Chitosan / interfering RNA Nanopartikel vermittelten Gen-Stummschaltung in Disease Vector Mückenlarven
Summary
Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Hemmung der Genfunktion in Krankheitsvektor Mücken durch die Verwendung von Chitosan / interferierenden RNA-Nanopartikel, die durch Larven aufgenommen werden.
Abstract
Vektor-Mücken verursachen mehr menschliches Leid als jeder andere Organismus – und tötet mehr als eine Million Menschen pro Jahr. Die Moskitogenomprojekten erleichtert die Forschung in neue Facetten Moskito Biologie, einschließlich funktionale genetische Studien in der Primär afrikanischen Malariavektor Anopheles gambiae und dem Dengue-Fieber und Gelbfieber-Vektor Aedes aegypti. RNA Interferenz- (RNAi-) vermittelte Gen-Silencing ist verwendet worden, um Gene von Interesse in beiden dieser Krankheitsvektor Mückenarten zielen. Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Herstellung von Chitosan / interferierenden RNA-Nanopartikel, die mit Lebensmitteln kombiniert und durch Larven aufgenommen. Diese technisch einfach, mit hohem Durchsatz und relativ kostengünstige Methode, die mit langen doppelsträngigen RNA (dsRNA) oder kleine interferierende RNA (siRNA) Moleküle kompatibel ist, ist für die erfolgreiche Knockdown von einer Anzahl von verschiedenen Genen in A. verwendet gambiae und A. aegyptiLarven. Nach Larvenernährung, Knockdown, die durch qRT-PCR und in situ Hybridisierung überprüft wird, kann zumindest durch die späten Puppenstadium fortbestehen. Diese Methode kann für eine Vielzahl von vor allem Insektenarten, darunter landwirtschaftliche Schädlinge sowie andere nicht-Modellorganismen sein. Zusätzlich zu ihrer Nützlichkeit im Forschungslabor, in der Zukunft, Chitosan, einem kostengünstigen, nicht-toxischen und biologisch abbaubaren Polymer, könnte möglicherweise in dem Gebiet verwendet werden.
Introduction
Blut-Fütterung Trägermücken der Anopheles und Aedine Gattungen übertragen Krankheitserreger für einige der schlimmsten Geißeln der Menschheit verantwortlich. Schätzungsweise 3,4 Milliarden Menschen mit einem Risiko für Malaria zu erkranken, die für mehr als eine halbe Million Todesfälle pro Jahr weltweit verantwortlich ist. Malaria Ergebnisse vor einer Infektion durch Plasmodium sp. Parasiten, die den Menschen durch den Stich infizierter Mücken auf der Gattung Anopheles, einschließlich der Hauptnischen Vektor Anopheles gambiae (übertragen werden http://www.who.int/topics/malaria/en/ , 2014) 1. Aedes aegypti ist die primäre Trägermücke für Dengue-Virus, die Dengue-Fieber, eine unspezifische fieberhafte Erkrankung, die die am weitesten verbreitete und wichtige arboviral Krankheit in der Welt ist, verursacht. Dengue-Virus ist derzeit eine Bedrohung für> 2,5 Milliarden Menschen in den Tropen, mit einer jährlichen incidence von rund 50 Millionen Fällen zu ~ 24.000 Todesfälle pro Jahr ( http://www.cdc.gov/dengue/ , 2014) 2. Trotz der dramatischen weltweiten Auswirkungen der Moskitos übertragene Krankheiten auf die menschliche Gesundheit sind effiziente Mittel zur Prävention und Behandlung dieser Krankheiten fehlt. Moskito-Kontrolle ist derzeit die beste Methode zur Verhütung von Krankheiten.
Das Potenzial für die Steuerung von Arthropoden übertragene Krankheiten, die durch die genetische Manipulation von Wirtsinsekten ist seit mehr als vier Jahrzehnten 3 anerkannt worden. Transgene Stämme von A. aegypti entwickelt, um eine reprimierbaren frauenspezifische flug Phänotyp haben in jüngster Zeit, das Potenzial für den Einsatz von transgenen Kontrollstrategien zu verwirklichen 4-6. Diese Fortschritte haben die Forscher herausgefordert, neue genetische Ziele für Vektorregelung und zusätzliche Mittel zum Manipulieren der Genfunktion in Überträgermücken zu identifizieren. Eine Veränderung der Genexpression dährend Entwicklung, wie in weiblich-flug Mücken 4 der Fall war, kann die Aufklärung von neuen Kontrollstrategien zu fördern. Jedoch hauptsächlich auf technische Herausforderungen, die Funktionen der wenigen Genen während der Entwicklung A. gekennzeichnet gambiae, A. aegypti oder andere Mückenarten.
