Summary
Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Hemmung der Genfunktion in Krankheitsvektor Mücken durch die Verwendung von Chitosan / interferierenden RNA-Nanopartikel, die durch Larven aufgenommen werden.
Abstract
Vektor-Mücken verursachen mehr menschliches Leid als jeder andere Organismus - und tötet mehr als eine Million Menschen pro Jahr. Die Moskitogenomprojekten erleichtert die Forschung in neue Facetten Moskito Biologie, einschließlich funktionale genetische Studien in der Primär afrikanischen Malariavektor Anopheles gambiae und dem Dengue-Fieber und Gelbfieber-Vektor Aedes aegypti. RNA Interferenz- (RNAi-) vermittelte Gen-Silencing ist verwendet worden, um Gene von Interesse in beiden dieser Krankheitsvektor Mückenarten zielen. Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Herstellung von Chitosan / interferierenden RNA-Nanopartikel, die mit Lebensmitteln kombiniert und durch Larven aufgenommen. Diese technisch einfach, mit hohem Durchsatz und relativ kostengünstige Methode, die mit langen doppelsträngigen RNA (dsRNA) oder kleine interferierende RNA (siRNA) Moleküle kompatibel ist, ist für die erfolgreiche Knockdown von einer Anzahl von verschiedenen Genen in A. verwendet gambiae und A. aegyptiLarven. Nach Larvenernährung, Knockdown, die durch qRT-PCR und in situ Hybridisierung überprüft wird, kann zumindest durch die späten Puppenstadium fortbestehen. Diese Methode kann für eine Vielzahl von vor allem Insektenarten, darunter landwirtschaftliche Schädlinge sowie andere nicht-Modellorganismen sein. Zusätzlich zu ihrer Nützlichkeit im Forschungslabor, in der Zukunft, Chitosan, einem kostengünstigen, nicht-toxischen und biologisch abbaubaren Polymer, könnte möglicherweise in dem Gebiet verwendet werden.
Introduction
Blut-Fütterung Trägermücken der Anopheles und Aedine Gattungen übertragen Krankheitserreger für einige der schlimmsten Geißeln der Menschheit verantwortlich. Schätzungsweise 3,4 Milliarden Menschen mit einem Risiko für Malaria zu erkranken, die für mehr als eine halbe Million Todesfälle pro Jahr weltweit verantwortlich ist. Malaria Ergebnisse vor einer Infektion durch Plasmodium sp. Parasiten, die den Menschen durch den Stich infizierter Mücken auf der Gattung Anopheles, einschließlich der Hauptnischen Vektor Anopheles gambiae (übertragen werden http://www.who.int/topics/malaria/en/ , 2014) 1. Aedes aegypti ist die primäre Trägermücke für Dengue-Virus, die Dengue-Fieber, eine unspezifische fieberhafte Erkrankung, die die am weitesten verbreitete und wichtige arboviral Krankheit in der Welt ist, verursacht. Dengue-Virus ist derzeit eine Bedrohung für> 2,5 Milliarden Menschen in den Tropen, mit einer jährlichen incidence von rund 50 Millionen Fällen zu ~ 24.000 Todesfälle pro Jahr ( http://www.cdc.gov/dengue/ , 2014) 2. Trotz der dramatischen weltweiten Auswirkungen der Moskitos übertragene Krankheiten auf die menschliche Gesundheit sind effiziente Mittel zur Prävention und Behandlung dieser Krankheiten fehlt. Moskito-Kontrolle ist derzeit die beste Methode zur Verhütung von Krankheiten.
Das Potenzial für die Steuerung von Arthropoden übertragene Krankheiten, die durch die genetische Manipulation von Wirtsinsekten ist seit mehr als vier Jahrzehnten 3 anerkannt worden. Transgene Stämme von A. aegypti entwickelt, um eine reprimierbaren frauenspezifische flug Phänotyp haben in jüngster Zeit, das Potenzial für den Einsatz von transgenen Kontrollstrategien zu verwirklichen 4-6. Diese Fortschritte haben die Forscher herausgefordert, neue genetische Ziele für Vektorregelung und zusätzliche Mittel zum Manipulieren der Genfunktion in Überträgermücken zu identifizieren. Eine Veränderung der Genexpression dährend Entwicklung, wie in weiblich-flug Mücken 4 der Fall war, kann die Aufklärung von neuen Kontrollstrategien zu fördern. Jedoch hauptsächlich auf technische Herausforderungen, die Funktionen der wenigen Genen während der Entwicklung A. gekennzeichnet gambiae, A. aegypti oder andere Mückenarten.
Seit ihrer Entdeckung in C. elegans 7, RNA-Interferenz (RNAi), die in Tieren, Pflanzen und Mikroorganismen konserviert ist, wurde umfassend für funktionelle genetische Untersuchungen in einer Vielzahl von Organismen, einschließlich Insekten 8,9 verwendet. Die RNAi wird von Dicer, das spaltet lange dsRNA in kurze 20-25 Nukleotide langen siRNAs, die als sequenzspezifische interfering RNA funktionieren begonnen. siRNAs Stille Gene, die in der Sequenz komplementär sind durch die Förderung Transkript Umsatz, Spaltung, und die Störung der Übersetzung 9. Lange dsRNA-Moleküle (in der Regel 300 bis 600 bp) oder kundenspezifischen siRNAs eine particular Sequenz kann im Forschungslabor zur Dämpfung jedes Gen von Interesse verwendet werden. Durch die Verwaltung, wenn interfering RNA geliefert wird, können die Forscher die Zeit zu steuern, mit der Gen-Silencing-Eingeweihten. Dieser Vorteil ist nützlich, da es verwendet werden, um Herausforderungen wie die Entwicklung Letalität oder Sterilität, die die Produktion und Wartung von Stämmen Lager vererbbare Mutationen, eine kostspielige und arbeitsintensiver Prozess, der nicht in allen Insektenarten ist noch behindern überwunden werden können. Obwohl der Grad der Gen-Silencing durch RNAi von Gen zu Gen, Gewebe zu Gewebe und Tier zu Tier variieren, wird RNAi weithin für die funktionelle Analyse von Genen in Moskitos und andere Insekten 8,9 verwendet.
