Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Transfeksjon, merking og koloni-plukking av menneskeskapte Pluripotent stamceller TALEN målrettet med en GFP Gene inn i AAVS1 Safe Harbor

Published: February 1, 2015 doi: 10.3791/52504
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1National Institute of Arthritis, Musculoskeletal and Skin Diseases, National Institutes of Health, 2Q Therapeutics

Introduction

Muligheten til å omprogrammere menneskelige somatiske celler til embryonale stamcelleliknende induserte pluripotente stamceller (iPSCs) ble først oppdaget av Takahashi et al. I 2007 1. Menneske dermale fibroblaster transdusert med retrovirus uttrykker fire transkripsjonsfaktorer (Den såkalte kalt Yamanaka faktorer Oct3 / 4, Sox2, c-Myc, og Klf4) ble vist å være meget lik den humane embryonale stamceller (hESCs) basert på morfologi, proliferasjon, genekspresjon, og epigenetisk status; avgjørende, iPSCs er også i stand til å differensiere til cellene i alle tre bakterie lag 1. Den proliferativ potensial og differensiering kapasitet på iPSCs gjør dem svært attraktive verktøy; ved å omprogrammere celler fra pasienter som lider av bestemte sykdommer, kan iPSCs brukes både som in vitro sykdom modellsystemer, og som potensielle terapeutiske midler.

For sistnevnte formål, må flere problemer løses før det fulle potensialet av iPSCsi en klinisk setting kan realiseres; den karsinogent potensial av in vitro dyrkede hESCs og iPSCs, bruk av xenogene derivater under omprogrammering og celle vedlikehold, og behovet for å spore transplanterte celler in vivo er alle viktige hekk til den kliniske anvendelse av pluripotente stamceller (gjennomgått av Hentze et al. 2). En ideell løsning på behovet for sporing differensierte celler etter transplantasjon ville innebære et visuelt påvisbar markør som motstår stanse og vekslande uavhengig av søknaden. Robust og varig uttrykk for integrerte transgener er mest lett oppnåelig når eksogene DNA er innført i safe-havn loci; som er, genomiske områder som muliggjør tilstrekkelig transkripsjon av en integrert vektor, mens på samme tid begrensende perturbasjoner av ekspresjon i nabogener 3. Et slikt område som har blitt svært godt karakterisert siden oppdagelsen er adenoassosiert virus integrasjon for 1. (AAVS1), i det første intron av proteinfosfatase en regulatorisk subenhet 12C (PPP1R12C) genet. Dette locus har vist seg ikke bare å tillate vedvarende og robust ekspresjon av integrerte transgener gjennom lengre tid i kultur og in vitro differensiering 3, men også for å beskytte omgivelsene gener fra transkripsjons perturbasjon 4; begge funksjonene er tenkt å være på grunn av tilstedeværelsen av endogene kromatin isolator elementer flankerer AAVS1 nettstedet fem.

Fremskritt innen genom engineering verktøy enn bare det siste tiåret har i stor grad forenklet letthet og effektivitet som genetiske manipulasjoner i alle celletype kan oppnås. Mens tidligere vellykkede forsøk avhengig av overmåte lave nivåer av endogen homolog rekombinasjon (HR) med en innført donor for å oppnå genet styring i ESCs 6,7, ved bruk av stedspesifikke nukleaser, slik som sinkfinger nukleaser (ZFNs), som signifikantficantly indusere homolog rekombinasjon gjennom generering av en dobbel-strandet DNA pause har betydelig økt effektivitet av slike eksperimenter 8,9. Den gjenbruk av både transkripsjons aktivator lignende effektorer (Tales) av plante patogene xanthomonasgummi slekter og de ​​prokaryote gruppert regelmessig avbrutt av korte palindromiske gjentar (CRISPR) / Cas9 systemet til effektive stedsspesifikke designer nukleaser har gjort genet målretting i pluripotente stamceller en tilgjengelig og praktisk metodikk 10-13.

En nyere artikkel beskrev en effektiv metode for stabil integrering av et grønt fluorescerende reporter kassetten inn i AAVS1 trygg-havn locus i menneskelige iPSCs bruker Tale nukleaser (Talens) 14. Disse målrettede iPSCs opprettholdt sin fluorescens selv etter rettet differensiering til kardiomyocytter og transplantasjon i en musemodell for hjerteinfarkt (MI), som gir sterke bevis for nytten av slikestabilt fluorescerende pluripotente stamceller 14. For å oppnå målrettet kolonier, ble et gen-felle metode anvendes hvori en spleising-akseptor (SA), plasserer 2A selv spalte peptidsekvens puromycin N-acetyl-transferase (PAC) genet under kontroll av den endogene promoter PPP1R12C; dermed bare iPSCs som har innarbeidet DNA donor ved AAVS1 locus uttrykke PAC, gjør dem valgbar basert på puromycin-motstand; (Figur 1, 15). Denne protokollen detaljer prosedyrene for å generere AAVS1-GFP iPSCs rapportert i den siste papir 14, herunder prosessen med å trans iPSCs med Talens og en 9.8 kb donor for å integrere en 4.2kb DNA fragment inn i AAVS1 trygg-havn locus, velge iPSCs basert på puromycin-motstand, og plukke kolonier for klonal ekspansjon. De teknikker som er beskrevet her, kan anvendes på mange tekniske genom eksperimenter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Utarbeidelse av Basement Membran Matrix og Coating av Plast

