत्साहित किया जाता है।

वर्णित रणनीति में काफी उठा, अंतर्जात PPP1R2C प्रमोटर के बंद पीएसी जीन की अभिव्यक्ति ड्राइव करने के लिए एक जीन-जाल विधि का इस्तेमाल 30 से अधिक कालोनियों आवश्यक साबित नहीं करना चाहिए। एसए -2 ए पीएसी चयन सैद्धांतिक रूप से यादृच्छिक एकीकरण केवल-कोशिकाओं को समाप्त जुड़ा हुआ है, लेकिन अतिरिक्त यादृच्छिक एकीकरण (एस) के सफल लक्षित एकीकरण असर IPSCs में हो सकता है। ज्यादातर मामलों में, दवा-चयनित क्लोन के लगभग 100% एकीकरण को लक्षित किया है और ~ उनमें से 10-40% अतिरिक्त यादृच्छिक integrati हैons है। > 50% डबल एलील लक्ष्यीकरण होती है जिसमें प्रयोगों हालांकि लक्षित क्लोन के बहुमत, एकल एलील लक्ष्य-निर्धारण हो जाते हैं। अतिरिक्त यादृच्छिक एकीकरण के चर आवृत्ति, साथ ही डबल एलील लक्ष्यीकरण बनाम एकल के अनुपात को नियंत्रित करने के लिए मुश्किल है। इसलिए, ~ 20 कालोनियों उठा-केवल लक्ष्यीकरण क्लोन प्राप्त किया जा सकता एकल या डबल एलील सुनिश्चित करने के लिए सिफारिश की है। असफल लक्ष्यीकरण प्रयोगों, लक्ष्य कोशिकाओं 'transfectability, अस्तित्व, और विकास दर के फिर से आकलन के प्रकाश में, विशेष सेल लाइन में न्युक्लिअसिज़ की प्रभावकारिता, और दाता और nuclease तैयारी की गुणवत्ता में अत्यधिक से पहले की सिफारिश की है प्रयोग फिर से प्रयास में अपनी संपूर्णता में।

यह इसी तरह के जीन-जाल दाता रणनीतियों अन्य सक्रिय जीन लक्षित करने के लिए प्रयोग किया जाता है, लेकिन चयन जीन अभिव्यक्ति ड्राइव करने के लिए एक स्वतंत्र प्रमोटर की आवश्यकता है जो चुप जीन लक्ष्यीकरण के लिए उपयुक्त नहीं है किया जा सकता है कि ध्यान दिया जाना चाहिए। इसके अलावा, वें जबकिई AAVS1 सुरक्षित बंदरगाह खुला chromatin संरचना है माना जाता है, यह किसी भी transgene इस ठिकाना पर दृढ़ता से व्यक्त किया जा सकता है कि गारंटी नहीं है। दरअसल, हमारी ताजा रिपोर्ट में कई कमजोर प्रमोटरों AAVS1 ठिकाना 14 पर लक्षित एकीकरण के बाद से detectable फ्लोरोसेंट रिपोर्टर जीन अभिव्यक्ति ड्राइव करने में असमर्थ थे कि पता चला है।

इस प्रोटोकॉल मानव जीनोम में एक अच्छी तरह से अध्ययन सुरक्षित बंदरगाह ठिकाना लक्षित करने के लिए अच्छी तरह से मान्य TALENS का उपयोग करने पर केंद्रित है। तकनीक अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है और किसी भी transgene से जुड़े कई आवेदन करने के लिए आसानी से निभा रहे हैं। यादृच्छिक एकीकरण का उपयोग कर जीनोम इंजीनियरिंग के तरीकों की तुलना में, लक्षित कर AAVS1-talen मध्यस्थता जीन अत्यधिक कुशल और विशिष्ट है, और IPSCs के मामले में, विस्तार करने और किसी भी मानव कोशिका प्रकार में अंतर करने की क्षमता है कि stably फ्लोरोसेंट कोशिकाओं में परिणाम है। इस प्रोटोकॉल डिजाइन और डिजाइनर न्युक्लिअसिज़ के सत्यापन या पी के लिए लक्षित IPSC कालोनियों के आकलन का वर्णन नहीं करता हैनट कैसेट एकीकरण और बंद लक्ष्य विश्लेषण, कई उत्कृष्ट प्रोटोकॉल विस्तार 16-18 में कार्यप्रणाली के इन पहलुओं का वर्णन किया है। E8 माध्यम का उपयोग कर फीडर से मुक्त IPSC संस्कृति और passaging तकनीक भी पिछले प्रकाशन 19 में विवरण में वर्णित हैं। ऊपर प्रोटोकॉल, मानव IPSCs की AAVS1 सुरक्षित बंदरगाह में जीन इसके लिए अनुकूलित है, जबकि किसी भी प्रकार की कोशिका में एक मुताबिक़ पुनर्संयोजन दाता का उपयोग कर साइट विशेष nuclease की मध्यस्थता जीन संपादन / इसके अलावा जुड़े प्रयोगों के लिए एक सामान्य टेम्पलेट के रूप में सेवा कर सकते हैं।