Seit ihrer Entdeckung in C. elegans 7, RNA-Interferenz (RNAi), die in Tieren, Pflanzen und Mikroorganismen konserviert ist, wurde umfassend für funktionelle genetische Untersuchungen in einer Vielzahl von Organismen, einschließlich Insekten 8,9 verwendet. Die RNAi wird von Dicer, das spaltet lange dsRNA in kurze 20-25 Nukleotide langen siRNAs, die als sequenzspezifische interfering RNA funktionieren begonnen. siRNAs Stille Gene, die in der Sequenz komplementär sind durch die Förderung Transkript Umsatz, Spaltung, und die Störung der Übersetzung 9. Lange dsRNA-Moleküle (in der Regel 300 bis 600 bp) oder kundenspezifischen siRNAs eine particular Sequenz kann im Forschungslabor zur Dämpfung jedes Gen von Interesse verwendet werden. Durch die Verwaltung, wenn interfering RNA geliefert wird, können die Forscher die Zeit zu steuern, mit der Gen-Silencing-Eingeweihten. Dieser Vorteil ist nützlich, da es verwendet werden, um Herausforderungen wie die Entwicklung Letalität oder Sterilität, die die Produktion und Wartung von Stämmen Lager vererbbare Mutationen, eine kostspielige und arbeitsintensiver Prozess, der nicht in allen Insektenarten ist noch behindern überwunden werden können. Obwohl der Grad der Gen-Silencing durch RNAi von Gen zu Gen, Gewebe zu Gewebe und Tier zu Tier variieren, wird RNAi weithin für die funktionelle Analyse von Genen in Moskitos und andere Insekten 8,9 verwendet.
Drei interfering RNA Lieferstrategien in Mücken verwendet: Mikroinjektion, Einweichen / topische Anwendung und Einnahme. Für eine detaillierte Geschichte und ein Vergleich der Verwendung dieser drei Techniken in Insekten, wenden Sie sich bitte an Yu et al 8 beziehen. WE erfolgreich als Mittel zur Bereitstellung von siRNAs verwendet Mikroinjektion von 10 bis Entwicklungsgenen in A. Ziel aegypti Embryos, Larven und Puppen 11-14. Diese arbeitsintensive Lieferstrategie erfordert jedoch sowohl eine Mikroinjektion Einrichtung und eine geschickte Hand. Darüber hinaus ist die Mikroinjektion stressig für den Organismus, ein Störfaktor, vor allem wenn Verhaltensphänotypen bewertet werden. Schließlich können die Mikroinjektion Lieferung nicht auf den Bereich für die Vektorregelung verlängert werden. Alternativ Einweichen der Organismus in interfering RNA-Lösung hat sich auch ein beliebtes Mittel zur Induktion Gen-Silencing, wie es bequem und erfordert wenig Ausrüstung oder die Arbeitskräfte. Einweichen wurde hauptsächlich in Insektenzelllinie angewendet wurde studiert 8, jedoch in einer neuen Studie wurde Zuschlag in A. erreicht aegypti Larven in einer Lösung von dsRNA 15, die die Tiere zu sein schien Einnahme eingetaucht. Für Studien, die Analyse von mehreren experimental Gruppen oder Phänotypen ist Einweichen ziemlich teuer. Lopez-Martinez et al. 16 beschrieben Rehydrierung angetrieben RNAi, einen neuen Ansatz für interfering RNA Lieferung, die Dehydratisierung in Kochsalzlösung und Rehydrierung beinhaltet mit einem einzigen Tropfen Wasser enthält interfering RNA. Dieser Ansatz bedeutet Senkung der Kosten mit ganzen Tiereint assoziiert, aber teurer ist als die Mikroinjektion und in ihrer Anwendung nicht auf Spezies, die eine hohe osmotische Druck tolerieren kann begrenzt werden. Darüber hinaus ist es schwierig, sich vorzustellen, wie Tauchen oder Dehydratation / Rehydratation Tauch Methode könnte zur Vektor-Kontrolle im Bereich angepasst werden. Aus diesen Gründen ist für die post-embryonale Studien, ist die Lieferung von interfering RNA mit aufgenommenen Nahrung eine Alternative Strategie.