  1. Plasser den frosne basalmembran matriselager fra -20 ° C på is og tine over natten ved 4 ° C.
  2. Etter tining pipette 2 mg alikvoter av basalmembranmatrise inn i pre-avkjølte Eppendorf rør. Lagre disse ved -20 ° C inntil nødvendig.
  3. Å forberede basalmembran matrix-belagte plater, tine en delmengde på is inntil den siste biten av is i eppendorf tube forsvinner (vanligvis innen ~ 2 timer).
  4. Etter tining legge basalmembran matrisen til 12 ml kald (4 ° C) DMEM / F12 for å gjøre basalmembran matrisebeleggsløsning.
  5. Legg basalmembran matriseoppløsningen til den aktuelle kultur fartøyet. For en 6-brønns plate, dispensere 1 ml per brønn. Virvle plate for å sørge for at kjelleren membran matrise Løsningen dekker helt hver brønn.
  6. Parafilm forsegle kjelleren membran matrise-belagt plate / fatet, og inkuber ved room temperatur i 1 time før bruk. Alternativt butikken basalmembran matrix-belagte plater / retter på 4 ° C og bruk innen 2 uker etter belegg.
    MERK: Legg ekstra DMEM / F12 til kjelleren membran matrise-belagt plate / fatet for å hindre uttørking. Før du bruker 4 ° C lagret basalmembran matrix-belagt plate / tallerken, legg den i et biologisk sikkerhetskabinett og la det komme til romtemperatur i minst 30 min.
  7. Sug av basalmembranmassen fullstendig før tilsetning av medium og celler.

2. Utarbeidelse av E8 medium

  1. Forberede E8 dyrkingsmedium ved tining E8 supplement natten ved 4 ° C.
  2. Fjern 10 ml E8 basal medium fra 500 ml lager og kast.
  3. Pipette hele 10 ml hetteglass med E8 supplement direkte inn 490 ml E8 basal medium. Ikke varm komplett E8 medium i en 37 ° C vannbad, som gjentatte temperatursvingninger kan degradere bFGF i complete E8 medium.
  4. Bruk komplett E8 medium innen 2 uker tillegg av supplement.

3. Tining av iPSCs

  1. Fjern et hetteglass med frosne iPSCs fra flytende nitrogen og sted på tørris.
  2. Hurtig tines ampullen i et 37 ° C vannbad; hetteglasset i vannbad til bare en liten fragment av is restene.
  3. Spray ampulle med 70% etanol, og overføring til et biologisk trygghetskabinett.
  4. Tilsett 1 ml romtemperatur E8 medium dråpevis til glasset.
  5. Ved hjelp av en 2 ml pipette, overføre cellesuspensjonen tilsatt til 9 ml av E8 medium i et 15 ml konisk rør. Virvle røret ofte for å sikre at celler og medium bland godt raskt.
  6. Sentrifuger cellene ved 200 x g i 5 min.
  7. Aspirere supernatanten, og cellepelleten suspenderes i et passende volum av E8 supplert med 10 uM Y-27632.
  8. Tilsett celler til et passende antall kjelleren membrane matrise brønnene som er dekket, og plasser i en 37 ° C, 5% CO 2 inkubator over natten. Det anbefales å plate minst 0,2 x 10 6 IPSC per brønn av en seks-brønns plate for å muliggjøre rask gjenoppretting etter tining.

4. Vedlikehold og regelmessig aging av iPSCs

  1. Oppdatere E8 medium daglig.
  2. Overvåke morfologi og sammenflyting av celler med et invertert mikroskop. iPSCs av høy kvalitet vokse i flate kolonier med tydelige grenser; individuelle kolonier besitter en "brostein-aktig" utseende.
  3. Passage de iPSCs cellene når de kommer ~ 70% confluency.
  4. Forberede en EDTA aging løsning ved å legge 0,9 g NaCl og 500 mL 0,5 M EDTA til 500 ml DPBS. Bland godt å oppløse NaCl, og vakuum filter for å sterilisere. Varm en delmengde av aging løsning i et 37 ° C vannbad før aging.
  5. Til passasjen, aspireres brukt kulturmedium, og cellene vaskes en gang med et likt volum varm passamarbeidsinfrastrukturen løsning. Aspirer og pipette nok EDTA aging løsnings å belegge cellene (1 ml pr brønn i en 6-brønn plate).
  6. Plassere celler under en invertert mikroskop og observere IPSC kolonier. Utseendet av hull i kolonier og opphøyde kanter bør være åpenbare i løpet av 2 til 5 min.
  7. Aspirere nøye EDTA aging løsning.
  8. Ved hjelp av en 10 ml pipette, dispensere 4 ml E8 medium (ved bruk av en 6-brønn plate) under høyt trykk direkte inn i hver brønn som skal passeres.
  9. Samle IPSC klumper, og delt opp i et passende antall brønner, avhengig av deleforhold fra 1: 8 til 1:12. Ikke over-pipette, som disaggregering av celleklumper vil føre til dårlig levedyktighet.
  10. Sett platen i en inkubator, og rocke plate back-og-tilbake og side-til-side flere ganger for å spre cellene.