Drei interfering RNA Lieferstrategien in Mücken verwendet: Mikroinjektion, Einweichen / topische Anwendung und Einnahme. Für eine detaillierte Geschichte und ein Vergleich der Verwendung dieser drei Techniken in Insekten, wenden Sie sich bitte an Yu et al 8 beziehen. WE erfolgreich als Mittel zur Bereitstellung von siRNAs verwendet Mikroinjektion von 10 bis Entwicklungsgenen in A. Ziel aegypti Embryos, Larven und Puppen 11-14. Diese arbeitsintensive Lieferstrategie erfordert jedoch sowohl eine Mikroinjektion Einrichtung und eine geschickte Hand. Darüber hinaus ist die Mikroinjektion stressig für den Organismus, ein Störfaktor, vor allem wenn Verhaltensphänotypen bewertet werden. Schließlich können die Mikroinjektion Lieferung nicht auf den Bereich für die Vektorregelung verlängert werden. Alternativ Einweichen der Organismus in interfering RNA-Lösung hat sich auch ein beliebtes Mittel zur Induktion Gen-Silencing, wie es bequem und erfordert wenig Ausrüstung oder die Arbeitskräfte. Einweichen wurde hauptsächlich in Insektenzelllinie angewendet wurde studiert 8, jedoch in einer neuen Studie wurde Zuschlag in A. erreicht aegypti Larven in einer Lösung von dsRNA 15, die die Tiere zu sein schien Einnahme eingetaucht. Für Studien, die Analyse von mehreren experimental Gruppen oder Phänotypen ist Einweichen ziemlich teuer. Lopez-Martinez et al. 16 beschrieben Rehydrierung angetrieben RNAi, einen neuen Ansatz für interfering RNA Lieferung, die Dehydratisierung in Kochsalzlösung und Rehydrierung beinhaltet mit einem einzigen Tropfen Wasser enthält interfering RNA. Dieser Ansatz bedeutet Senkung der Kosten mit ganzen Tiereint assoziiert, aber teurer ist als die Mikroinjektion und in ihrer Anwendung nicht auf Spezies, die eine hohe osmotische Druck tolerieren kann begrenzt werden. Darüber hinaus ist es schwierig, sich vorzustellen, wie Tauchen oder Dehydratation / Rehydratation Tauch Methode könnte zur Vektor-Kontrolle im Bereich angepasst werden. Aus diesen Gründen ist für die post-embryonale Studien, ist die Lieferung von interfering RNA mit aufgenommenen Nahrung eine Alternative Strategie.
Obwohl Einnahme basierte Strategien müssen nicht in allen Insektenarten, vor allem wohl Drosophila melanogaster ist orale Verabreichung von interfering RNA mit der Nahrung vermischt Gen si gefördertlencing in eine Vielzahl von Insekten 8,17, einschließlich A. aegypti Erwachsene 18. Wir beschriebenen Chitosan-Nanopartikel vermittelten RNAi in A. gambiae Larven 19 und haben diesen Ansatz zur Reduktion der Genexpression in A. erfolgreich angewendet aegypti Larven 20,21. Hier Methodik für diese RNAi Verfahren, das Einschließen von interfering RNA durch das Polymer Chitosan umfasst, ist detailliert. Chitosan / interfering RNA Nanopartikel durch Selbstorganisation von Polykationen mit interferierenden RNA durch die elektrostatischen Kräfte zwischen den positiven Ladungen der Aminogruppen in Chitosan und negativen Ladungen von den Phosphatgruppen auf der Hauptkette des interferierenden RNA 19 durch gebildet. Das beschriebene Verfahren ist sowohl mit langen dsRNA-Moleküle (im folgenden als dsRNA bezeichnet) oder doppelsträngigen siRNA (nachstehend als siRNA bezeichnet) kompatibel. Nach der Synthese Chitosan / interfering RNA Nanopartikel mit Futtersaft gemischt und geliefertLarven bei Einnahme. Diese Methode ist relativ kostengünstig, erfordert wenig Ausrüstung und Arbeits 19 und ermöglicht Hochdurchsatz-Analyse von mehreren Phänotypen, einschließlich der Analyse der Verhaltensweisen 20,21. Diese Methodik, die für die Gen-Silencing-Studien in anderen Insekten, einschließlich anderer Krankheitsvektoren und Insekten landwirtschaftlichen Schädlingen angepasst werden kann, könnte möglicherweise für das Gen-Silencing in einer Vielzahl von anderen Tierspezies verwendet werden. Außerdem könnte Chitosan, ein kostengünstiges, nicht-toxische und biologisch abbaubares Polymer 22, möglicherweise in dem Feld für artspezifischen Moskitobekämpfung genutzt werden.
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Protocol
1. Mückenarten und Aufzucht
- Pflegen A. gambiae G3 und A. aegypti Liverpool IB12 Stämme (in den repräsentativen Studien unten verwendet) oder andere Stämme von Interesse nach Standardlaborpraxis oder wie zuvor beschrieben 23,24.
2. dsRNA und siRNA-Design und Produktion
- Design Primer an die dsRNA spezifisch für das Gen von Interesse Vorlagen zu konstruieren. Verwenden Sie die E-RNAi-Tool 25. Produzieren dsRNA gemß der Methode der Wahl oder, wie zuvor beschrieben 19.
- Für eine negative Kontrolle, synthetisieren dsRNA 19 entsprechend der Sequenz des grün fluoreszierenden Proteins (GFP), β-Galactosidase (β-gal) oder ein anderes Gen nicht in Moskitos ausgedrückt. Falls gewünscht, kann dsRNA dazu verwendet, die unten zusammengefaßt sind repräsentative Ergebnisse erzeugen 19 als eine positive Kontrolle verwendet werden. Shop dsRNA in RNase-freiem Wasser gelöst bei -80 °; C, bis sie benötigt.