Obwohl Einnahme basierte Strategien müssen nicht in allen Insektenarten, vor allem wohl Drosophila melanogaster ist orale Verabreichung von interfering RNA mit der Nahrung vermischt Gen si gefördertlencing in eine Vielzahl von Insekten 8,17, einschließlich A. aegypti Erwachsene 18. Wir beschriebenen Chitosan-Nanopartikel vermittelten RNAi in A. gambiae Larven 19 und haben diesen Ansatz zur Reduktion der Genexpression in A. erfolgreich angewendet aegypti Larven 20,21. Hier Methodik für diese RNAi Verfahren, das Einschließen von interfering RNA durch das Polymer Chitosan umfasst, ist detailliert. Chitosan / interfering RNA Nanopartikel durch Selbstorganisation von Polykationen mit interferierenden RNA durch die elektrostatischen Kräfte zwischen den positiven Ladungen der Aminogruppen in Chitosan und negativen Ladungen von den Phosphatgruppen auf der Hauptkette des interferierenden RNA 19 durch gebildet. Das beschriebene Verfahren ist sowohl mit langen dsRNA-Moleküle (im folgenden als dsRNA bezeichnet) oder doppelsträngigen siRNA (nachstehend als siRNA bezeichnet) kompatibel. Nach der Synthese Chitosan / interfering RNA Nanopartikel mit Futtersaft gemischt und geliefertLarven bei Einnahme. Diese Methode ist relativ kostengünstig, erfordert wenig Ausrüstung und Arbeits 19 und ermöglicht Hochdurchsatz-Analyse von mehreren Phänotypen, einschließlich der Analyse der Verhaltensweisen 20,21. Diese Methodik, die für die Gen-Silencing-Studien in anderen Insekten, einschließlich anderer Krankheitsvektoren und Insekten landwirtschaftlichen Schädlingen angepasst werden kann, könnte möglicherweise für das Gen-Silencing in einer Vielzahl von anderen Tierspezies verwendet werden. Außerdem könnte Chitosan, ein kostengünstiges, nicht-toxische und biologisch abbaubares Polymer 22, möglicherweise in dem Feld für artspezifischen Moskitobekämpfung genutzt werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das Chitosan / interfering RNA Nanopartikel hierin beschriebenen Methodik wurde verwendet, um Gene während Larvenentwicklung in A. zielgerichteter gambiae (2, 3) und A. aegypti (Figuren 4, 5, 6, Tabelle 1, 2). Chitosan-Nanopartikeln kann entweder mit langen dsRNA oder siRNA, die beide erfolgreich in Moskitos verwendet worden, wie durch die hierin beschriebenen repräsentativen Ergebnisse zeigten weiterhin hergestellt werden. Synthese der dsRNA ist weniger teu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Funding from the Kansas Agricultural Experiment Station and K-State Arthropod Genomics Center to KYZ supported the original development of chitosan/dsRNA-mediated gene silencing in A. gambiae19.The A. gambiae work described here was supported in part by R01-AI095842 from NIH/NIAID to KM. Development of chitosan/siRNA-mediated gene silencing in A. aegypti20,21 was supported by NIH/NIAID Award R01-AI081795 to MDS. The contents of this study are solely the responsibility of the authors and do not necessarily represent the official views of the NIH.