5. Utarbeidelse av MEFs og iPSCs for Tansfection

  1. 48 timer før transfection, passage iPSCs på ~ 1: 6 i fire eller flere brønner på en basalmembran matrise-belagt seks-brønns plate, slik at de vil være 70% konfluent to dager frem i tid.
  2. Den neste dagen, tine DR4 MEFs i MEF medium bestående av DMEM (høy glukose) supplert med 10% FBS og 1 x MEM-NEAA.
  3. Plate DR4 MEFs i to 10 cm skåler på ~ 2 x 10 4 celler / cm2 og inkubert over natten ved 37 ° C.
  4. På dagen for transfeksjon, endrer MEF medium til E8 supplert med 10 uM Y-27632 30 min før det utføres transfeksjon på iPSCs.
  5. Valgfritt: Hvis strømningscytometrisk analyse av iPSCs post-transfeksjon er ønsket, fjerne en basalmembran matrise lakkert plate fra 4 ° C og sted ved romtemperatur.
  6. Valgfritt: 4 timer før transfeksjon, supplere pre-transfeksjon IPSC kultur med Y-27632 ved sluttkonsentrasjon på 10 uM.

6. Lett-celle Dissosiasjon Reagens Treatment ennd Transfeksjon av iPSCs bruker en Electroporation System

  1. Fjern P3 primære celle transfeksjon løsning fra 4 ° C, og la den komme til romtemperatur i ca. 30 min. Tilsett 100 ul hele supplement til transfeksjon løsning før bruk.
  2. Varm lett-celledissosiasjon reagens i et 37 ° C vannbad.
  3. Skaff AAVS1 Talens (PZT-AAVS1-L1 og PZT-AAVS1-R1) og AAVS1-CAG-EGFP donor fra -20 ° C.
  4. Fjern iPSCs fra inkubatoren og vaske en gang med DPBS.
  5. Tilsett 1 ml av milde-celledissosiasjon reagens per brønn og inkuber iPSCs ved 37 ° C i 5 minutter, eller inntil mer enn 50% av cellene er dissosiert fra kulturbeholderen.
  6. Pipette cellene opp og ned et par ganger med en P1000 pipette å distansere eventuelle gjenværende celler fra kultur fartøy, og å bryte opp IPSC klumper.
  7. Tilsett 2 ml E8 medium til hver brønn, og pipette opp og ned flere ganger med en 10 ml pipette til Fürther disaggregert celleklumper i enkeltceller
    MERK: Transfeksjon effektivitet avtar betraktelig hvis celleklumper er ikke tilstrekkelig disaggregert.
  8. Samle iPSCs i et 15 ml konisk rør og sentrifuger ved 100 x g i 3 min.
  9. Aspirer supernatanten og resuspender cellene i en minimal mengde av E8 medium.
  10. Tell cellene ved hjelp av et hemocytometer etter påføring av en vital flekk slik som 0,4% trypanblått. Sørg for at cellene er tilstrekkelig dissosiert mens du teller (1-3 celler per "klump").
  11. Dispensere 3 x 10 6 celler i hver av to 15 ml koniske rør, og spinne ned igjen ved 100 x g i 3 min.
    MERK: lavhastighetssentrifugering reduserer stress i cellene og gir enkel re-suspensjon av iPSCs før elektroporering.
  12. Still elektroporering systemet til den celletypen bestemt program for den humane embryonisk stamcellelinje H9 (Program CB-150).
  13. Etter sentrifugering, supernatanten aspireres fra cell pellets. Til en pellet, tilsett 10 mikrogram av HR donor som kontrollprøve. Til den andre pellet tilsett 10 mikrogram av den HR-donor, sammen med 5 pg av hver TALEN (PZT-AAVS1-L1 og PZT-AAVS1-R1) som forsøksprøve.
  14. Resuspender hver cellepelleten i 100 ul av P3 primære celle transfeksjon løsning, og overføre til en kyvette.
  15. Utfør transfeksjon og umiddelbart legge 500 mL av romtemperatur E8 medium til hver kyvette.
  16. Overfør transfektert iPSCs dråpevis til en 10-cm tallerken inneholder DR4 MEFs utarbeidet i trinn 5.4.
  17. Valgfritt: Legg flere dråper fra hver eksperiment i en brønn i en kjeller membran matrise-belagt seks-brønns plate hvis flowcytometri anaylsis av transfeksjonseffektivitet er ønsket.
  18. Gjenta trinn 06.15 til 06.17 for å fullføre begge prøvene. Dagen etter, vaske celler med DPBS to ganger og bytte kultur medium til NutriStem, som ser ut til å støtte IPSC kultur på matere bedre enn E8.
  19. Transient EGFP uttrykk topper på 48 til 72 timer etter transfeksjon; vurdere transfeksjonseffektivitet som ønsket.