- Alternativ Design-Gen-spezifische siRNA nach Standardlaborpraxis oder wie zuvor 10 beschrieben. Verwürfeln die Sequenz eines Zuschlags siRNA negative Kontroll-siRNA, die keinem Moskito Gen nicht entspricht entwerfen. Kaufen Sie die kundenspezifischen siRNAs, die durch eine Reihe von seriösen Anbietern zur Verfügung stehen.
- Falls gewünscht, können siRNAs verwendet, die im Folgenden zusammengefasst sind repräsentative Ergebnisse erhalten 20,21 als positive Kontrollen verwendet werden. Shop siRNA in RNase-freiem Wasser gelöst bei -80 ° C, bis sie benötigt.
3. Vorbereitung Chitosan / interfering RNA Nanopartikel
- Sammeln vorgefertigten RT 100 mM Natriumsulfat (100 mM Na 2 SO 4 in deionisiertem H 2 O) und 0,1 M Natriumacetat (0,1M NaC 2 H 3 O 2 -0.1 M Essigsäure, pH 4,5, in entionisiertem H 2 O) Puffer.
- Auflösen von Chitosan (≥75%deacetylierten) in 0,1 M Natriumacetat-Puffer auf 0,02% (w / v) Arbeitslösung und Halten der Lösung bei RT vor der Verwendung.
- Löse dsRNA oder siRNA in 50 ul entionisiertem H 2 O und sie dem 100 mM Natriumsulfat-Puffer zu einer 100 ul Lösung von 32 ug dsRNA / siRNA pro 100 ul 50 mM Natriumsulfat bilden.
- 100 l Chitosanlösung zur dsRNA / siRNA-Lösung und dann das Gemisch in einem Wasserbad bei 55 ° C für 1 min. Eine Steuer durch Zugabe von 100 ul 50 mM Natriumsulfat zu 100 ul Chitosan-Lösung zu stellen und die gleiche Vorgehensweise.
- Mischen der Lösungen sofort für 30 sec mittels Hochgeschwindigkeits Verwirbeln bei RT, um die Bildung von Nanopartikeln zu erleichtern.
- Zentrifugiere das Gemisch bei 13.000 × g für 10 min bei RT, nach welcher Zeit sich ein Pellet sichtbar sein soll. Den Überstand in ein neues 1,5-ml-Tube. Der Luft trocknen das Pellet für ≈10 Minuten bei Raumtemperatur, bevor Sie es an Moskito Essen zuzubereiten.
- Measure die Konzentration von dsRNA / siRNA im Überstand unter Verwendung des Überstands von der Steuerung (siehe 3.5) als leer, um die Gesamtmenge an dsRNA / siRNA, die im Überstand blieb berechnen. Verwenden der Differenz zwischen den Ausgangsmengen an dsRNA / siRNA und in den Überständen verbleibende, den Prozentsatz der dsRNA / siRNA in Nanopartikel eingeschlossen berechnen Mengen. Dieser Ladeeffizienz ist in der Regel über 90%.
- Wiederholen Sie den Vorgang, wenn mehr Nanopartikel benötigt werden. Verwenden Sie die getrockneten Nanopartikel sofort. Der Einfluss der Kühllagerung der Teilchen vor der Verwendung wurde nicht untersucht.
4. Vorbereitung Mosquito Lebensmittel enthalten Chitosan / interfering RNA Nanopartikel
- Herstellung von 1 ml einer 2% igen Lösung (w / v) in entionisiertem Wasser, schmelzen die Agarose und Halten geschmolzenen Agarose-Lösung in einem 55 C-Wasserbad vor dem Gebrauch.
- Mix Fischfutter Flocken (47% Rohprotein, min. Rohfett 10%, max. Rohfaser 3%) und Trockenhefe in eineVerhältnis von 2: 1 (w / w). Schleifen Sie die Mischung, um kleine Partikel mit einem Mörser und Stößel (passable bis Nr 50 USA Standard-Test-Sieb). Verwenden Sie die Grundnahrung, die bräunlich gefärbt sein sollte, entweder sofort oder lagern Sie es in einem verschlossenen Behälter bei 4 ° C für mehrere Wochen.
- In einer 1,5-ml-Tube, mischen 6 mg Boden Nahrung mit den getrockneten Nanopartikel aus Abschnitt 3.7 mit einem Zahnstocher.
- Zugabe von 30 ul 2% vorge geschmolzener Agarose-Gel-Lösung auf die Lebensmittelnanopartikelmischung; sofort und gründlich zu rühren, indem Sie einen Zahnstocher oder Pipettenspitze.
- Verwenden Sie das Gel Essen und Nanopartikel enthalten, um die Mückenlarven sofort füttern. Alternativ, wenn das Gel vollständig bei RT erstarrte, speichern das Gel bei 4 ° C lagern und am nächsten Tag oder bei -80 ° C für die spätere Verwendung.
5. Ernährung Mückenlarven mit Lebensmittel, die Chitosan / interfering RNA Nanopartikel
- Feeding A. gambiae Mückenlarven:
- Entfernen eines single Gel-Pellet aus der 1,5-ml-Röhrchen mit einem Zahnstocher und schneiden Sie es in 6 gleiche Scheiben mit einem sauberen Rasierklinge oder Zahnstocher.
- Übertragungs 20 dritte Larvenstadium in einen 500 ml Petrischale mit 100 ml entionisiertem Wasser.
- Führen Sie das Mückenlarven, indem eine Scheibe des Gels Pellet (fein in kleine Stücke gehackt) pro Petrischale einmal täglich für vier Tage. Achten Sie darauf, Larven auf dem Pellet, die in der Größe deutlich reduziert werden sollte oder am nächsten Tag völlig abwesend zu beobachten. Nach der Zeit wird Mücken in späten vierten Larvenstadium entwickeln.