Materials
| Name of Reagent/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Descriptions |
| 0.02 ml pipetteman | Rainin | PR20 | for resuspension of interfering RNA |
| 0.2 ml pipetteman | Rainin | PR200 | for resuspension of interfering RNA and preparation of interfering RNA/nanoparticles |
| 0.5 ml graduated tube | Fischer Scientific | 05-408-120 | for aliquoting resuspended interfering RNA |
| 1 ml pipetteman | Rainin | PR1000 | for resuspension of interfering RNA and preparation of interfering RNA/nanoparticles |
| 1.5 ml graduated tube | Fischer Scientific | 05-408-046 | for preparation of interfering RNA/nanoparticles |
| 1M Sodium Acetate, pH 4.5 | TEKnova | S0299 | to prepare sodium acetate buffer |
| Acetic Acid, AIRSTAR. ACS, USP, FCC Grade | BDH | VWR BDH3092-500MLP | to prepare sodium acetate buffer |
| Agarose Genetic Technology Grade | MP Biomedicals LLC. | 800668 | to coat prepared interfering RNA/nanoparticles |
| Centrifuge | Eppendorf AG | 5415D | to pellet interfering RNA/nanoparticles |
| Chitosan, from shrimp shells | Sigma-Aldrich | C3646-25G | to combine with interfering RNA for prepararation of interfering RNA/nanoparticles |
| Dry Yeast | Universal Food Corp | NA | to prepare mosquito larval food with interfering RNA/nanoparticles |
| E-RNAi tool | German Cancer Research Center | NA | for design of dsRNA; http://www.dkfz.de/signaling/e-rnai3// |
| goldfish food | Wardley | Goldfish FLAKE FOOD | to prepare mosquito larval food with interfering RNA/nanoparticles |
| Heated water bath | Thermo Scientific | 51221048 | to heat the interfering RNA/nanoparticles at 55oC |
| Ice | not applicable | not applicable | for thawing interfering RNA and preparation of interfering RNA/nanoparticles |
| Ice bucket | Fisher Scientific | 02-591-44 | for storage of ice used during the procedure |
| liver powder | MP Biomedicals LLC. | 900396 | to feed mosquito larvae post interfering RNA/nanoparticle treatment |
| Microwave oven | A variety of vendors | not applicable | to prepare 2% agarose solution |
| petridish (100X15 mm) | Fischer Scientific | 875713 | interfering RNA/nanoparticle feeding chamber for larvae |
| pH meter | Mettler Toledo | S220 | for preparation of buffers |
| Razor blade | Fischer Scientific | 12-640 | to divide the interfering RNA/nanoparticle pellet for feedings |
| siRNA | Thermo Scientific/Dharmacon | custom | for preparation of siRNA/nanoparticles |
| Sodium Sulfate, Anhydrous (Na2SO4) | BDH/distributed by VWR | VWR BDH0302-500G | to prepare 50mM sodium sulfate solution in which the interfering RNA will be resuspended |
| Thermometer | VWR | 61066-046 | to measure the water bath temperature |
| Tooth picks | VWR | 470146-908 | for stirring during interfering RNA/nanoparticle food preparation and cutting gel pellets |
| Ultralow freezer | A variety of vendors | not applicable | for storage of interfering RNA aliquots and interfering RNA/nanoparticles at -80oC |
| Vortex mixer | Fischer Scientific | 02-216-108 | for preparation of chitosan/interfering RNA |
| Weight paper | Fischer Scientific | NC9798735 | to divide the interfering RNA/nanoparticle pellet for feedings |
References
- Knipling, E. F., et al. Genetic control of insects of public health importance. Bulletin of the World Health Organization. 38 (3), 421-438 (1968).
- Fu, G., et al. Female-specific flightless phenotype for mosquito control. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (10), 4550-4554 (2010).
- Wise de Valdez, M. R., et al. Genetic elimination of dengue vector mosquitoes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (12), 4772-4775 (2011).
- Harris, A. F., et al. Successful suppression of a field mosquito population by sustained release of engineered male mosquitoes. Nature Biotechnology. 30 (9), 828-830 (2012).
- Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
- Yu, N., et al. Delivery of dsRNA for RNAi in insects: an overview and future directions. Insect science. 20 (1), 4-14 (2013).
- Zhang, H., Li, H. C., Feasibility Miao, X. X. limitation and possible solutions of RNAi-based technology for insect pest control. Insect science. 20 (1), 15-30 (2013).
- Clemons, A., Haugen, M., Severson, D. W., Duman-Scheel, M. Functional analysis of genes in Aedes aegypti embryos. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (10), (2010).
- Clemons, A., et al. siRNA-mediated gene targeting in Aedes aegypti embryos reveals that frazzled regulates vector mosquito CNS development. PLoS One. 6 (1), e16730 (2011).
- Haugen, M., et al. Semaphorin-1a is required for Aedes aegypti embryonic nerve cord development. PLoS One. 6 (6), e21694 (2011).
- Nguyen, C., et al. Functional genetic characterization of salivary gland development in Aedes aegypti. EvoDevo. 4 (1), 9 (2013).
- Sarro, J., et al. Requirement for commissureless2 function during dipteran insect nerve cord development. Developmental dynamics: an official publication of the American Association of Anatomists. 242 (12), 1466-1477 (2013).
- Singh, A. D., Wong, S., Ryan, C. P., Whyard, S. Oral delivery of double-stranded RNA in larvae of the yellow fever mosquito, Aedes aegypti: implications for pest mosquito control. J Insect Sci. 13, 69 (2013).