7. Puromycin Utvalg av målrettet iPSCs

  1. Begynn puromycin utvalg 72 timer etter transfeksjon når iPSCs nå 70% confluency.
  2. For NCRM5 iPSCs, begynner puromycin utvalg på 0,5 mikrogram / ml puromycin (1/2 full dose) fortynnet i NutriStem dyrkingsmedium. Den optimale puromycin konsentrasjonen kan variere 0,25 til 1 pg / MLL for noen IPSC linjer.
  3. Kultur iPSCs i NutriStem + 0,5 mikrogram / ml puromycin for 3 dager, forfriskende mediet daglig.
  4. Etter 3 dager, øke konsentrasjonen av puromycin til 1 pg / ml.
  5. Kultur iPSCs under 1 mikrogram / ml puromycin utvalg i ytterligere 7 til 8 dager, eller inntil distinkte kolonier vises stor nok for koloni plukking.

8. Colony Plukke og utvide av Målrettede iPSCs

  1. Bruk basalmembranmatrise for å belegge en 96-brønners plate ved å dispensere 50 pl basalmembran matrisebelegg oppløsning (2 mg basalmembranmassen fortynnet i 12 ml DMEM / F12) i hver brønn. Oppbevar plate ved 4 ° C over natten før bruk.
  2. Etter at basalmembran matrise lakkert plate for å komme til romtemperatur, aspirere basalmembranen matriks dispensere og 100 ul E8 supplert med 10 uM Y-27632 i hver brønn.
  3. Plassere en invertert mikroskop til et biologisk sikkerhetskabinett, og spray lett med 70% EtOH å sterilisere.
  4. Trekk et glass Pasteur pipette over en gassbrenner for å få en ideell koloni-plukking verktøy som har en liten "krok" på spissen. Sterilisere med 70% EtOH, og plasser i panseret for å tørke.
  5. Fjern fatet inneholder målrettede IPSC kolonier fra inkubatoren, og fyll i panseret under mikroskopet.
  6. Plukk iPSCs ved å spore en sirkel rundt kolonien grensen til kolonien-plukking verktøy.
  7. Bruk av "krok" av kolonien-dirkeverktøy til forsiktig å skrape og fjerne IPSC koloni fra overflaten av platen. For større kolonier, tegning en X med koloni-plukking verktøy til kvartal kolonien vil lette cellevekst etter re-plating.
  8. Når celleklumper er frittliggende og fritt flytende, må du bruke en P200 pipette satt til ~ 30 mL å samle iPSCs. Plate-celler direkte inn i 96-brønns plate.
  9. Valgfritt: Bruk en p20 pipette satt til ~ 5 mL å samle iPSCs inn en eppendorf tube, deretter legge til 50 mL milde-celle dissosiasjon reagens å fordøye for 5 min ved 37 ° C. Etter fordøyelse, tilsett 500 ul E8 medium inn i Eppendorf-rør for å fortynne den milde-celledissosiasjon reagens og spinne ned cellene ved 200 x g i en vanlig bordmikrosentrifuge i 5 min. Deretter aspireres meste av mediet og la ~ 30 pl for å resuspendere og overføre cellene til 96-brønners plate.
    MERK: Dettetilnærming vil lette dissosiasjon av cellen klump og rask utvidelse av plukket koloni.
  10. Fortsett koloni plukking inntil et tilstrekkelig antall IPSC kolonier har blitt samlet (omtrent 20-30 kolonier per eksperiment anbefales).
  11. Etter koloni plukking, plasserer 96-brønns plate i en inkubator over natten. Oppdatere med komplett E8 medium neste dag, og kulturen til ~ 70% sammenflytende.
  12. Passasje celler fra 96-brønners i en 24-brønners, deretter inn i en 6-brønn, som beskrevet i trinn 4.5 til 4.10.
    MERK: volumene av EDTA løsning og E8 medium bør forholdsmessig redusert ved bruk av brønner mindre enn en seks-brønns plate.
  13. Vurdere målretting suksess ved krysset PCR og Southern blot-analyse for å bekrefte målrettet kassett integrering og fravær av tilfeldig satt vektorer 16.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