- Notieren Sie alle sichtbaren phänotypischen Veränderungen während des Experiments. Untersuchen Sie die Transkriptionsniveaus und andere phänotypische Veränderungen, wie in Abschnitt 6 am Ende der viertägigen Zeitraum diskutiert.
- Feeding A. aegypti Mückenlarven:
- Schneiden Sie die Gel-Pellet in 6 gleiche Scheiben mit einem sauberen Rasierklinge oder Zahnstocher.
- Zeigen 50 alters synchronisiert 24 Stunden nach dem Schlüpfen Ei fierste Larvenstadium in eine Petrischale in ≈40 ml entionisiertem Wasser.
- Feed-Larven eine Scheibe pro Petrischale 4 Stunden / Tag, dann Transfer Larven zurück zu den regelmäßigen Larven Ernährung von 2: 1 Bodenfischfutter Flocken und Trockenhefe für den Rest des Tages. Wiederholen Sie den Vorgang täglich während der vier Larvenstadien.
- Untersuchen Sie die Transkriptionsniveaus und andere phänotypische Veränderungen, wie in Abschnitt 6 an den gewünschten Entwicklungszeitpunkten diskutiert.
6. Bestätigung der Gene Knockdown
- Relative Transkript Quantifizierung durch qRT-PCR in A. aegypti und A. gambiae Larven.
- Führen und qRT-PCR-Assays zu analysieren mit drei biologischen Replikaten auf mindestens 10 gepoolten Kontroll vs. experimentelle Larven, wie beschrieben, 11,19,20, oder nach Standard-Laborverfahren. Repräsentative Ergebnisse sind unten aufgeführt.
- Für die Analyse eines bestimmten Gewebetyp / Körperteil (dh., Gehirn oder Antenne), perform qRT-PCR, wie in 6.1.1 folgende Präparation beschrieben, um das Gewebe von Interesse zu erholen (siehe zB Mysore et al. 21).
- Bestätigung der Zuschlags durch in situ Hybridisierung
- Synthetisieren Digoxygenin-markierte Antisense-und Sense-Steuer Ribosonden nach Standardlaborpraxis oder wie beschrieben 26.
- Ausführen der in situ Hybridisierung gemäß dem Haugen et al. 27 Protokoll zur Bestätigung der Zuschlags wie zuvor 11,20 beschriebene und in der repräsentative Ergebnisse weiter unten diskutiert.
- Bestätigung der Zuschlags immunhistochemisch
- Wenn Antikörper gegen das Proteinprodukt des Gens gezielt zur Verfügung stehen, ausführen Immunhistochemie wie zuvor beschrieben 28, die Identifizierung von Individuen mit den höchsten Niveaus der Zuschlags für Phänotypanalyse 20 erleichtert, wie in der Vertre exemplifiziertve Ergebnisse unten.
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Representative Results
A. gambiae:
Chitosan / dsRNA Nanopartikel aufgrund der elektrostatischen Wechselwirkung zwischen den Aminogruppen des Chitosans und der Phosphatgruppen des dsRNA gebildet. Die Effizienz der dsRNA Einbau in Nanopartikel der Regel über 90%, wie durch Abreicherung von dsRNA aus der Lösung gemessen. Rasterkraftmikroskopische Aufnahmen zeigen, dass Chitosan-dsRNA Partikelgröße im Durchschnitt 140 nm im Durchmesser reichen von 100 bis 200 nm (Abbildung 1).
Abbildung 1. Nanopartikelbildung durch Chitosan und interfering RNA. Rasterkraftmikroskopie Bild von Chitosan / dsRNA Nanopartikel (A) oder Chitosan-Lösung ohne Zusatz von dsRNA (B). Die Größe der Bilder betrug 1,0 & mgr; m × 1,0 & mgr; m. Balken = 250 nm.e.com/files/ftp_upload/52523/52523fig1large.jpg "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Fütterung dieser Teilchen, die mit Standard-Futtersaft kombiniert und in Agarose einge unterstützt eine normale Entwicklung der Larven. Wichtig ist, dass spezifische Knockdown von Ektoderm abgeleiteten AgCHS1 Transkripte sowie Mitteldarm-spezifischen AgCHS2 (Abbildung 2) möglich, 19, was zeigt, dass dsRNA sich durch den Verzehr von Nanopartikeln genommen initiiert RNAi über den Mitteldarm. Zuschlagseffizienzen ≈40-60% beobachtet wurden (z. B. Figur 2) und variieren von Transkripten.
Abbildung 2. Transkriptionsebenen Chitinsynthase 2 (AgCHS2) nach Einnahme dsRNA in <em> A. gambiae Larven. Relative mRNA-Spiegel von AgCHS2 in Larven auf Nanopartikel mit ds AgCHS2 oder Steuer ds GFP zugeführt. Daten werden als Mittelwert ± SD von drei unabhängigen biologischen Replikaten dargestellt. Unterschiedliche Buchstaben auf den Balken zeigen signifikante Unterschiede auf der Grundlage des gepaarten t-Tests (P = 0,003).
Knockdown von AgCHS1 deutlich reduziert die Gesamt Chitingehalt der vierten Larvenstadium und erhöht die Anfälligkeit für die Chitinsynthesehemmstoff Insektizid, Diflubenzuron 19 Knockdown von AgCHS2 deutlich die Wirkung von Calcofluor-white erhöht und Dithiothreitol, die die peritrophen Matrix (PM) im vierten Larvenstadium gestört Larven (Figur 3), was zu einer erhöhten Sterblichkeit 17.
AgCHS2 eingenommen Nanopartikeln auf A. gambiae peritrophen Matrix (PM) Durchlässigkeit. Calcofluor weiß oder DTT-Behandlung stört die Uhr von A. gambiae Larven, die durch AgCHS2 Zuschlags durch Einnahme von Chitosan exuberated wird / dsRNA Nanopartikel 19. (A) Mosquito mit intakten Uhr. (B) mit Moskito gestört Uhr, Dextranblau undicht in die Magen ceacae.