- Lopez-Martinez, G., Meuti, M., Denlinger, D. L. Rehydration driven RNAi: a novel approach for effectively delivering dsRNA to mosquito larvae. Journal of medical entomology. 49 (1), 215-218 (2012).
- Scott, J. G., et al. Towards the elements of successful insect RNAi. Journal of insect physiology. 59 (12), 1212-1221 (2013).
- Coy, M. R., et al. Gene silencing in adult Aedes aegypti mosquitoes through oral delivery of double-stranded RNA. J Appl Entomol. 136 (10), 741-748 (2012).
- Zhang, X., Zhang, J., Zhu, K. Y. Chitosan/double-stranded RNA nanoparticle-mediated RNA interference to silence chitin synthase genes through larval feeding in the African malaria mosquito (Anopheles gambiae). Insect molecular biology. 19 (5), 683-693 (2010).
- Mysore, K., Flannery, E. M., Tomchaney, M., Severson, D. W., Duman-Scheel, M. Disruption of Aedes aegypti olfactory system development through chitosan/siRNA nanoparticle targeting of semaphorin-1a. PLoS neglected tropical diseases. 7 (5), e2215 (2013).
- Mysore, K., Andrews, E., Li, P., Duman-Scheel, M. Chitosan/siRNA nanoparticle targeting demonstrates a requirement for single-minded during larval and pupal olfactory system development of the vector mosquito Aedes aegypti. BMC developmental biology. 14 (1), 9 (2014).
- Dass, C. R., Choong, P. F. Chitosan-mediated orally delivered nucleic acids: a gutful of gene therapy. Journal of drug targeting. 16 (4), 257-261 (2008).
- An, C., Budd, A., Kanost, M. R., Michel, K. Characterization of a regulatory unit that controls melanization and affects longevity of mosquitoes. Cellular and molecular life sciences : CMLS. 68 (11), 1929-1939 (2011).
- Clemons, A., Mori, A., Haugen, M., Severson, D. W., Duman-Scheel, M. Culturing and egg collection of Aedes aegypti. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (10), (2010).
- Horn, T., Boutros, M. E-RNAi: a web application for the multi-species design of RNAi reagents–2010 update. Nucleic acids research. 38, W332-W339 (2010).
- Patel, N. H., PA, K. r. i. e. g. Ch. 19. In situ hybridization to whole mount Drosophila embryos. A laboratory guide to RNA: Isolation, Analysis, and Synthesis. , (1996).
- Haugen, M., et al. . Whole-mount in situ hybridization for analysis of gene expression during Aedes aegypti development. 2010 (10), (2010).
- Clemons, A., Flannery, E., Kast, K., Severson, D. W., Duman-Scheel, M. Immunohistochemical analysis of protein expression during Aedes aegypti development. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (10), (1101).
- Rund, S. S., Hou, T. Y., Ward, S. M., Collins, F. H., Duffield, G. E. Genome-wide profiling of diel and circadian gene expression in the malaria vector Anopheles gambiae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (32), E421-E430 (2011).
- Gaj, T., Gersbach, C. A., Barbas, C. F. ZFN, TALEN, CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends in biotechnology. 31 (7), 397-405 (2013).
- Aryan, A., Myles, K. M., Adelman, Z. N. Targeted genome editing in Aedes aegypti using TALENs. Methods. 69 (1), 38-45 (2014).
- Sarathi, M., Simon, M. C., Venkatesan, C., Hameed, A. S. Oral administration of bacterially expressed VP28dsRNA to protect Penaeus monodon from white spot syndrome virus. Mar Biotechnol (NY). 10 (3), 242-249 (2008).
- He, B., et al. Fluorescent nanoparticle delivered dsRNA toward genetic control of insect pests). Adv Mater. 25 (33), 4580-4584 (2013).
- Giljohann, D. A., Seferos, D. S., Prigodich, A. E., Patel, P. C., Mirkin, C. A. Gene regulation with polyvalent siRNA-nanoparticle conjugates. Journal of the American Chemical Society. 131 (6), 2072-2073 (2009).
- Davis, M. E., et al. Evidence of RNAi in humans from systemically administered siRNA via targeted nanoparticles. Nature. 464 (7921), 1067-1070 (2010).
- Molinaro, R., et al. Polyethylenimine and chitosan carriers for the delivery of RNA interference effectors. Expert opinion on drug delivery. 10 (12), 1653-1668 (2013).
- Singha, K., et al. Polymers in small-interfering RNA delivery. Nucleic acid therapeutics. 21 (3), 133-148 (2011).