A visualisering av protokollen er gitt i figur 2, med perioder der iPSCs dyrkes i forskjellige medium markert ved enten grønt eller blått for E8 for NutriStem. Det er viktig å transfektere bare kvalitets iPSCs; undersøke kultur retter gjennom rutinemessig vedlikehold og verifisere at IPSC kulturer inneholder hovedsakelig distinkte kolonier bærer en brostein lignende morfologi (figur 3A); differensierte cellene bør ikke oppta mer enn 10% av kulturen. Transfectability av iPSCs vurderes og optimalisert ved hjelp av den lille Pmax-GFP vektor (Figur 4A-B), som transfeksjon med Pmax-GFP vanligvis representerer den maksimale oppnåe effektivitet på grunn av sin lille størrelse. For eksempel, oppnådde vi 68,6% transfeksjonseffektivitet med Pmax-GFP (Figur 4B). Å målrette AAVS1 trygg-havn, er iPSCs passaged bruke en mild encellet dissosiasjon reagens og blir tilført med AAVS1-Talens og AAVS1-CAG-EGFP (plasmider avbildet i figur 1A). Transfekterte iPSCs blir deretter belagt på en passende tetthet av DR4 MEFs (figur 3B). Transient ekspresjon av AAVS1-CAG-EGFP topper ved 48 til 72 timer etter transfeksjon (figur 3C); hvis ønskelig, kan en liten del av transfekterte iPSCs bli FACS analysert. NCRM5 iPSCs kan transfektert med effektiviteten i 60,9% bruker AAVS1-CAG-EGFP donor (Figur 4C). Transfeksjonseffektivitet kan variere sterkt; for eksperimenter hvori GFP + fraksjonen er til og med så lav som 10%, fortsette å puromycin valg. Etter å ha utført puromycin utvalg, bør individuelle kloner viser uniform fluorescens være stor nok for koloni plukking (Figur 3D). Å plukke kloner, er en egnet koloni under liten forstørrelse (figur 3E), og isoleres ved første tracing og partere den (fig 3F-G). De partert koloniene blir deretter forsiktig skraped fra kulturkaret (figur 3 H). Ved hjelp av en pipette P200, celleklumper blir deretter overført til en brønn av en basalmembran matriks-belagte 96-brønns plate. iPSCs bør legge innen 2-4 timer med plating (figur 3I). Hvis vedlegget ikke er observert i løpet av 24 timer, Basement membran matrise-belegg eller Y-27632 behandling var sannsynligvis sub-optimal; Basalmembran matrix-frakk en ny 96-brønns plate og forberede frisk E8 + 10 mm Y-27632 før du plukker noen flere kolonier. En gang i en 96-brønners format, målrettet IPSC kloner blir utvidet og bør oppvise en stabil og ensartet ekspresjon av GFP (Figurene 4D-E).

Figur 1
Figur 1: Gene målretting vektorer og målretting skjematisk. (A) Representasjoner av AAVS1-CAG-EGFP, og PZT-AAVS1-L1 / R1 Talens plasmider brukt i denne studien. Den SA-2A element i AAVS1-CAG-EGFP plasmid representerer spleise-akseptor og 2A selv-spaltning av peptidet brukes til å begrense puromycin N-acetyl-transferase (PAC) genekspresjon i målrettet-integrasjonshendelser. Kyllingen β-aktin globin (CAG) promoter blir brukt til å drive ekspresjon av EGFP. (B) AAVS1 safe-havn, inneholdt i en Intron av PPP1R12C genet, er rettet ved hjelp av TALENS for å generere en dobbeltkjedet DNA-brudd. Dette aktiverer homolog rekombinasjon (HR) reparasjon maskiner, som deretter bruker de AAVS1-CAG-EGFP donor (peiling homologidomene armene flankerer kutt området) som substrat for reparasjon. Kassetten er integrert og PAC-genet er plassert under kontroll av den endogene promoter PPP1R12C.

Figur 2
Figur 2. Tidslinje av genet targeting eksperiment. IPSCs dyrkestil 70% konfluens og passaged ~ 1: 6 på dag -2 (d-2). MEFs er belagt på d-en, og iPSCs samles og transfektert ved d0. Ved d1 blir mediet byttet til NutriStem, og iPSCs er dyrket i to dager til før puromycin tilsettes til mediet ved d3. Kolonier er vanligvis klar for plukking av D12. Perioder hvor iPSCs er dyrket i E8 medium er uthevet med grønt, mens perioder med NutriStem kultur er i blått.

Figur 3
Figur 3: IPSC genet targeting representative bilder (A) Fase bilde av høy kvalitet iPSCs.. Legg merke til fase-lys grensen og brostein lignende morfologi. (B) DR4 MEFs belagt på 2 x 10 4 celler / cm 2 tjuefire timer etter tining. (C) Sytti-to timer etter transfeksjon, EGFP + celler er klart synlig sett under et fluorescens microscope. (D) Etter puromycin-basert seleksjon for ~ 14 dager, kolonier som viser uniform GFP fluorescens er store nok til å bli plukket. (EH) Representative bilder av kolonien rørt prosessen. Kolonier plukket bruker en trakk Pasteur pipette, først ved å skissere kolonien, og deretter ved å partere det å få mindre celleklumper. (I) Plukket IPSC kolonier feste til kjelleren membran matrise-belagt overflate av 96-brønns plate innen to til 4 t. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4: FACS-analyse av transfeksjonseffektivitet og klonale målrettede iPSCs. (A) Kontroll NCRM5 iPSCs uten transfeksjon av noen plasmid. (B) NCRM5iPSCs transfektert med mindre testvektor pMAX-GFP er FACS analysert for GFP uttrykk. (C) Transient ekspresjon av AAVS1-CAG-EGFP plasmid bestemmes ved FACS. (D) En NCRM5-AAVS1-CAG-EGFP klone viser jevnt positiv EGFP uttrykk som analyseres ved FACS. Oppmerksom på den stramme clustering av analyserte iPSCs i forhold til C). (E) Fluorescens bilde av en utvidet NCRM5-AAVS1-CAG-EGFP målrettet klone.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De mest kritiske trinn for vellykket generasjon AAVS1 trygg-havn målrettet menneskelige iPSCs er: (1) effektivt levere Talen og giver plasmider inn iPSCs etter transfeksjon; (2) å optimalisere dissosiasjon av iPSCs i enkeltceller før transfeksjon og plating tettheten etter transfeksjon; (3) å optimalisere dosen og tidspunktet for medikament-seleksjon basert på veksten av IPSC linje; (4) nøye dissekere og plukke målrettede kolonier og overføring til ny plate / brønn. Sammenlignet med lignende metoder som brukes i Hockemeyer papir 10, denne protokollen brukt et par av open-source AAVS1-Talens, annerledes IPSC dissosiasjon reagens, og annerledes transfeksjon enhet for å levere Talens og donor vektorer, som bidro til å redusere antall iPSCs brukt i eksperiment samtidig oppnå høy transfeksjon og målretting effektivitet.