A. aegypti:
Chitosan / siRNA-Nanopartikel wurden verwendet, um die Axon Führung Gen Semaphorin-1a (sema1a) während A. Ziel aegypti Larvenentwicklung 20. Knockdown sema1a wurde durch in situ-Hybridisierung, die in ≈60% der Larven Gehirnen ass reduzierte Mengen an sema1a detektierten bestätigtebeitet und es versäumt, sema1a Ausdruck in ≈40% des Zuschlags tierischen Gehirnen erkennen (4C vs. B; gelbe Pfeilspitze zeigt die Antennallobus). qRT-PCR-Assays an vereinigten ganzen Tieren durchgeführte Untersuchung ergab, dass diese Technik in Folge 32 ± 10% Reduktion der sema1a Transkripten im Vergleich zu Kontrollnanopartikel gefütterten Tieren (4A, P <0,01, basierend auf gepaarten t-Test, n = 5, wobei N ist die Anzahl von biologischen Replikate). Zuschlags im Gehirn hielt sich über mindestens 24 h Puppenentwicklung, wie durch den Verlust der Anti-Antikörper Sema1a Expression (Abbildung 4E1 vs. D1), die verwendet wurde, um Tiere mit signifikanten Zuschlags während Larven und Puppen olfaktorischen Phänotyp-Analysen identifiziert belegt. Larven und Puppen Antennallobus Defekte (in Tabelle 1 zu entnehmen) in sema1a Knockdown Larven und Puppen nachgewiesen (4E2, E3 vs. (Abbildung 4E2 gegen D2, mit mAbnc82 visualisiert; Lagerungen beider Signale sind in Abbildung 4D3, E3 gezeigt). Vergleichbare Phänotypen wurden mit zwei getrennten sema1a Knockdown siRNAs, die sicherstellen, dass die festgestellten Mängel waren nicht das Ergebnis von Off-Site-Targeting entweder durch siRNA geholfen erzeugt. Die höchsten Zuschlags wurden erzeugt, wenn die siRNAs wurden vereinigt, eine Strategie, die verwendet werden, um die Effizienz zu steigern Zuschlags werden (siehe Mysore et al. 20 für weitere Details).
Abbildung 4. Chitosan / siRNA induzierte Knockdown von sema1a in den Entwicklungs olfaktorischen Systems von A. aegypti. QRT-PCR (A) und in situ-Hybridisierung (B, C) bestätigt Knockdown sema1a in Larven Assays speist eine Mischung sema1a Targeting siRNA 890 und siRNA 1198 Chitosan / interfering RNA Nanopartikel vs. Kontrolle Nanopartikel. Der Verlust der Sema1a Ausdruck führte Glomeruli, die verformt (E1-3 vs. D1-3) werden. Details siehe Text. Rücken ist in allen Panels. Maßstabsbalken = 25 um. Diese Zahl erschien ursprünglich in Mysore et al 20. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Larven | Puppen | |||||
siRNA | n | <strong> Wildtyp | AL Mängeln | n | Wildtyp- | AL Mängeln |
Steuerung | 69 | 69 (100%) | 0 (0%) | 68 | 68 (100%) | 0 (0%) |
sema1a KD | 77 | 42 (54,5%) | 35 (44%) * | 75 | 51 (68%) | 24 (32%) * |
Tabelle 1 Quantifizierung der Antennallobus Mängel folgenden sema1a Zuschlags. Eine kompilierte Zusammenfassung der Ergebnisse für die Steuerung erhalten siRNA gegen sema1a Zuschlags (KD) siRNA 890 + siRNA 1198 Chitosan-Nanopartikel gefütterten Tieren aus insgesamt acht Wiederholungsexperimenten sowohl Larven durchgeführt ( links) und Puppen (rechts) dargestellt. Die GesamtAnzahl von Personen beurteilt (n) und Nummern / Prozentsatz der Tiere mit Wildtyp-Morphologie vs. Antennallobus (AL) Mängel (Riechschleimhaut Zielfehler, fehlerhafte Neuropil und Glomeruli Bildung) werden angezeigt. Zuschlags immunhistochemisch mit Anti-Antikörper-Färbung Sema1a in einer Teilmenge der Tiere (15 Larven und Puppen 10), die die meisten schweren Defekten verifiziert angezeigt (bezeichnet mit einem *). Alle Zuschlags Tiere auf diese Weise bewertet wurden als Ebenen der Sema1a reduziert haben, während Sema1a Ebenen in Steuer gefütterten Tieren wurden nicht merklich verändert. Diese Tabelle erschien ursprünglich in Mysore et al 20.