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Disclosures

लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषणा।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, *LDEV-Free, 10 ml Corning 354230 Store at -20 °C.
DMEM/F-12 Life Technologies 11320-033 Store at 4 °C.
Costar 6 Well Clear TC-Treated Multiple Well Plates Corning 3506
Essential 8 Medium Life Technologies A1517001 Store basal medium at 4 °C. Store supplement at -20 °C.
Y-27632 dihydrochloride Tocris 1254 Store at room temp. Once dissolved in H2O, store at -20 °C.
Sodium Chloride Sigma S5886-500G
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 Life Technologies 15575-020
DPBS, no calcium, no magnesium Life Technologies 14190-250
100 mm TC-Treated Culture Dish Corning 430167
DR4 MEF 2M IRR - Academic GlobalStem GSC-6204G Store in liquid Nitrogen.
DMEM, high glucose, pyruvate Life Technologies 11995-040 Store at 4 °C.
Defined Fetal Bovine Serum, US Origin HyClone SH30070.03 Store at -20 °C. Thaw at 4 °C overnight and aliquot. Store aliquots at -20 °C until needed.
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) Life Technologies 11140-050 Store at 4 °C.
4D-Nucleofector Core unit  Lonza AAF-1001B part of the electroporation system
4D-Nucleofector X unit  Lonza AAF-1001X part of the electroporation system
P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit L (24 RCT) Lonza V4XP-3024 Upon arrival, remove Primary Cell Solution and supplement and store at 4 °C.
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent Life Technologies A1110501 Store at -20 °C. Thaw overnight at 4°C and warm an aliquot in a 37 °C water bath before use.
NutriStem XF/FF Culture Medium Stemgent 01-0005 Store at -20 °C. Thaw overnight at 4 °C
AAVS1 TALENs (pZT-AAVS1-L1 and pZT-AAVS1-R1) Addgene 52637 and 52638
Name Company Catalog Number Comments
AAVS1-CAG-EGFP Homologous Recombination donor Addgene 22212
Puromycin Dihydrochloride Life Technologies A11138-03 Store at -20 °C. Prepare working aliquots of 1 mg/ml in ddH2O.
Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipets Fisher Scientific 13-678-20A
Sorvall Legend XTR (Refrigerated), 120 V 60 Hz Thermo Scientific 75-004-521
TX-750 4 × 750 ml Swinging Bucket Rotor Thermo Scientific 75003607
Trypan Blue Solution, 0.4% Life Technologies 15250-061

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References

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विकास जीवविज्ञान अंक 96 प्रेरित स्टेम सेल जीन संपादन AAVS1 talen GFP
अभिकर्मक, चयन, और मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल की कालोनी उठा AAVS1 सुरक्षित हार्बर में एक GFP जीन के साथ talen-लक्षित
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Cerbini, T., Luo, Y., Rao, M. S.,… More

Cerbini, T., Luo, Y., Rao, M. S., Zou, J. Transfection, Selection, and Colony-picking of Human Induced Pluripotent Stem Cells TALEN-targeted with a GFP Gene into the AAVS1 Safe Harbor. J. Vis. Exp. (96), e52504, doi:10.3791/52504 (2015).

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