For å oppnå høy effektivitet genet redigering i menneskelige iPSCs, er det viktig å først optimalisere levering av genet ediskaps reagenser (DNA / RNA), mens balansere den akutte celledød leveringsmåte og reagenser føre til iPSCs. Målet er å maksimere leveringsdyktighet og samtidig opprettholde et noenlunde lavt nivå av celledød. Siden det er veldig lett å tilberede store mengder AAVS1-Talen plasmider som kan oppnå> 50% HR effektivitet ved hjelp av narkotika-utvalget i menneskelige iPSCs, er det ikke nødvendig å gjøre mRNA fra Talen plasmider. Utfordringen for levering kommer fra store giver plasmider, som i dette tilfellet er ~ 10 kb. Det anbefales å bruke AAVS1-CAG-EGFP donor for å teste levering effektivitet i spesifikke menneskelige IPSC linjer i stedet for å bruke pMaxGFP inkludert i transfeksjon kit, fordi pMaxGFP er en ~ 3,5 kb liten plasmid og svært enkelt å levere inn noen celler. AAVS1-CAG-EGFP donor kan modifiseres ved hjelp av restriksjonsenzymer som vist i Figur 1A å målrette forskjellige transgener i AAVS1 locus. En annen 12 kb donor, som inneholder en 6,4 kb kassett som erstatter CAG-EGFP, har væreno brukt med suksess for å oppnå lik transfeksjon og målretting effektivitet (data ikke vist). Generelt humane iPSCs er blant de som er vanskelige å transfeksjon av celletyper og leveringseffektiviteten for store plasmider kan være så lav som 5 til 10% som målt ved strømningscytometri-analyse av GFP + celler. Ytterligere optimalisering av transfeksjonseffektiviteten er avhengig av den riktige dissosiasjon av humane iPSCs til enkeltceller, fordi celleklumper vil redusere sjansen for å levere gen redigerings reagenser inn i hver celle. Denne protokollen bruker en skånsom og rask arbeidende celledissosiasjon reagent, men behandle iPSCs for mer enn 10 minutter er ikke anbefalt. Vanligvis IPSC kultur er mindre enn 80% sammenflytende hvis følgende trinn 5.1, slik at en 5 minutters inkubasjon med forvarmet skånsom-celledissosiasjon reagens vanligvis tilstrekkelig til å dissosiere iPSCs inn i enkeltceller med forsiktig pipettering. Hvis ikke alle cellene kan bli dissosiert til enkeltceller etter 10 minutter av behandlingen, fordi cellekultur er over-conflytende eller koloniene blir veldig kompakt, bare samle anbefalt antall enkeltceller fra flere brønner / plater og la de tett knyttet celler bak. Heavy pipettering anbefales ikke fordi mekanisk klipping er mer skadelig for cellene enn enzymatisk dissosiasjon. Når du arbeider med tidlig-passasje iPSCs (før passering # 15), er skånsom dissosiasjon praksis svært viktig for celle overlevelse fordi cellene er allerede mer følsomme for transfeksjon stress enn sene passasje iPSCs. Dersom det er vanskelig å oppnå høy effektivitet både transfeksjon og celleoverlevelse, velger den praksis som gir høy transfeksjonseffektivitet. Etter transfeksjon, bør cellene platet med en tetthet som vil nå 50-80% konfluens på dag 3 når medikamentseleksjon starter. Siden hver IPSC linje vokser annerledes, kanskje den post-transfeksjon plating tettheten må være optimalisert for hver cellelinje. En høy pletteringstetthet kan føre til over-konfluens som reduserer effekten av Drusg-utvalget, mens en ekstrem lav plating tettheten kan føre til forsinket utvinning og vekst av resistente kolonier. Vanligvis 3000000 utgangs iPSCs er nok til å bli belagt i? Til to 10 cm skåler avhengig av overlevelse og vekst av bestemte iPSCs. Tilsvarende, hvis du bruker en nylig generert eller som ennå uprøvd IPSC linje, genererer en puromycin kill kurve for å etablere den laveste effektive dose i utransfekterte celler kan være nødvendig; IPSC linjer kan variere betydelig i deres følsomhet for puromycin utvalg. De MEFs ble brukt for utvalget fordi de ser ut til å støtte IPSC vekst bedre enn noen ekstracellulære matriser under narkotika utvalg. Som en tommelfingerregel, et minimum av fem dager med puromycin ved 1 pg / ml eller 7 dager på 0,5 mikrogram / ml for å fullføre valget. Endelig er koloni-plukking teknikk avgjørende å bevare alle de målrettede kolonier etter narkotika utvalg. Forsiktig pipettering eller dissosiasjon reagent behandling bidrar til å bryte koloniene i mange biter jevntfordelt i den nye brønnen, og derfor kan fremskynde koloni ekspansjon. Hvis du bruker en dissosiasjon reagens til disaggregert de plukket kolonier før plating, sørg for at det er tilstrekkelig fortynnet med> 10x medium etter behandling, fordi rest dissosiasjon reagens kunne drepe de overførte cellene hvis igjen på overnatting. Uansett hvilken teknikk er brukt, praktisere koloni plukke før de virkelige eksperimenter er svært oppmuntret.