In einer zweiten Untersuchung wurden 21, Chitosan / siRNA-Nanopartikel verwendet werden, um den Transkriptionsfaktor Zielstrebig (Sim) während der Entwicklung des olfaktorischen Systems zielen. qRT-PCR-Assays mit gepoolten Gehirne von ganzen Tieren seziert darauf hin, dass sim Zuschlags Gehirn im Durchschnitt eine 47% reducti hatteauf in-SIM-Transkripten im Vergleich zu Nanopartikeln gefütterten Tieren zu kontrollieren (p = 0,005, basierend auf gepaarten t-Test). Vergleichbare Assays mit Antennen ergab im Mittel eine Verringerung von 77% sim Ebenen bezogen auf die Kontrolle-gefütterten Tieren (P = 0.002 auf Basis des gepaarten t-Test). Trotz einiger Schwankungen in der Höhe der Zuschlags zwischen Geweben und Tieren, sim-Transkripte wurden nicht durch in situ-Hybridisierung in ≈50% des Zuschlags tierischen Gehirnen / Antennen nach der Behandlung mit einem von zwei verschiedenen Zuschlags siRNAs (Abbildung 5B2, B3, C2 erkannt, C3 vs. B1, C1, Tabelle 2). In Hefe Verhaltenstests, in denen Personen, die Hefe angezogen wurden, eine Punktzahl von 1 vergeben, während Tiere, die nicht angezogen wurden, einen Wert von 0, Durchschnittswerte für sim sim waren 430 oder 718 Knockdown Tiere significantly niedriger als die der Kontroll gefütterten Tieren in zwei Wiederholungsexperimenten (5A; P <0,001 basierend auf gepaarten t-Test). Defekten geruchsVerfolgungsVerhalten (5A) mit verringerten Gehalten von sim in den Antennen (Abbildung 5B2, B3 vs. B1) und Gehirn (Fig 5C2 korreliert, C3 vs. C1, gelbe Punkte markieren den Perimeter des Antennenkeule; siehe Tabelle 2 zur Quantifizierung der Ergebnisse). Multiple Defekte wurden in den Antennen und Antennalloben von sim Zuschlags Tiere identifiziert (siehe Mysore et al 21 für weitere Einzelheiten.). Zum Beispiel sim Zuschlags Larven und Puppen fehlten Ausdruck orco, die obligate Co-Rezeptor für alle Geruchsrezeptoren in olfaktorischen Rezeptorneuronen (Abbildung 6). Reduzierte orco Transkript-Spiegel wurden bei Personen mit sim 430 (zugeführt erkannt Abbildung 6A3, B3) oder SIM-718 (Abbildung 6A4, B4) Zuschlags (KD) Chitosan / siRNA-Nanopartikel (im Vergleich zu Wildtyp-Tiere in Abbildung 6A1, B1 und Kontrolle Chitosan / siRNA-Nanopartikel gefütterten Tieren in Abbildung 6A2, B2). Der Verlust von orco Expressionsphänotyp in L4-Larven (Abbildung 6A1-A4) beobachtet blieb über mindestens 24 Stunden nach der Puppenbildung (Abbildung 6B1-B4).
Abbildung 5. SIM-Knockdown Larven zeigen defekte Geruchs Lockstoff Verhalten. In-situ-Hybridisierung zeigte reduzierte Mengen an SIM-RNA in den Antennen (B2, B3) und Gehirn (C2, C3) der sim sim 430 und 718. Zuschlags Tieren (im Vergleich zu in B1 steuern ernährt, C1), die mit Hefe Riechstoff Lockstoff (A) nicht ansprachen. Details siehe Text. Die proximalen Enden der Antennen aufwärts in B1-B3 orientiert. Rücken nach oben in C1-C3 orientiert. Maßstabsbalken = 25 um. Diese Zahl erschien ursprünglich in Mysore et al 21. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Abbildung 6. Der Verlust der orco Ausdruck in der Entwicklung A. aegypti Antenne nach Knockdown von sim. Geringere Mengen orco Transkript wurden bei Personen fe erkanntd mit sim 430 (A3, B3) oder SIM-718 (A4, B4) Zuschlags (KD) Chitosan / siRNA-Nanopartikel (im Vergleich zu Wildtyp-Tiere in A1, B1 und Kontrolle Chitosan / siRNA-Nanopartikel gefütterten Tieren in A2, B2). Details siehe Text. Maßstabsbalken = 25 um. Diese Zahl wurde von Bilder in Mysore et al 21 veröffentlicht zusammengestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Angezogen | Nicht Zogen | ||||||||
siRNA | n | # Tiere | Normal | Mäßig | Nichtig | # Tiere | Normal | Mäßig | Nichtig |
Steuerung | 195 | 196 (100%) | 196 (100%) | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
sim 430 KD | 176 | 63 (35%) | 48 (76%) | 15 (24%) | 0 | 113 (64%) | 20 (18%) | 12 (11%) | 81 (71%) |
sim 718 KD | 177 | 66 (37%) | 44 (66%) | 22 (34%) | 0 | 111 (63%) | 20 (18%) | 9 (8%) | 82 (74%) |
Tabelle 2. Stufes von sim korrelieren mit Larven Leistung in einem Hefe-Verhaltenstest. Ein zusammengestellt Zusammenfassung der Ergebnisse in vier Hefe-Duftstoff Lockstoff erhalten replizieren Experimente gezeigt. Die Gesamtzahl der Tiere (n) gibt die Anzahl der Larven, die einzelnen in dieser Verhaltensassays getestet wurden. Die Anzahl der einzelnen Larven (# Tiere), die angezogen wurden (links; Tiere, die Hefepellet berührt und wurden eine Punktzahl von 1 vergeben) oder nicht angezogen (rechts; Tiere, die die Hefe-Pellet nicht berührt haben und erhielt eine Punktzahl von 0) unter jeder Bedingung (Control, sim 430 KD oder sim 718 KD Chitosan / siRNA-Nanopartikel-fed) angezeigt, und die Prozentsätze der Gesamt Tiere werden nach den reinen Zahlen enthalten. Knockdown von sim wurde durch in situ-Hybridisierung im Gehirn beurteilt und Antennen von Tieren zogen (links) oder nicht angezogen (rechts) in die Hefe. Dieraw Anzahl / Anteil der Personen mit Normal (vergleichbar mit sim Transkriptniveaus Wildtyp), Null (keine beobachtbare sim Transkript) oder Mittel (reduziert, aber nicht Wildtyp) sim Ebenen angezeigt. Der Verlust der SIM korreliert auch mit einem Mangel an Anziehungskraft auf der Hefe. Diese Tabelle erschien ursprünglich in Mysore et al 21.
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Discussion
Das Chitosan / interfering RNA Nanopartikel hierin beschriebenen Methodik wurde verwendet, um Gene während Larvenentwicklung in A. zielgerichteter gambiae (2, 3) und A. aegypti (Figuren 4, 5, 6, Tabelle 1, 2). Chitosan-Nanopartikeln kann entweder mit langen dsRNA oder siRNA, die beide erfolgreich in Moskitos verwendet worden, wie durch die hierin beschriebenen repräsentativen Ergebnisse zeigten weiterhin hergestellt werden. Synthese der dsRNA ist weniger teuer als der Kauf von siRNA, ist aber arbeitsintensiv. Wenn Chitosan / siRNA verwendet wird, kann Phänotypen mit mehreren siRNAs bestätigt werden, was eine bessere Garantie dafür, dass der Phänotyp aufgedeckt ist nicht auf Off-Site-Targeting. Auch kann die kommerzielle Produktion von siRNAs in Massen besser zu erleichtern Ausbau der Chitosan / interfering RNA-Silencing für artspezifische Moskito-Kontrolle auf dem Feld. Überwindung Dies wird natürlich erfordern obstazeuge wie Kosten und Lieferung.