Som beskrevet strategi anvender en gen-felle Fremgangsmåte for å drive ekspresjon av PAC-genet av av den endogene promoter PPP1R2C, plukke betydelig mer enn 30 kolonier ikke skulle vise seg nødvendig. SA-2A bundet PAC valg teoretisk eliminerer tilfeldig integrering-celler, men ytterligere tilfeldig integrering (r) kan forekomme i iPSCs bærer vellykkede målrettet integrasjon. I de fleste tilfeller har nesten 100% av narkotika valgt kloner målrettet integrasjoner og ~ 10-40% av dem ha ekstra tilfeldig INTEGRATIons. Flertallet av målrettede kloner har en tendens til å ha én allele målretting, men eksperimenter hvor> 50% dobbelt-allel målretting forekommer. Den variable frekvens av ytterligere tilfeldige integreringer, så vel som forholdet mellom enkelt-versus dobbelt-allelet målretting, er vanskelig å kontrollere. Derfor er å plukke ~ 20 kolonier anbefales for å sikre enkelt- eller dobbelt-allelet målretting-bare kloner kan skaffes. I lys av mislykkede målretting eksperimenter, re-evaluering av målet cellenes transfectability, overlevelse og vekst, er effekten av nukleaser i den spesifikke cellelinje, og kvaliteten på giver- og nuklease forberedelser anbefales før re-prøver eksperimentet i sin helhet.

Det skal bemerkes at tilsvarende gen-felle donor strategier kan anvendes for å målrette andre aktive gener, men er ikke egnet for lydløs gen målretting som krever en uavhengig promotor for å drive valgbar genekspresjon. Også, mens the AAVS1 trygg havn anses å ha åpen kromatinstruktur, betyr ikke dette nødvendigvis at enhver transgenet kan uttrykkes sterkt på dette locus. Faktisk, vår siste rapport viste at flere svake arrangører ikke var i stand til å kjøre påviselig fluorescerende reporter genuttrykk etter målrettet integrasjon på AAVS1 locus 14.

Denne protokollen fokuserer på bruk av godt validerte Talens å målrette et godt studert trygg havn locus i det menneskelige genom. De teknikker som er meget reproduserbar og lett tilpasses til mange anvendelser som innbefatter en hvilken som helst transgenet. Sammenlignet med genom engineering metoder ved hjelp av tilfeldige integrasjoner, er AAVS1-TALEN mediert genet målretting svært effektiv og konkret, og i tilfelle av iPSCs, resulterer i stabilt fluorescerende celler som har potensial til å utvide og skille ut noen menneskelig celletype. Mens denne protokollen ikke beskrive design og validering av designer nukleaser eller vurderingen av målrettede IPSC kolonier for pRoper kassett integrering og off-target-analyse, har flere gode protokoller beskrevet disse aspektene av metodikken i detalj 16-18. Materen fritt IPSC kultur og passaging teknikker ved hjelp av E8 medium er også beskrevet i detalj i forrige publisering 19. Den ovennevnte protokoll, mens optimalisert for genet tilsetning inn i AAVS1 safe-havn av humane iPSCs, kan tjene som en generell mal for forsøk med setespesifikk nuklease-formidlet gen redigering / tilsetning ved hjelp av en homolog rekombinasjon donor i en hvilken som helst celletype.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende økonomiske interesser.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, *LDEV-Free, 10 ml Corning 354230 Store at -20 °C.
DMEM/F-12 Life Technologies 11320-033 Store at 4 °C.
Costar 6 Well Clear TC-Treated Multiple Well Plates Corning 3506
Essential 8 Medium Life Technologies A1517001 Store basal medium at 4 °C. Store supplement at -20 °C.
Y-27632 dihydrochloride Tocris 1254 Store at room temp. Once dissolved in H2O, store at -20 °C.
Sodium Chloride Sigma S5886-500G
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 Life Technologies 15575-020
DPBS, no calcium, no magnesium Life Technologies 14190-250
100 mm TC-Treated Culture Dish Corning 430167
DR4 MEF 2M IRR - Academic GlobalStem GSC-6204G Store in liquid Nitrogen.
DMEM, high glucose, pyruvate Life Technologies 11995-040 Store at 4 °C.
Defined Fetal Bovine Serum, US Origin HyClone SH30070.03 Store at -20 °C. Thaw at 4 °C overnight and aliquot. Store aliquots at -20 °C until needed.
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) Life Technologies 11140-050 Store at 4 °C.
4D-Nucleofector Core unit  Lonza AAF-1001B part of the electroporation system
4D-Nucleofector X unit  Lonza AAF-1001X part of the electroporation system
P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit L (24 RCT) Lonza V4XP-3024 Upon arrival, remove Primary Cell Solution and supplement and store at 4 °C.
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent Life Technologies A1110501 Store at -20 °C. Thaw overnight at 4°C and warm an aliquot in a 37 °C water bath before use.
NutriStem XF/FF Culture Medium Stemgent 01-0005 Store at -20 °C. Thaw overnight at 4 °C
AAVS1 TALENs (pZT-AAVS1-L1 and pZT-AAVS1-R1) Addgene 52637 and 52638
Name Company Catalog Number Comments
AAVS1-CAG-EGFP Homologous Recombination donor Addgene 22212
Puromycin Dihydrochloride Life Technologies A11138-03 Store at -20 °C. Prepare working aliquots of 1 mg/ml in ddH2O.
Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipets Fisher Scientific 13-678-20A
Sorvall Legend XTR (Refrigerated), 120 V 60 Hz Thermo Scientific 75-004-521
TX-750 4 × 750 ml Swinging Bucket Rotor Thermo Scientific 75003607
Trypan Blue Solution, 0.4% Life Technologies 15250-061