Obwohl wir viel Erfolg mit diesem Protokoll genossen, müssen Methoden für jedes Gen optimiert werden. Aus diesem Grund empfehlen wir, Testen mehrerer siRNAs oder vielleicht einer siRNA und einen langen dsRNA, zu Beginn eines neuen Projektes. Sobald Phänotypen werden identifiziert und mit mindestens zwei verschiedenen siRNAs, die einem Gen von Interesse bestätigt, kann es sinnvoll sein, diese siRNAs Phänotyp Penetranz erhöhen (Figur 4) zu kombinieren. Das Timing und die Dauer der Chitosan / interfering RNA Fütterungsdauer für jede Studie optimiert werden. A. gambiae gedeihen, wenn nur mit Chitosan gespeist / interfering RNA Lebensmitteln wie hierin beschrieben. In den Experimenten, die wir bisher, A. geführt aegypti nicht gut ohne Nahrungsergänzung erging, ein Problem, das wir haben, indem sie auf eine Diät von normalen Lebensmitteln nach 4 h von Chitosan / interfering RNA Fütterung zu überwinden. Das Experimentieren mit Chitosan / störenRNA Lieferung in einer anderen Lebensmittelsubstrat, das wir noch nicht versucht haben, kann dieses Problem zu umgehen. Wir haben festgestellt, daß 4 h Fütterungszeiten im Verlauf von mehreren Tagen für ein gutes Gleichgewicht zwischen Wirkung und eine angemessene Ernährung, aber eine Veränderung der Dauer der Zuführung könnte beliebig weiterverfolgt werden. Auch kann das Larvenstadium, in dem Chitosan / interfering RNA Nanopartikelzufuhr initiiert / Fortsetzung ist für jedes Experiment in Abhängigkeit von der kritischen Entwicklungsperiode, in der Gen-Funktion wird untersucht, ein großer Vorteil dieses Protokoll zugeschnitten werden.
Überprüfung der Zuschlags ist natürlich kritisch, sondern kann auch zur Fehlerbehebung erforderlich. Aus diesem Grund kann es sinnvoll sein, gleichzeitig zu prüfen, ob Phänotypen von Interesse generiert werden als Zuschlags Effizienz geprüft. Für qRT-PCR Validierungsexperimente ist es kritisch, dass Primer und PCR-Bedingungen optimiert werden. Darüber hinaus ist es wichtig, daß Tiere entwicklungszu Beginn des Experiments synchronisiert, da die Expression von einigen Transkripten kann sehr dynamisch während der Entwicklung und wegen der zirkadianen Rhythmen 29 sein. Hinzu kommt, dass diese Technik erzeugt Zuschlags deutlich über den Darm, wir sind erst am Anfang, um das Gewebe, für die diese Technik effektiv zu bewerten und diese bei den einzelnen Spezies variieren. Es ist daher sinnvoll, Zuschlag in bestimmten Geweben, die durch Sezieren Geweben von Interesse aus ganzen Tieren zu qRT-PCR-Assays oder durch in situ-Hybridisierung erreicht werden kann (Figuren 4-6) 20,21 und Immunhistochemie (Abbildung 4) 20 zu messen, Tests (siehe Haugen et al. 27 und Clemons et al. 28, jeweils für Problembehandlung dieser Protokolle). Seit Zuschlags variiert von Person zu Person, ist es hilfreich, Doppelmarkierungs Tests durchführen, um Phänotypen in Kombination mit Zuschlags Ebenen zu bewerten (FiguRe 4) 20, die Phänotypcharakterisierung erleichtert. Für Verhaltensstudien können Zuschlags Ebenen in einzelne Tiere mit ihren Verhaltensleistungen (Tabelle 2) 20,21 korreliert werden.
Im Anschluss an Chitosan-vermittelte interfering RNA Lieferung an A. aegypti-Larven, verringert Genexpression bei 24 h Puppenentwicklung (Figuren 4, 6) 20,21 detektiert. Obwohl Genexpressionsniveaus noch nicht in einer detaillierten Weise über diesen Punkt der Entwicklung bewertet wurden, wurden reduziert Genexpressionsniveaus in beiden 48 und 72 h A. nachgewiesen aegypti Puppen (KM, unveröffentlicht). Es wäre sinnvoll, um detailliertere Analysen der Zuschlagsstufen in mehreren Stufen von A. verfolgen aegypti Puppenentwicklung und auch A. beurteilen gambiae Puppen. Es wäre auch interessant, festzustellen, ob Zuschlags besteht bei Erwachsenen und zu entdecken in Nanopartikel-vermittelteterfering RNA Lieferstrategien für erwachsene Moskitos.
Die ortsspezifische Nuklease Gen-Targeting-Ansätze wurden kürzlich eingeführt A. aegypti und A. gambiae und erlaubt die Erzeugung von gezielten, vererbbare Mutationen in Mücken und andere nicht-genetische Modellorganismen 30,31. Obwohl die Verwendung von verschiedenen Ansätze gleichförmigere Funktionsverlust-Phänotyp-Analysen, ist ein Vorteil gegenüber RNAi Ansätze Screening auf Mutationen von Interesse noch recht zeitraubend und arbeitsintensiv. Obwohl RNAi Funktionsverlust Studien erfordern Wartung der nur Wildtypstämme, Mutanten Mückenstämme einzeln aufgezogen werden. Die Aufrechterhaltung der rezessive tödliche oder Erwachsener sterilen Mutationen gegenwärtig herausfordernden angesichts der aktuellen Mangel an gekennzeichneten Balancer in Mücken. Während also ortsspezifische Nuklease Gen-Targeting-Ansätze sind schnell an Popularität gewinnt, Chitosan / interfering RNA Targeting kann die optimale seinWahl für Labore nicht ausgerüstet, um Mückenstämme zu erhalten und in den Fällen, für die Verlust der Genfunktion während der Entwicklung ist mit dem Überleben des Stammes nicht vereinbar.
Basierend auf unseren Erkenntnissen erwarten wir, dass Chitosan / interfering RNA lassen sich grob für Knockdown von vielen verschiedenen Genen während der Entwicklung von A. verwendet werden gambiae, A. aegypti, wie auch andere Insekten, und möglicherweise anderen nicht-genetische Modellorganismen. Erfolgreiche gene silencing mit Chitosan / interfering RNA wurde in anderen Arthropoden-Arten, einschließlich Penaeus monodon (Garnelen) 32 berichtet. Eine kürzlich durchgeführte Studie zeigte, dass Nanopartikel, die Aufnahme der dsRNA und damit zur Verbesserung der Zuschlagseffizienz im Vergleich zu direkten Verfütterung von dsRNA in der asiatischen cornborer 33, die das Potenzial für diese Technologie, um landwirtschaftliche Schädlinge gezielt unterstreicht. Der mögliche Einsatz von siRNA-Nanopartikel als Therapeutika bei Menschen zieht viel of Interesse in der medizinischen Gemeinschaft. Giljohann et al. 34 beschrieben die Synthese und Charakterisierung von mehrwertigen RNA-Gold-Nanopartikel-Konjugate, die eine sechsfach längere Halbwertszeit im Vergleich muss dsRNA zu befreien und in die Zellen leicht. Davis et al. 35 beschrieben, die ersten menschlichen klinischen Studie mit systemischer Gabe von siRNAs mit einer Nanopartikel-Liefersystem, um Patienten mit soliden Tumoren, und die Möglichkeit, mit Chitosan / siRNA-Therapeutika wurde vor kurzem überprüft 36. So / interfering RNA Gen-Targeting-Technologie ist Chitosan ein wertvoller Labortechnik mit Potenzial für breitere Anwendungen. Zukünftige Forschung wird weitere Anwendungen für diese Technik zu erkunden. Außerdem chemische Modifizierung von Chitosan und andere Polymere, ein aktiver Forschungsbereich, kann die Effizienz der interferierenden RNA Liefer erhöhen oder ermöglichen die gezielte Abgabe an spezifische Gewebe 37.
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Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.02 ml pipetteman | Rainin | PR20 | for resuspension of interfering RNA |
0.2 ml pipetteman | Rainin | PR200 | for resuspension of interfering RNA and preparation of interfering RNA/nanoparticles |
0.5 ml graduated tube | Fischer Scientific | 05-408-120 | for aliquoting resuspended interfering RNA |
1 ml pipetteman | Rainin | PR1000 | for resuspension of interfering RNA and preparation of interfering RNA/nanoparticles |
1.5 ml graduated tube | Fischer Scientific | 05-408-046 | for preparation of interfering RNA/nanoparticles |
1M Sodium Acetate, pH 4.5 | TEKnova | S0299 | to prepare sodium acetate buffer |
Acetic Acid, AIRSTAR. ACS, USP, FCC Grade | BDH | VWR BDH3092-500MLP | to prepare sodium acetate buffer |
Agarose Genetic Technology Grade | MP Biomedicals LLC. | 800668 | to coat prepared interfering RNA/nanoparticles |
Centrifuge | Eppendorf AG | 5415D | to pellet interfering RNA/nanoparticles |
Chitosan, from shrimp shells | Sigma-Aldrich | C3646-25G | to combine with interfering RNA for prepararation of interfering RNA/nanoparticles |
Dry Yeast | Universal Food Corp | NA | to prepare mosquito larval food with interfering RNA/nanoparticles |
E-RNAi tool | German Cancer Research Center | NA | for design of dsRNA; http://www.dkfz.de/signaling/e-rnai3// |
goldfish food | Wardley | Goldfish FLAKE FOOD | to prepare mosquito larval food with interfering RNA/nanoparticles |
Heated water bath | Thermo Scientific | 51221048 | to heat the interfering RNA/nanoparticles at 55oC |
Ice | not applicable | not applicable | for thawing interfering RNA and preparation of interfering RNA/nanoparticles |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Ice bucket | Fisher Scientific | 02-591-44 | for storage of ice used during the procedure |
liver powder | MP Biomedicals LLC. | 900396 | to feed mosquito larvae post interfering RNA/nanoparticle treatment |
Microwave oven | A variety of vendors | not applicable | to prepare 2% agarose solution |
petridish (100 x 15 mm) | Fischer Scientific | 875713 | interfering RNA/nanoparticle feeding chamber for larvae |
pH meter | Mettler Toledo | S220 | for preparation of buffers |
Razor blade | Fischer Scientific | 12-640 | to divide the interfering RNA/nanoparticle pellet for feedings |
siRNA | Thermo Scientific/Dharmacon | custom | for preparation of siRNA/nanoparticles |
Sodium Sulfate, Anhydrous (Na2SO4) | BDH/distributed by VWR | VWR BDH0302-500G | to prepare 50 mM sodium sulfate solution in which the interfering RNA will be resuspended |
Thermometer | VWR | 61066-046 | to measure the water bath temperature |
Tooth picks | VWR | 470146-908 | for stirring during interfering RNA/nanoparticle food preparation and cutting gel pellets |
Ultralow freezer | A variety of vendors | not applicable | for storage of interfering RNA aliquots and interfering RNA/nanoparticles at -80oC |
Vortex mixer | Fischer Scientific | 02-216-108 | for preparation of chitosan/interfering RNA |
Weight paper | Fischer Scientific | NC9798735 | to divide the interfering RNA/nanoparticle pellet for feedings |
References
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