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  2. Hentze, H., Graichen, R., Colman, A. Cell therapy and the safety of embryonic stem cell-derived grafts. Trends Biotechnol. 25 (1), 24-32 (2007).
  3. Smith, J. R., et al. Robust, persistent transgene expression in human embryonic stem cells is achieved with AAVS1-targeted integration. Stem Cells. 26 (2), 496-504 (2008).
  4. Lombardo, A., et al. Site-specific integration and tailoring of cassette design for sustainable gene transfer. Nat Methods. 8 (10), 861-869 (2011).
  5. Ogata, T., Kozuka, T., Kanda, T. Identification of an insulator in AAVS1, a preferred region for integration of adeno-associated virus DNA. J Virol. 77 (16), 9000-9007 (2003).
  6. Zwaka, T. P., Thomson, J. A. Homologous recombination in human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 21 (3), 319-321 (2003).
  7. Urbach, A., Schuldiner, M., Benvenisty, N. Modeling for Lesch-Nyhan disease by gene targeting in human embryonic stem cells. Stem Cells. 22 (4), 635-641 (2004).
  8. Hockemeyer, D., et al. Efficient targeting of expressed and silent genes in human ESCs and iPSCs using zinc-finger nucleases. Nature biotechnology. 27 (9), 851-857 (2009).
  9. Zou, J., et al. Gene targeting of a disease-related gene in human induced pluripotent stem and embryonic stem cells. Cell stem cell. 5 (1), 97-110 (2009).
  10. Hockemeyer, D., et al. Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases. Nature. 29 (8), 731-734 (2011).
  11. Sanjana, N. E., et al. A transcription activator-like effector toolbox for genome engineering. Nature protocols. 7 (1), 171-192 (2012).
  12. Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
  13. Ding, Q., et al. Enhanced efficiency of human pluripotent stem cell genome editing through replacing TALENs with CRISPRs. Cell stem cell. 12 (4), 393-394 (2013).
  14. Luo, Y., et al. Stable Enhanced Green Fluorescent Protein Expression After Differentiation and Transplantation of Reporter Human. Induced Pluripotent Stem Cells Generated by AAVS1 Transcription Activator-Like Effector Nucleases. Stem Cells Transl Med. 3 (7), 821-835 (2014).
  15. Zou, J., et al. Oxidase-deficient neutrophils from X-linked chronic granulomatous disease iPS cells: functional correction by zinc finger nuclease-mediated safe harbor targeting. Blood. 117 (21), 5561-5572 (2011).
  16. Luo, Y., Rao, M., Zou, J. Generation of GFP Reporter Human Induced Pluripotent Stem Cells Using AAVS1 Safe Harbor Transcription Activator-Like Effector Nuclease. Curr Protoc Stem Cell Biol. 29, 5A.7.1-5A.7.18 (2014).
  17. Peters, D. T., Cowan, C. A., Musunuru, K. Genome editing in human pluripotent stem cells. StemBook. , Harvard Stem Cell Institute. Cambridge, MA. Available from: http://www.stembook.org/node/1438 (2008-2013).
  18. Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  19. Beers, J., et al. Passaging and colony expansion of human pluripotent stem cells by enzyme-free dissociation in chemically defined culture conditions. Nat Protoc. 7, 2029-2040 (2012).

Tags

Developmental Biology induserte pluripotente stamceller genet redigering AAVS1 TALEN GFP
Transfeksjon, merking og koloni-plukking av menneskeskapte Pluripotent stamceller TALEN målrettet med en GFP Gene inn i AAVS1 Safe Harbor
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cerbini, T., Luo, Y., Rao, M. S.,… More

Cerbini, T., Luo, Y., Rao, M. S., Zou, J. Transfection, Selection, and Colony-picking of Human Induced Pluripotent Stem Cells TALEN-targeted with a GFP Gene into the AAVS1 Safe Harbor. J. Vis. Exp. (96), e52504, doi:10.3791/52504 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter